Elektrofizjologiczne metody rejestracji potencjałów synaptycznych z NMJ larw Drosophila

Summary

Tutaj opisujemy elektrofizjologiczne metody pomiaru transmisji synaptycznej w złączu nerwowo-mięśniowym larwy Drosophila. Uwolnienie wywołane jest inicjowane sztucznie przez stymulację aksonów neuronu ruchowego, a transmisję przez NMJ można zmierzyć za pomocą odpowiedzi postsynaptycznej wywołanej w mięśniu.

Abstract

W tym filmie opisujemy elektrofizjologiczne metody rejestracji przekaźnictwa synaptycznego w złączu nerwowo-mięśniowym (NMJ) larwy Drosophila. Larwalny układ nerwowo-mięśniowy jest modelową synapsą do badania fizjologii synaps i neuroprzekaźnictwa oraz jest cennym narzędziem badawczym, które zdefiniowało genetykę i jest dostępne do eksperymentalnej manipulacji. Larwy można wypreparować, aby odsłonić mięśnie ściany ciała, ośrodkowy układ nerwowy i nerwy obwodowe. Mięśnie Drosophila i ich wzór unerwienia są dobrze scharakteryzowane, a mięśnie są łatwo dostępne do rejestracji wewnątrzkomórkowej. Poszczególne mięśnie można zidentyfikować na podstawie ich lokalizacji i orientacji w 8 segmentach brzucha, z których każdy składa się z 30 mięśni ułożonych we wzór, który powtarza się w segmentach A2 - A7. Wypreparowane larwy Drosophila są cienkie, a pojedyncze mięśnie i wiązki aksonów neuronów ruchowych można uwidocznić za pomocą transiluminacji¹. Konstrukty transgeniczne mogą być używane do oznaczania komórek docelowych w celu identyfikacji wizualnej lub do manipulowania produktami genowymi w określonych tkankach. U larw pobudzające potencjały połączeniowe (EJP) są generowane w odpowiedzi na pęcherzykowe uwalnianie glutaminianu z motoneuronów w synapsie. U wypreparowanych larw EJP można zarejestrować w mięśniu za pomocą elektrody wewnątrzkomórkowej. Potencjały czynnościowe mogą być sztucznie wywoływane w neuronach ruchowych, które zostały przecięte za zwojem brzusznym, wciągnięte do szklanej pipety przez delikatne ssanie i stymulowane elektrodą. Te neurony ruchowe mają wyraźne progi wypalania, gdy są stymulowane, a kiedy strzelają jednocześnie, generują odpowiedź w mięśniach. Sygnały przesyłane przez synapsę NMJ mogą być rejestrowane w mięśniach, które unerwiają neurony ruchowe. Pobudzające potencjały połączeniowe EJP i minnatury (mEJP) są postrzegane jako zmiany potencjału błonowego. Reakcje elektrofizjologiczne są rejestrowane w temperaturze pokojowej w zmodyfikowanym minimalnym roztworze podobnym do hemolimfy² (HL3), który zawiera 5 mM Mg²⁺ i 1,5 mM Ca²⁺. Zmiany amplitudy wywołanych EJP mogą wskazywać na różnice w funkcji i strukturze synaptycznej. Zdigitalizowane nagrania są analizowane pod kątem amplitudy EJP, częstotliwości i amplitudy mEJP oraz zawartości kwantowej.

