Macierz mikronapędów do chronicznych pomiarów in vivo: montaż tetrod

Podsumowanie

W niniejszym protokole demonstrujemy sposób wykonania i kondycjonowania tetrod do zastosowania w macierzy mikro-napędów, która została zaprojektowana do chronicznych rejestracji elektrofizjologicznych u szczurów. Dodatkowo przedstawiamy końcowe etapy konstrukcji macierzy mikro-napędów, obejmujące instalację przewodów uziemiających oraz stożka ochronnego.

Streszczenie

Tetroda, będąca wiązką czterech elektrod, okazała się cennym narzędziem do jednoczesnej rejestracji aktywności wielu neuronów in vivo. Różnica w amplitudzie sygnatur potencjałów czynnościowych w poszczególnych kanałach tetrody pozwala na wyodrębnienie aktywności pojedynczych jednostek z sygnałów wielojednostkowych. Możliwość precyzyjnej kontroli stereotaktycznego położenia i głębokości wprowadzenia tetrody jest kluczowa dla badania skoordynowanej aktywności neuronalnej w różnych obszarach mózgu. Dzięki zastosowaniu macierzy mikronapędów możliwe jest osiągnięcie precyzyjnego rozmieszczenia i stabilnej kontroli wielu tetrod w okresie od kilku dni do kilku tygodni. W niniejszym protokole demonstrujemy, jak wykonać i przygotować tetrody przy użyciu podstawowych narzędzi i materiałów, zainstalować tetrody w macierzy mikronapędów do chronicznej rejestracji in vivo u szczura, wykonać połączenia przewodów uziemiających z macierzą mikronapędów oraz zamocować stożek ochronny na macierzy mikronapędów w celu zabezpieczenia tetrod przed kontaktem fizycznym z otoczeniem.

Protokół

1. Wykonanie tetrod

1. Rozpocznij konstrukcję jednej tetrody, pobierając drut niklowo-chromowy o średnicy rdzenia 12,5 mikrona, izolowany polimidem, o długości 50 cm. Zegnij drut na pół. Przesuń palcami wzdłuż pary drutów, aby przylegały do siebie. Upewnij się, że para drutów ma dobry kontakt na całej swojej długości.
2. Zegnij parę ponownie, trzymając oba końce razem. Upewnij się, że pętla utworzona na jednym końcu nie jest skręcona. Odetnij cztery druty na końcu bez pętli w taki sposób, aby cztery końcówki były wyrównane.
3. W następnym kroku będą potrzebne zmodyfikowany chwytak typu „krokodylek”, zmotoryzowane urządzenie obrotowe oraz pozioma belka nad urządzeniem obrotowym. Chwytak typu „krokodylek” zostaje zmodyfikowany poprzez przyklejenie plastikowego pręta do jego podstawy. W miejscu, gdzie końcówki drutów są odsłonięte, zaciśnij cztery druty razem za pomocą zmodyfikowanego chwytaka. Zawieś pętlę drutów na poziomej belce. Umieść chwytak w zmotoryzowanym stole.
4. Wykonaj 80 skrętów zgodnie z ruchem wskazówek zegara, a następnie 40 skrętów przeciwnie do ruchu wskazówek zegara w wiązce drutów w czasie około trzech minut. Parametry te można zmieniać w zależności od potrzeb.
5. Po zakończeniu skręcania tetrody stop druty ze sobą, ogrzewając je z trzech różnych kątów za pomocą opalarki (420° C lub 790° F), stosując średnio-niski przepływ powietrza. Dla każdego kąta zacznij 1-2 cm poniżej miejsca, w którym wiązka drutów się rozdziela, prowadząc opalarkę w dół i w górę w odległości 2 cm od drutów przez około 5 sekund. Zachowaj ostrożność, ponieważ wysokie temperatury całkowicie stopią izolację i doprowadzą do zwarć.
6. Teraz, gdy druty zostały ze sobą stopione, wyjmij tetrodę z urządzenia do skręcania, delikatnie podnosząc chwytak, aby zmniejszyć napięcie tetrody, i przetnij tetrodę w pobliżu chwytaka. Na drugim końcu przetnij pętlę tak, aby pozostały cztery niespojone pasma drutu o tej samej długości.
7. Następnie rozdziel poszczególne pasma na górze, delikatnie wyginając druty pęsetą z miękkimi końcówkami.
8. Tetroda jest teraz gotowa do umieszczenia w matrycy mikro-napędów. Wykonaj od 21 do 25 kolejnych tetrod i przechowuj je w pojemniku wolnym od kurzu do czasu rozpoczęcia procesu ładowania tetrod.

