$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Wykonanie tetrod
- Rozpocznij konstrukcję jednej tetrody, przygotowując drut nikchromowy o średnicy rdzenia 12,5 mikrona, izolowany polimidem, o długości 50 cm. Złóż drut na pół. Przesuń palcami wzdłuż pary przewodów, aby przylegały do siebie. Upewnij się, że para przewodów ma dobry kontakt na całej swojej długości.
- Złóż parę ponownie, trzymając oba końce razem. Upewnij się, że pętla utworzona na jednym końcu nie jest załamana. Przetnij cztery druty na końcu bez pętli w taki sposób, aby cztery końcówki były wyrównane.
- W następnym kroku będą potrzebne zmodyfikowany żabkowy zacisk, zmotoryzowane urządzenie obrotowe oraz pozioma belka nad urządzeniem obrotowym. Zacisk żabkowy został zmodyfikowany poprzez przyklejenie plastikowej listwy do podstawy zacisku. W miejscu odsłoniętych końcówek drutów zaciśnij cztery przewody razem za pomocą zmodyfikowanego zacisku. Zawieś pętlę z drutów na poziomej belce. Umieść zacisk żabkowy w zmotoryzowanym stole.
- Wykonaj 80 skrętów zgodnie z ruchem wskazówek zegara, a następnie 40 skrętów przeciwnie do ruchu wskazówek zegara wiązki drutów w czasie około trzech minut. Parametry te można modyfikować w zależności od potrzeb.
- Po zakończeniu skręcania tetrody zlutuj druty ze sobą, podgrzewając je pod trzema różnymi kątami za pomocą opalarki (420° C lub 790° F), stosując średni-niski przepływ powietrza. Dla każdego kąta zacznij 1-2 cm poniżej miejsca, w którym wiązka drutów się rozdziela, i przesuń opalarkę w dół i w górę w odległości 2 cm od drutów przez około 5 sekund. Zachowaj ostrożność, ponieważ wysokie temperatury całkowicie stopią izolację i doprowadzą do zwarć.
- Gdy druty zostaną już połączone, wyjmij tetrodę z urządzenia do skręcania, delikatnie podnosząc zacisk żabkowy, aby zmniejszyć napięcie tetrody, a następnie przetnij tetrodę w pobliżu zacisku. Na drugim końcu przetnij pętlę tak, aby otrzymać cztery niepołączone pasma drutu o równej długości.
- Następnie rozdziel poszczególne pasma u góry, delikatnie wyginając druty pęsetą z miękkimi końcówkami.
- Tetroda jest teraz gotowa do zamontowania w matrycy mikroprzesuwu. Wykonaj od 21 do 25 kolejnych tetrod i przechowuj je w pudełku wolnym od kurzu do czasu rozpoczęcia procesu montażu tetrod.
2. Umieszczanie tetrod i przewodów uziemiających w macierzy mikro-napędu
- Aby kontynuować, niezbędny jest kompletny zestaw mikro-napędów. Jeśli nie został on jeszcze zbudowany, należy zapoznać się z filmem „Micro-drive array for chronic in-vivo recording: drive fabrication”. W naszym planie projektowym tetroda zostanie przymocowana jednym końcem do sprzętu łączącego i zostanie przeprowadzona przez polimidową rurkę nośną w mikro-napędzie w taki sposób, aby końcówki elektrod wystawały poniżej podstawy zestawu mikro-napędów.
- Przed rozpoczęciem należy zbudować uchwyt napędu, który jednym końcem można przymocować do płytki przyłączeniowej, a drugim zacisnąć w imadle typu panavise. W tym przykładzie uchwyt napędu stanowi złącze mill-max przyklejone do jednego końca rękojeści noża X-ACTO (Rysunek 1c).
- Trzymając tetrodę pęsetą z miękkimi końcówkami i korzystając ze stereomikroskopu, należy wsunąć końcówkę tetrody do polimidowej rurki nośnej jednego z mikro-napędów. Wsuń tetrodę do rurki, aż poszczególne przewody elektrod znajdą się blisko płytki przyłączeniowej na górze zestawu napędów. Należy uważać, aby nie załamać ani nie wygiąć przewodów, ponieważ spowoduje to wprowadzenie tetrody do mózgu pod kątem, a nie prostopadle, oraz osłabi jej integralność.