Protocol

Przed rozpoczęciem przygotuj:

• Wędrujące larwy Drosophila w stadium rozwojowym
• Roztwór HL3.1 (zmodyfikowany podobny do hemolimfy)
• Płytki preparacyjne Sylgard (przezroczysta guma silikonowa) przygotowane na małych (35 x 10 mm) plastikowych szalkach Petriego przy użyciu metod opisanych przez Brenta i McCabe'a (2008)³.
• Przytnij krótkie szpilki preparacyjne
• Stymulacja pipet elektrodowych
• Ostre pipety rejestrujące

Rozwiązanie HL3:

1. Podczas sekcji i eksperymentów elektrofizjologicznych larwy zanurza się w roztworze HL3.1², który zawiera (w mM): 70 NaCl, 5 KCl, 4 MgCl₂, 10 NaHCO₃, 5 trehalozę, 115 sacharozę i 5 HEPES, pH 7,2.
2. Stężenia CaCl₂ dodaje się do roztworu HL3.1, aby zapewnić wymagane stężenie zewnątrzkomórkowego Ca²⁺.
   • Sekcje larw przeprowadza się przy niskich stężeniach Ca²⁺ (w celu uniknięcia skurczu mięśni) przy użyciu HL3,1 + 0,25 mM CaCl₂, przechowywanego na lodzie.
   • Eksperymenty elektrofizjologiczne są zwykle rejestrowane w HL3.1 + 1 mM CaCl₂, ale w razie potrzeby można to dostosować w zakresie 0,4 – 1 mM Ca²⁺.
3. Roztwór HL3.1 jest sterylizowany filtrem przed użyciem i przechowywany w temperaturze 4°C.

Przygotowanie pipet stymulujących i rejestrujących:

1. Pipety rejestrujące i stymulujące są pobierane za pomocą laserowego ściągacza do mikropipet Sutter P-2000 przy następujących ustawieniach: Ciepło = 390, Żarnik = 4, Prędkość = 35, Opóźnienie = 200 i Ciągnięcie = 0.
2. Elektrody stymulujące są przygotowywane z cienkościennych kapilar ze szkła borokrzemianowego z szerokimi końcami, które były nieco większe niż szerokość odciętych aksonów motorycznych. Ukształtowane końcówki są polerowane ogniowo, aby uzyskać gładkie wykończenie (za pomocą polerki do pipet Narashiga), aby zminimalizować uszkodzenie nerwu. Elektrody stymulujące napełnia się roztworem do kąpieli (HL3,1 + 1 mM Ca²⁺).
3. Elektrody rejestrujące są przygotowane ze szkła borokrzemianowego o średnicy 1,2 mm, które jest ciągnięte w celu utworzenia ostrej pipety (30–60 mΩ) i napełniane 3M KCl.

Część 1: Sekcja larw Drosophila

1. Larwy wędrujące w trzecim stadium rozwojowym są preparowane w celu odsłonięcia mięśni w ścianie ciała, jak opisano wcześniej⁴.
2. Sekcje wykonuje się w HL3,1 + 0,25 mM Ca²⁺ na małych płytkach silikonowych (35 x 10 mm). Roztwór HL3.1 musi być lodowaty do sekcji w celu znieczulenia larwy i musi być przechowywany na lodzie przed i podczas sekcji.
3. Larwy są preparowane przy użyciu metod opisanych przez Brenta i McCabe'a (2008), które są modyfikowane do eksperymentów elektrofizjologicznych poprzez dodanie 0,25 mM Ca²⁺ do roztworu preparacyjnego HL3.1 i użycie krótkich szpilek preparacyjnych (o długości ~ 2 mm), które są mniej podatne na uderzenie w obiektyw mikroskopu i elektrody podczas eksperymentu.
4. Po rozbiorzeniu aksony motoryczne larw są odcinane. Odbywa się to poprzez delikatne przytrzymanie OUN i lekkie uniesienie go, aby nerwy obwodowe, które unerwiają mięśnie za zwojem brzusznym, mogły zostać przecięte bez uszkadzania mięśni (ryc. 1). Mózg jest następnie usuwany.
5. Wypreparowany preparat larwalny przemywa się dwukrotnie HL3,1 + 1 mM Ca²⁺.

Rysunek 1. Schemat przedstawiający etapy związane z cięciem aksonów motorycznych wypreparowanych larw. Ośrodkowy układ nerwowy jest unoszony za pomocą kleszczy, a aksony motoryczne są wycinane u podstawy mózgu.