2. Umieszczanie tetrod i przewodów uziemiających w matrycy mikrowyciskacza

1. Aby kontynuować, niezbędny jest kompletny zestaw mikro-napędów. Jeśli jeszcze go nie zbudowano, należy zapoznać się z filmem „Micro-drive array for chronic in-vivo recording: drive fabrication”. W naszym planie konstrukcyjnym tetroda zostanie przymocowana jednym końcem do sprzętu łączącego i zostanie przeprowadzona przez polimidową rurkę nośną w mikro-napędzie w taki sposób, aby końcówki elektrod wystawały poniżej podstawy zestawu mikro-napędów.
2. Przed rozpoczęciem należy przygotować uchwyt napędu, który jednym końcem można przymocować do płytki łączącej, a drugim zacisnąć w imadle Panavise. W tym przykładzie uchwyt napędu stanowi złącze Mill-Max przyklejone do jednego końca rękojeści noża X-ACTO (Rysunek 1c).
3. Trzymając tetrodę pęsetą z miękkimi końcówkami i korzystając ze stereoskopu, należy wsunąć końcówkę tetrody do polimidowej rurki nośnej w jednym z mikro-napędów. Wsuwaj tetrodę do rurki, aż poszczególne przewody elektrod znajdą się blisko płytki łączącej na górze zestawu napędów. Należy uważać, aby nie zagiąć ani nie skręcić przewodów, ponieważ spowoduje to wejście tetrody do mózgu pod kątem, a nie prostopadle, oraz osłabi integralność tetrody.
4. Przy pomocy pęsety z miękkimi końcówkami delikatnie wprowadź drugi koniec czterech przewodów do odpowiadających im otworów w płytce interfejsu elektrod. Ponownie należy unikać zagięć lub skręcania przewodów. Po umieszczeniu wszystkich czterech przewodów, wciśnij złote piny w otwory za pomocą szczypiec z obciętą dolną szczęką. Wciśnięcie pinów w otwory spowoduje zdjęcie izolacji z przewodów i utworzenie połączenia elektrycznego.
5. W celu późniejszego odniesienia należy prowadzić ewidencję mapowania mikro-napędów i pozycji pinów na płytce interfejsu elektrod.
6. Kontynuuj ładowanie łącznie 18 tetrod. Trzy pozostałe mikro-napędy w zestawie posłużą do umieszczenia elektrod referencyjnych. Każda elektroda referencyjna jest wykonana z tetrody, w której wykorzystuje się tylko jeden z czterech niepołączonych końców przewodów. Aby przymocować elektrody referencyjne, postępuj zgodnie z procedurą ładowania, ale przymocuj tylko jedną z czterech elektrod do odpowiedniego pinu elektrody referencyjnej na płytce łączącej.
7. W przypadku planowania rejestracji z wielu miejsc warto wcześniej zaplanować połączenia tetrod z płytką łączącą. Pozwoli to zminimalizować ryzyko regulacji niewłaściwej tetrody podczas eksperymentów.
8. Po zakończeniu ładowania tetrod należy przygotować dwa przewody uziemiające: jeden dla zwierzęcia i jeden dla stożka ochronnego. Odetnij kawałek izolowanego stalowego drutu o długości 6' (średnica: 0.005') i za pomocą metalowej pęsety usuń 3 mm izolacji z każdego końcówki drutu. Następnie odetnij izolowany stalowy drut o długości 4' (średnica: 0.005'). Usuń 3 mm izolacji z jednego końca i 1 cm z drugiego końca.
9. Przeciągnij 6-stopowy przewód uziemiający przez otwór z boku zestawu mikro-napędów w górę, w stronę płytki interfejsu. Połącz odsłonięty drut z płytką interfejsu elektrod za pomocą złotego pinu w wyznaczonym otworze uziemiającym. Ten przewód zostanie połączony z czaszką zwierzęcia.
10. Przeciągnij 4-stopowy przewód uziemiający równolegle do wcześniej zainstalowanego przewodu uziemiającego. Połącz koniec z odizolowanym fragmentem 3 mm z płytką interfejsu elektrod, używając złotego pinu w innym wyznaczonym otworze uziemiającym. Przewód ten zostanie później podłączony do stożka ochronnego, który będzie pełnił funkcję niewielkiej klatki Faradaya w celu redukcji zakłóceń. Połączenia przewodów zostały zakończone i można przejść do doprecyzowania tetrod.