- Ostrożnie wprowadź drugi koniec czterech przewodów do odpowiednich otworów w płytce interfejsu elektrod, używając pęsety z miękkimi końcówkami. Ponownie należy unikać załamywania lub wyginania przewodów. Po umieszczeniu wszystkich czterech przewodów na miejscu, wciśnij złote piny w otwory za pomocą szczypiec z przyciętą dolną szczęką. Podczas wciskania pinów w otwór, zdadzą one izolację z przewodu i utworzą połączenie elektryczne.
- Na potrzeby późniejszych odniesień należy prowadzić zapis mapowania mikro-napędów i pozycji pinów na płytce interfejsu elektrod.
- Kontynuuj ładowanie, aż do uzyskania łącznie 18 tetrod. Trzy pozostałe mikro-napędy w zestawie zostaną wykorzystane do umieszczenia elektrod referencyjnych. Każda elektroda referencyjna jest wykonana z tetrody, w której wykorzystuje się tylko jeden z czterech niepołączonych końców przewodów. Aby przymocować elektrody referencyjne, należy postępować zgodnie z procedurą ładowania, ale przymocować tylko jedną z czterech elektrod do odpowiedniego pinu elektrody referencyjnej na płytce przyłączeniowej.
- W przypadku planowania rejestracji wielostrefowej warto wcześniej zaplanować połączenia od tetrod do płytki przyłączeniowej. Powinno to zminimalizować możliwość regulacji niewłaściwej tetrody podczas eksperymentów.
- Po zakończeniu ładowania tetrod należy przygotować dwa przewody uziemiające: jeden dla zwierzęcia i jeden dla stożka ochronnego. Odetnij kawałek izolowanego stalowego drutu o długości 6' (średnica: 0.005') i za pomocą metalowej pęsety usuń 3 mm izolacji z każdego końca drutu. Następnie odetnij izolowany stalowy drut o długości 4' (średnica: 0.005'). Usuń 3 mm izolacji na jednym końcu i 1 cm na drugim końcu.
- Poprowadź 6-stopowy przewód uziemiający przez otwór po boku zestawu mikro-napędów w górę, w stronę płytki interfejsu. Połącz odsłonięty drut z płytką interfejsu elektrod za pomocą złotego pinu w wyznaczonym otworze uziemienia. Ten przewód zostanie podłączony do czaszki zwierzęcia.
- Poprowadź 4-stopowy przewód uziemiający równolegle do wcześniej zainstalowanego przewodu uziemiającego. Połącz końcówkę z odizolowanymi 3 mm do płytki interfejsu elektrod, używając złotego pinu w innym wyznaczonym otworze uziemienia. Przewód ten zostanie później podłączony do stożka ochronnego, który będzie pełnić funkcję małej klatki Faradaya w celu ograniczenia wychwytywania szumów. Połączenia przewodów zostały zakończone i można przystąpić do doprecyzowania tetrod.
3. Ustawianie długości tetrod
- Celem tego procesu jest przycięcie wszystkich tetrod tak, aby były nieco dłuższe niż głębokość docelowej struktury mózgu. W naszym przykładzie mikronapędy są zaprojektowane dla maksymalnego wysuwu wynoszącego 5-6 mm, co jest wystarczające do dotarcia do wielu obszarów neokory oraz grzbietowej części hipokampa dorosłego szczura. Najpierw opuść wszystkie mikronapędy tak, aby tetrody były maksymalnie wystawione. Następnie przytnij wszystkie tetrody do długości o około 5 mm większej niż pożądana długość końcowa, używając pary ostrych, precyzyjnych nożyczek.
- Do końcowego cięcia przygotuj parę ząbkowanych nożyczek zamocowanych w imadle Panavise. Zaciśnij jeden uchwyt pod lekkim kątem w dół, tak aby ząbki były skierowane do góry, pozostawiając drugi uchwyt wolny.