Część 2: Wewnątrzkomórkowe zapisy z larwalnych komórek mięśniowych.

1. Umieścić płytkę separacyjną na mikroskopie elektrofizjologicznym i zanurzyć preparat w HL3.1 + 1.5 mM Ca²⁺ i zamocować elektrodę kąpielową tak, aby stykała się z roztworem.
2. Wszystkie eksperymenty wykonywane są na mięśniu 6 w obrębie trzeciego segmentu brzucha (A3). Nerwy obwodowe, które unerwiają mięśnie, są stymulowane za pomocą elektrody ssącej⁵.
3. Najpierw umieść elektrodę stymulującą w naczyniu, aby uniknąć wibracji, gdy elektroda wewnątrzkomórkowa jest na swoim miejscu. Umieść elektrodę stymulującą w bliskim sąsiedztwie mięśnia unerwiającego neuron ruchowy 6 i delikatnie odsysaj, aż przecięty nerw znajdzie się wewnątrz szklanej pipety. Uważaj, aby nie rozciągać nerwów podczas ssania. Lekko podnieś pipetę, aby nie dotykała mięśnia i ustaw ją tak, aby nie ciągnęła za przecięte włókna nerwowe (ryc. 2).
   
   Rysunek 2. Schemat muskulatury i unerwionych neuronów ruchowych jednego segmentu brzusznego larwy Drosophila. Zilustrowano położenie pipety stymulującej i przeciętych nerwów oraz elektrody rejestrującej w pozycji mięśnia 6.
4. Zapisy wewnątrzkomórkowe wykonuje się za pomocą ostrych mikroelektrod wypełnionych 3 M KCl. Umieść elektrodę rejestrującą powyżej środka mięśnia 6 na trzecim segmencie brzusznym (A3) i dostosuj przesunięcie wejściowe tak, aby wskazywało zero dla roztworu do kąpieli. Powoli opuść elektrodę i zbliż się do mięśnia pod dużym powiększeniem optycznym, aż dotknie powierzchni mięśnia. Obserwuj oscyloskop, aby potwierdzić, że mięsień został przeniknięty. Spoczynkowy potencjał błony powinien wynosić co najmniej -60 mV, w przeciwnym razie zwierzę nie powinno być wykorzystywane. Sporadyczne potencjały miniaturowych płytek końcowych powinny być teraz widoczne. Pozostaw komórkę do ustabilizowania się na minutę przed rozpoczęciem nagrywania.
5. Zmiany potencjału membranowego są wykrywane za pomocą stopnia głównego Axon HS-2A i wzmacniacza Axoclamp 2B i rejestrowane za pomocą Clampex v 8.2.0.235 (Axon Instruments). Axoclamp 2B jest połączony z komputerem, na którym działa oprogramowanie pCLAMP i działa w połączeniu z interfejsem Digidata 1322A.
6. Komórki rejestrowano przez 3 minuty bez żadnych bodźców do pomiaru odpowiedzi mEJP. Ślady analizowano za pomocą oprogramowania do analizy Mini (Synaptosoft, v 6.0.3) i określono amplitudę i częstotliwość mEJP.

Stymulacja nerwów:

1. Odcięty koniec neuronu ruchowego jest stymulowany serią impulsów napięcia kwadratowego (czas trwania 0,3 ms) o intensywności wystarczającej dla obu aksonów ruchowych, aby wywołać spójne reakcje w całym mięśniu.
2. Bodziec jest generowany przez generator impulsów Master-8, który jest zaprogramowany tak, aby dostarczać impulsy w sposób ciągły zgodnie z czasem trwania i czasami interwałów.
3. Odczekaj pięć sekund między bodźcami w celu odzyskania synaps w NMJ.
4. Określając siłę bodźca, zacznij od najniższego poziomu i powoli zwiększaj intensywność przez kilka prób. W eksperymentach należy stosować minimalną intensywność bodźca, która powoduje wywołaną reakcję.
5. Po osiągnięciu odpowiedniej intensywności bodźca powinien pojawić się jeden związek EJP i jeden skurcz mięśni wywołany przez bodziec.
6. Zapisz co najmniej 10 potencjałów wywołanych z każdego mięśnia i uśrednij amplitudy.