3. Ustawianie długości tetrod

1. Celem tego procesu jest przycięcie wszystkich tetrod tak, aby były nieco dłuższe niż głębokość docelowej struktury mózgu. W naszym przykładzie mikronapędy są zaprojektowane dla maksymalnego zakresu ruchu 5-6 mm, co jest wystarczające do dotarcia do wielu obszarów neocortex oraz grzbietowego hipokampa dorosłego szczura. Najpierw opuść wszystkie mikronapędy, aby tetrody były maksymalnie odsłonięte. Następnie, używając pary ostrych, precyzyjnych nożyczek, przytnij jednocześnie wszystkie tetrody do długości o około 5 mm większej niż pożądana długość końcowa.
2. Do końcowego cięcia przygotuj parę ząbkowanych nożyczek zamocowanych w imadle Panavise. Zaciśnij jeden uchwyt pod lekkim kątem w dół, tak aby ząbki były skierowane do góry, pozostawiając drugi uchwyt swobodnie zwisający.
3. Teraz całkowicie wycofaj wszystkie tetrody do kaniul prowadzących, przekręcając mikronapędy w górę.
4. Używając stereomikroskopu, całkowicie wysuń jedną tetrodę z kaniuli. Za pomocą linijki ustaw ząbkowane nożyczki w pożądanej odległości od kaniuli prowadzącej. Powolnym i delikatnym, płynnym ruchem przetnij tetrodę. Po przecięciu danej tetrody wycofaj mikronapęd w górę o 3-4 mm. Powtórz ten proces dla każdej tetrody, aż wszystkie zostaną przycięte. W tym momencie można przystąpić do pozłacania.

4. Pozłacanie tetrod i kontrola jakości

Pozłacanie drutów nichromowych tetrody jest kluczowe dla uzyskania stabilnych zapisów w długim terminie. Zapobiega ono korozji i poprawia biozgodność.

1. Ustaw miernik impedancji w trybie zewnętrznym (external mode), a generator prądu w trybie sprawdzania DC (DC check mode) z wyjściem audio (Rysunek 1d). Dotknij końcówkami przewodów generatora prądu sześciu możliwych par kanałów w obrębie każdej tetrody i wykorzystaj sygnał audio do sprawdzenia, czy występują zwarcia między parami. Jeśli występuje zwarcie, ponownie utnij końcówkę tetrody nożyczkami ząbkowanymi i powtórz test. Jeśli problem nadal występuje, odrzuć tetrodę i zastąp ją nową.
2. Gdy w żadnej z tetrod nie wystąpią zwarcia, przesuń wszystkie mikronapędy w dół, wysuwając wszystkie tetrody tak daleko, jak to możliwe.
3. Zmodyfikuj konfigurację sprzętu w celu sprawdzenia impedancji elektrod (Rysunek 1e). Następnie zanurz końcówki wszystkich tetrod w kąpieli ze standardowym roztworem do pozłacania. Kąpiel złota jest połączona elektrycznie z dodatnim przewodem miernika impedancji. Sprawdź impedancję elektrody, dotykając ujemnym przewodem miernika impedancji odpowiedniego pinu na płytce złącza.
4. Zmień i zapisz impedancję każdego przewodu w macierzy mikronapędów. Normalne wartości mieszczą się w zakresie 1-3 MOhm.
5. W generatorze prądu ustaw natężenie prądu w zakresie 1-3 μA. Następnie bezpiecznie przymocuj ujemny przewód miernika impedancji do pinu na płytce złącza. Przestaw sprzęt w konfigurację do galwanizacji (Rysunek 1f). W mierniku impedancji szybko przełącz tryb z normalnego (normal mode) na tryb pominięcia (bypass mode) i z powrotem. W trybie bypass prąd przepłynie przez tetrodę i roztwór złota, a na końcówce elektrody zostanie osadzone złoto. Impedancja po każdym cyklu pozłacania powinna być niższa niż wcześniej. Powtórz impuls prądowy, jeśli impedancja nie spadła poniżej 1 MOhm. Konserwatywny zakres dopuszczalnych impedancji wynosi od 250 kOhm do 350 kOhm. Jeśli impedancja spadnie poniżej 200 kOhm, może to wskazywać na zwarcie.
6. Jeśli po wielokrotnych impulsach impedancja nie spadnie wystarczająco, końcówka elektrody może być zablokowana. Ponownie utnij końcówkę tetrody, sprawdź czy nie ma zwarć i powtórz proces pozłacania. Jeśli ponowne cięcie nie pomoże, wymień tetrodę i zacznij od początku.
7. Po pozłaceniu wszystkich tetrod krótko zanurz ich końcówki w etanolu i pozostaw do wyschnięcia na 3 do 5 minut.
8. Sprawdź obecność zwarć w tetrodach za pomocą generatora prądu, gdy końcówki tetrod są wystawione na działanie powietrza. Jeśli między dwiema lub więcej elektrodami tetrody istnieje połączenie DC, ponownie utnij końcówkę tetrody i ponownie ją pozłoć.
9. Po zakończeniu pozłacania wszystkich tetrod nanieś kroplę średniolepkiego kleju cyjanoakrylowego na styk między każdą tetrodą a jej rurką polimidową. Zabezpieczy to tetrodę w mikronapędzie i utrzyma jej długość.
10. W ostatnim kroku wprowadź wszystkie tetrody do napędów, dokręcając wszystkie śruby do góry.