- Teraz całkowicie wycofaj wszystkie tetrody do kaniul prowadzących, przekręcając mikronapędy w górę.
- Używając stereomikroskopu, w pełni wysuń jedną tetrodę z kaniuli. Za pomocą linijki ustaw ząbkowane nożyczki w pożądanej odległości od kaniuli prowadzącej. Powoli i ostrożnie przetnij tetrodę jednym płynnym ruchem. Po przecięciu tej tetrody wycofaj mikronapęd w górę o 3-4 mm. Powtarzaj ten proces dla każdej tetrody, aż wszystkie zostaną przecięte. Na tym etapie można przystąpić do pozłacania.
4. Pozłacanie tetrod i kontrola jakości
Pozłacanie drutów nichromowych tetrody jest kluczowe dla uzyskania stabilnych zapisów w długim terminie. Zapobiega ono korozji i poprawia biokompatybilność.
- Ustaw miernik impedancji w trybie zewnętrznym (external mode), a generator prądu w trybie sprawdzania DC (DC check mode) z wyjściem audio (Rysunek 1d). Dotknij dwiema przewodami generatora prądu sześciu możliwych par kanałów wewnątrz każdej tetrody i wykorzystaj sygnał audio do ustalenia, czy występują zwarcia między parami. Jeśli występuje zwarcie, ponownie przytnij tetrodę nożyczkami ząbkowanymi i przetestuj ją ponownie. Jeśli problem nie ustąpi, odrzuć tetrodę i wymień ją na nową.
- Gdy we wszystkich tetrodach nie będzie występować zwarć, przesuń wszystkie mikro-napędy w dół, wysuwając wszystkie tetrody tak daleko, jak to możliwe.
- Zmodyfikuj konfigurację sprzętu do sprawdzania impedancji elektrod (Rysunek 1e). Teraz zanurz końcówki wszystkich tetrod w kąpieli standardowego roztworu do złocenia. Kąpiel złota jest elektrycznie połączona z dodatnim przewodem miernika impedancji. Sprawdź impedancję elektrody, dotykając ujemnym przewodem miernika impedancji odpowiadającego pinu na płytce złączy.
- Zmierz i zarejestruj impedancję każdego przewodu w matrycy mikro-napędów. Normalne wartości mieszczą się w zakresie 1-3 MOhm.
- W generatorze prądu ustaw prąd w zakresie 1-3 μA. Następnie bezpiecznie przymocuj ujemny przewód miernika impedancji do pinu na płytce złączy. Przełącz sprzęt w konfigurację elektroplatingu (Rysunek 1f). W mierniku impedancji szybko przełącz z trybu normalnego (normal mode) na tryb pomijania (bypass mode) i z powrotem. W trybie bypass prąd przepłynie przez tetrodę i roztwór złota, a złoto zostanie naniesione na końcówkę elektrody. Impedancja po każdym cyklu złocenia powinna być niższa niż poprzednio. Powtórz impuls prądowy, jeśli impedancja nie spadła poniżej 1 MOhm. Konserwatywny zakres dopuszczalnych impedancji to od 250kOhm do 350 kOhm. Jeśli impedancja spadnie poniżej 200 kOhm, może to wskazywać na zwarcie.
- Jeśli po wielokrotnych impulsach impedancja nie spadnie wystarczająco, końcówka elektrody może być zablokowana. Ponownie przytnij tetrodę, sprawdź czy nie ma zwarć i powtórz proces złocenia. Jeśli ponowne przycięcie nie pomoże, wymień tetrodę i zacznij od początku.
- Po pozłaceniu wszystkich tetrod, zanurz krótko ich końcówki w etanolu i pozostaw do wyschnięcia na 3 do 5 minut.
- Przetestuj tetrody pod kątem zwarć, używając generatora prądu przy końcówkach tetrod wystawionych na powietrze. Jeśli istnieje połączenie DC między dwiema lub więcej elektrodami tetrody, ponownie przytnij tetrodę i ponownie ją pozłoć.
- Po zakończeniu złocenia wszystkich tetrod, nałóż kroplę średnio gęstego kleju cyjanoakrylowego na miejsce styku każdej tetrody z jej rurką polimidową. Zabezpieczy to tetrodę w mikro-napędzie i utrzyma jej długość.