Część 3: Reprezentatywne wyniki

Rysunek 3. Reprezentatywny zapis wewnątrzkomórkowy z mięśnia 6 pokazujący wywołane EJP jest reakcją na stymulację elektryczną nerwu segmentowego i sporadyczne minnaturalne potencjały końcowe lub mEJP. Amplitudy EJP w mięśniu 6 zdrowych larw typu dzikiego, takich jak Canton S, wynoszą zwykle około 40 mV, a amplitudy mEJP między 1-3 mV.

Discussion

Opisane tutaj metody zapewniają stosunkowo szybki i szeroki sposób wykrywania zmian w funkcji synaptycznej w NMJ. Możliwość wykonywania zapisów elektrofizjologicznych na nienaruszonych zwierzętach in vivo oraz wykonywania manipulacji genetycznych lub farmakologicznych sprawia, że Drosophila jest idealnym modelem zwierzęcym do badania fizjologicznych i genetycznych aspektów neuroprzekaźnictwa.

Ponieważ komórki mięśniowe są bardzo duże, niektórzy mogą preferować dodanie dodatkowego kroku do tego...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Małe szalki Petriego (35 x 10 mm)	BD Biosciences	1008
SYLGARD 182 Zestaw elastomerów silikonowych	Dow Corning	3097366-1004
Mikroskop preparacyjny	Carl Zeiss, Inc.	475002-9902
Światło do mikroskopu	Schott AG	KLI500
Szpilki preparacyjne	Narzędzia do nauki precyzyjnej	26002-10
Oprogramowanie pClamp 9	Urządzenia molekularne	PCLAMP 9 STANDARD
Nożyczki preparacyjne: 3mm Vannas Sprężynowe nożyczki	Narzędzia do nauki	15000-0
Dumont SS Kleszcze	Narzędzia do nauki	11200-33
Dumont #5 Kleszcze	Narzędzia do nauki	11252-20
Cienkościenne kapilary ze szkła borokrzemianowego, z włóknem (1,0 mm, 4 cale)	World Precision Instruments, Inc.	TW100F-4
Kapilary ze szkła borokrzemianowego, z żarnikiem (1,2 mm, 4 cale)	World Precision Instruments, Inc.	1B120F-4
Sutter P-2000 Laserowy ściągacz do mikropipet	Sutter Instrument Co.	Model P-2000
Polerka do pipet	Narishige International	MF-83
Stopień główny Axon HS-2A	Urządzenia molekularne	Model HS-2A
Mikromanipulatory	Sutter Instrument Co.	MP-85
Wzmacniacz Axoclamp 2B	Urządzenia molekularne	AXOCLAMP 2B
Oprogramowanie Clampex	Urządzenia molekularne	v 8.2.0.235
Mini oprogramowanie analityczne. v 6.0.3	Precyzyjny wzmacniacz Synaptosoft
Brownlee		Brownlee Model 410
NaCl	Baker/VWR	4058-01
KCl	Sigma-Aldrich	p-9333
NaHCO3	Sigma-Aldrich	s6297-1kg
Trelahose	Sigma-Aldrich	TO167
Sacharoza	Fisher Scientific	bp220-212
HEPES	Sigma-Aldrich	h-3375
MgCl-6H2O	Sigma-Aldrich	m2670-1kg
CaCl2	Fisher Scientific	c79-500
Master-8 Generator impulsów	A.M.P.I
Stół wibracyjny do elektrofizjologii skonfigurowany przez	Technical Manufacturing Corp.
Klatka Faradaya