5. Mocowanie stożka ochronnego

Celem ochronnego stożka jest zabezpieczenie mikroelektrod oraz odsłoniętego drutu tetrody przed wpływem środowiska. Zapewnia on również podparcie podczas manipulacji w trakcie eksperymentu i redukuje szumy elektryczne. Stosujemy plastikowy stożek wydrukowany w technologii 3D (Patrz część I: wykonanie elektrod). Możliwe jest jednak wykonanie stożka z innych materiałów, na przykład z wygiętego kawałka puszki po napoju.

1. Weź plastikowy stożek i przymocuj taśmę z folii aluminiowej do jego wewnętrznej lub zewnętrznej powierzchni.
2. Następnie wywierć mały otwór (o średnicy 1,5 mm) w stożku i luźno zamocuj śrubę z podkładką i nakrętką wewnątrz stożka. Będzie ona służyć jako przejście elektryczne dla przewodu uziemiającego. Zalecamy użycie zestawu śruby i podkładki w rozmiarze 0-80.
3. Najpierw wkręć i częściowo zakręć trzy śruby o rozmiarze 1-72 (o długości 3/16 cala) w boki stożka. Przy zawieszonej macierzy elektrod wsuń stożek na napęd. Upewnij się, że oba przewody uziemiające wystają z dołu macierzy elektrod. Owiń odsłoniętą część 4-stopowego przewodu uziemiającego kilka razy wokół jednej ze śrub 1-72 i mocno dokręć śrubę. Przymocuj stożek do podstawy napędu, dokręcając pozostałe dwie śruby stożka.
4. Na koniec weź odizolowany koniec (1 cm) krótkiego przewodu uziemiającego i owiń go wokół śruby, pomiędzy taśmą z folii a podkładką. Zabezpiecz uziemienie, dokręcając śrubę. W ten sposób otrzymaliśmy macierz mikroelektrod, która jest już gotowa do implantacji chirurgicznej.

6. Reprezentatywne wyniki

1. Produkcja macierzy mikronapędów została zakończona. Twoja macierz mikronapędów jest wyposażona w 18 tetrod i 3 kanały referencyjne. Dla zapewnienia trwałości została ona zamknięta w ochronnym stożku i nasadce. Gotowa macierz mikronapędów wraz z ochronnym stożkiem waży średnio od 20g do 25g.
2. Gotową macierz napędów implantuje się zgodnie ze standardową procedurą chirurgiczną. Jak widać, napęd jest połączony z układem przedwzmacniacza i wiązką przewodów, które przesyłają sygnał do sprzętu i oprogramowania do akwizycji danych.