- W ostatnim kroku wprowadź wszystkie tetrody do napędu, dokręcając wszystkie śruby.
5. Mocowanie stożka ochronnego
Celem stożka ochronnego jest osłona mikroprzewodów i odsłoniętego drutu tetrody przed wpływem środowiska. Zapewnia on również wsparcie podczas manipulacji w trakcie eksperymentu i redukuje szumy elektryczne. Stosujemy plastikowy stożek wydrukowany w technologii 3D (Patrz Część I: wykonanie przewodów). Można jednak wykonać stożek z innych materiałów, na przykład z wygiętego fragmentu puszki po napoju.
- Należy wziąć plastikowy stożek i przymocować taśmę z folii aluminiowej do jego wewnętrznej lub zewnętrznej powierzchni.
- Następnie należy wywiercić w stożku mały otwór (o średnicy 1,5 mm) i luźno zamocować wewnątrz stożka śrubę z podkładką i nakrętką. Będzie ona służyć jako przejście elektryczne dla przewodu uziemiającego. Zaleca się stosowanie zestawu śruby i podkładki w rozmiarze 0-80.
- Najpierw należy wkręcić i częściowo obrócić trzy śruby o rozmiarze 1-72 (o długości 3/16 cala) w boki stożka. Przy zawieszonej macierzy elektrod należy nasunąć stożek na układ napędowy. Należy upewnić się, że oba przewody uziemiające wystają z dołu macierzy elektrod. Odsłoniętą część 4-stopowego przewodu uziemiającego należy owinąć kilka razy wokół jednej ze śrub 1-72 i mocno dokręcić śrubę. Stożek należy przymocować do podstawy napędu, dokręcając pozostałe dwie śruby stożka.
- Na koniec należy wziąć odizolowany odcinek o długości 1 cm krótkiego przewodu uziemiającego i owinąć go wokół śruby, pomiędzy taśmą foliową a podkładką. Uziemienie należy utwierdzić poprzez dokręcenie śruby. W ten sposób otrzymujemy macierz mikroelektrod, która jest gotowa do implantacji chirurgicznej.
6. Reprezentatywne wyniki
- Produkcja macierzy mikro-napędów została zakończona. Twoja macierz mikro-napędów jest wyposażona w 18 tetrod i 3 kanały referencyjne. Dla zwiększenia trwałości została ona zamknięta w ochronnym stożku i nakrętce. Gotowa macierz mikro-napędów wraz z ochronnym stożkiem waży średnio od 20g do 25g.
- Gotową macierz napędów implantuje się zgodnie ze standardową procedurą chirurgiczną. Jak widać, napęd jest połączony z układem przedwzmacniacza oraz wiązką przewodów, które przesyłają sygnał do sprzętu i oprogramowania do akwizycji danych.
Rycina 1: A) Schemat konfiguracji skręcania tetrody. Poziomy pręt zawiesza niepołączone druty elektrod tetrody nad automatycznym urządzeniem do skręcania tetrod. B) Układ do pomiaru impedancji tetrody i pozłacania elektrod. Podczas sprawdzania zwarć obwód jest inny: czarny przewód jest podłączony do innego kanału elektrod na płytce złączy. C) Zbliżenie na specjalnie wykonane narzędzie do mocowania matrycy mikro-napędu. Cylindryczny pręt to rękojeść noża X-Acto. Złącze to 26-pinowe, dwurzędowe złącze Mill-max. Oba elementy są ze sobą połączone za pomocą akrylu dentystycznego. D) Konfiguracja do sprawdzania zwarć. Kanał X i Kanał Y to dowolne dwa różne kanały z czterech kanałów tetrody. E) Konfiguracja do pomiaru impedancji elektrod. Źródło prądu jest wyłączone („off”). Omomierz jest ustawiony na „on” (włączony) i „test”. F) Konfiguracja do pozłacania końcówek elektrod. Źródło prądu jest ustawione na „on”, sygnał audio na „on”, tryb na „unipolar”, test DC na „on”, a natężenie prądu ustawione na 2 microamps.