Rysunek 1: A) Schemat konfiguracji skręcania tetrody. Pozioma belka zawiesza niespojone przewody elektrod tetrody nad automatycznym urządzeniem do skręcania tetrod. B) Układ do pomiaru impedancji tetrody i powlekania elektrod. Podczas sprawdzania zwarć obwód jest inny: czarny przewód jest przyłączony do innego kanału elektrod na płytce złączy. C) Zbliżenie na wykonany na zamówienie uchwyt do matrycy mikronapędu. Cylindryczny pręt to rękojeść noża X-Acto. Złącze to 26-pinowy, dwurzędowy konektor Mill-max. Oba elementy są ze sobą spojone akrylem stomatologicznym. D) Konfiguracja do sprawdzania zwarć. Kanał X i Kanał Y to dwa dowolne, różne kanały z czterech kanałów tetrody. E) Konfiguracja do pomiaru impedancji elektrod. Źródło prądu jest wyłączone ('off'). Omomierz jest ustawiony na 'on' i 'test'. F) Konfiguracja do pozłacania końcówek elektrod. Źródło prądu jest ustawione na 'on', audio na 'on', tryb na 'unipolar', DC Test na 'on', a prąd ustawiono na 2 microamps.

Dyskusja

Niniejszy protokół stanowi drugą część dwuodcinkowego opracowania: „Micro-drive array for chronic in-vivo recording”. Połączenie macierzy mikro-napędów z tetrodami jest potężnym narzędziem do jednoczesnej rejestracji aktywności wielu neuronów w preparacie zwierzęcia budzącego się i wykazującego określoną aktywność behawioralną. Mamy nadzieję, że dostarczone informacje okażą się wystarczające, aby umożliwić Państwu rozpoczęcie lub udoskonalenie rejestracji elektrofizjologicznych we własnym laboratorium.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Panavise	Narzędzie	Panavise	Model 301	Służy do mocowania macierzy mikronapędu lub nożyczek z ząbkowanym ostrzem
Zmodyfikowane szczypce Xcelite 378M	Narzędzie	Newark Inc	96F8903	Do wkładania pinów płytki łącznika. Aby je przygotować, należy usunąć 2mm z jednego z końców szczypiec.
Klej wolnotwardniejący	Materiał	Great Planes (Champaign, IL)	GPMR6015	Do przyklejenia tetrody do mikronapędu
Roztwór do pozłacania	Materiał	Neuralynx Inc.	Sifco Selectron Gold NC	Zawiera cząsteczki złota do galwanizacji
Generator prądu	Narzędzie	World Precision Instruments, Inc.	A365D-B	Znany jako izolator stymulatora. Służy do nakładania złota metodą galwaniczną na końcówki elektrod.
Miernik impedancji	Narzędzie	BAK Electronics	IMP-1 / 6662 / 2788	Do sprawdzania impedancji elektrod
Opalarka	Narzędzie	Steinel (Niemcy)	HG 3002 LCD	Do stapiania elektrod w celu utworzenia tetrody
Pinceta Accu-Tek z końcówkami Carbofib	Narzędzie	Aven	18768 (Pattern 304)	Do manipulowania tetrodami
Zacisk typu krokodylk	Narzędzie	Fine Science Tools	18050-35	Znany jako Bulldog serrefine. Służy do spinania tetrod podczas skręcania
Mikronóż do mikrodissekcji	Narzędzie	Biomedical Research Instruments	25-1000	Do ogólnego przycinania drutów tetrody/elektrody
Nożyczki Iris Toughcut z ząbkowanym ostrzem	Narzędzie	Fine Science Tools	14058-09	Do końcowego przycinania tetrod
Stalowy drut powlekany teflonem	Materiał	A-M Systems	790500	Przewód uziemiający
Drut nichromowy 12,5 micron	Materiał	Kanthal Palm Coast	Rediohm-800 1/4 HARD PAC COATING	Mikrodrut powlekany poliimidem do produkcji tetrod.
Skrętkownica do tetrod	Narzędzie	Neuralynx Inc.	Tetrode Assembly Station	Zwiększa szybkość i powtarzalność procesu wytwarzania tetrod.
Farba srebrna	Materiał	GC International	22-023	Do łączenia drutów mikroelektrod tetrody z pinami łącznika (patrz sekcja Dyskusja)
Rękojeść noża X-Acto	Materiał	MSC Direct	X3001	Do konstrukcji uchwytu mikronapędu.
Złącze 26-pinowe, 2-rzędowe	Materiał	Mill-Max	852-10-026-30-001000	Do konstrukcji uchwytu mikronapędu.