W niniejszej pracy opisujemy metody elektrofizjologiczne służące do pomiaru przekaźnictwa synaptycznego w złączu nerwowo-mięśniowym larwy Drosophila. Uwalnianie wywołane inicjuje się sztucznie poprzez stymulację aksonów neuronów ruchowych, a przekaźnictwo w złączu NMJ można zmierzyć na podstawie odpowiedzi postsynaptycznej wywołanej w mięśniu.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Metody elektrofizjologiczne rejestracji potencjałów synaptycznych z złącza nerwowo-mięśniowego larw Drosophila
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
W niniejszym filmie opisujemy metody elektrofizjologiczne służące do rejestracji przekaźnictwa synaptycznego w złączu nerwowo-mięśniowym (NMJ) larwy Drosophila. Układ nerwowo-mięśniowy larwy stanowi model synaptyczny do badań nad fizjologią synaps i neurotransmisją, a także jest cennym narzędziem badawczym, który jest zdefiniowany genetycznie i dostępny do manipulacji eksperymentalnych. Larwy można poddać sekcji w celu odsłonięcia muskulatury ściany ciała, ośrodkowego układu nerwowego oraz nerwów obwodowych. Mięśnie Drosophila i wzór ich unerwienia są dobrze scharakteryzowane, a same mięśnie są łatwo dostępne do rejestracji wewnątrzkomórkowej. Pojedyncze mięśnie można zidentyfikować na podstawie ich lokalizacji i orientacji w obrębie 8 segmentów brzusznych, z których każdy posiada 30 mięśni ułożonych we wzór powtarzający się w segmentach A2 – A7. Przecięte larwy Drosophila są cienkie, a poszczególne mięśnie oraz pęczki aksonów neuronów ruchowych można uwidocznić za pomocą transiluminacji.1Konstrukty transgeniczne mogą być wykorzystywane do znakowania komórek docelowych w celu ich wizualnej identyfikacji lub do manipulowania produktami genów w określonych tkankach. U larw potencjały złącza pobudzającego (EJP) powstają w odpowiedzi na pęcherzykowy wyrzut glutaminianu z motoneuronów w synapsie. W preparatach z wypreparowanych larw EJP można rejestrować w mięśniu za pomocą elektrody wewnątrzkomórkowej. Potencjały czynnościowe mogą być sztucznie wywoływane w neuronach ruchowych, które zostały przecięte tylnie względem zwoju brzusznego, wciągnięte do szklanej pipety za pomocą delikatnego ssania i stymulowane elektrodą. Neurony ruchowe te mają wyraźne progi pobudzenia podczas stymulacji i gdy odpalają jednocześnie, generują odpowiedź w mięśniu. Sygnały przekazywane przez synapsę NMJ można rejestrować w mięśniach unerwionych przez neurony ruchowe. EJP oraz miniaturowe potencjały złącza pobudzającego (mEJP) są widoczne jako zmiany potencjału błonowego. Odpowiedzi elektrofizjologiczne są rejestrowane w temperaturze pokojowej w zmodyfikowanym minimalnym roztworze przypominającym hemolimfę.2(HL3) zawierający 5 mM Mg2+oraz 1,5 mM Ca2+Zmiany amplitudy wywołanych EJP mogą wskazywać na różnice w funkcji i strukturze synaptycznej. Zdigitalizowane zapisy są analizowane pod kątem amplitudy EJP, częstotliwości i amplitudy mEJP oraz zawartości kwantowej.
Protokół
Przed rozpoczęciem należy przygotować:
- Wędrujące larwy Drosophila w trzecim stadium rozwojowym
- Roztwór HL3.1 (zmodyfikowany roztwór przypominający hemolimfę)
- Płytki do sekcji z Sylgardu (przezroczystej gumy silikonowej) przygotowane w małych (35 x 10 mm) plastikowych szalkach Petriego zgodnie z metodami opisanymi przez Brenta i McCabe'a (2008)3.
- Przycięte na krótko szpilki sekcyjne
- Pipety z elektrodami stymulującymi
- Ostre pipety rejestrujące
Roztwór HL3:
- Podczas sekcji i eksperymentów elektrofizjologicznych larwy zanurza się w roztworze HL3.12, który zawiera (w mM): 70 NaCl, 5 KCl, 4 MgCl2, 10 NaHCO3, 5 trehalozy, 115 sacharozy oraz 5 HEPES, pH 7.2.
- Do roztworu HL3.1 dodaje się odpowiednie stężenia CaCl2, aby uzyskać wymagane stężenie zewnątrzkomórkowego Ca2+.
- Sekcje larw przeprowadza się przy niskich stężeniach Ca2+ (aby uniknąć skurczów mięśni), stosując roztwór HL3.1 + 0.25 mM CaCl2 przechowywany w lodzie.
- Pomiary w eksperymentach elektrofizjologicznych zazwyczaj wykonuje się w roztworze HL3.1 + 1 mM CaCl2, jednak wartość tę można dostosować w zakresie 0.4 – 1 mM Ca2+ zgodnie z potrzebami.
- Roztwór HL3.1 przed użyciem sterylizuje się poprzez filtrację i przechowuje w temperaturze 4˚C.
Przygotowanie pipet stymulujących i rejestrujących:
- Pipety rejestrujące i stymulujące są wytwarzane za pomocą wyciągacza mikropipet laserowych Sutter P-2000 przy użyciu następujących ustawień: Heat = 390, Filament = 4, Velocity = 35, Delay = 200 oraz Pull = 0.
- Elektrody stymulujące są przygotowywane z cienkościennych kapilar borokrzemianowych o szerokich końcach, których średnica była nieco większa niż szerokość przeciętych aksonów ruchowych. Kształtowane końce są wypalane w celu uzyskania gładkiej powierzchni (za pomocą polerki pipet Narashiga), aby zminimalizować uszkodzenia nerwu. Elektrody stymulujące są wypełnione roztworem kąpielowym (HL3.1 + 1 mM Ca2+).
- Elektrody rejestrujące są przygotowywane ze szkła borokrzemianowego o średnicy 1,2 mm, które jest wyciągane w celu utworzenia ostrej pipety (30–60 mΩ) i wypełniane 3M KCl.
Część 1: Disekcja larw Drosophila
- Larwy w trzecim stadium larwalnym w fazie wędrownej są poddawane sekcji w celu odsłonięcia mięśni ściany ciała, zgodnie z wcześniej opisaną procedurą4.
- Sekcje wykonuje się w roztworze HL3.1 + 0,25 mM Ca2+ na małych płytkach silikonowych (35 x 10 mm). Roztwór HL3.1 musi być schłodzony do temperatury lodowej podczas sekcji w celu znieczulenia larwy; należy go przechowywać w lodzie przed i w trakcie przeprowadzania zabiegu.
- Larwy są sekcjonowane metodami opisanymi przez Brenta i McCabe'a (2008), zmodyfikowanymi dla eksperymentów elektrofizjologicznych poprzez dodanie 0,25 mM Ca2+ do roztworu sekcyjnego HL3.1 oraz zastosowanie krótkich szpilek sekcyjnych (o długości ok. 2 mm), co zmniejsza ryzyko uderzenia w obiektyw mikroskopu i elektrody podczas eksperymentu.
- Po sekcji przecina się aksony ruchowe larwy. Odbywa się to poprzez delikatne przytrzymanie OUN i jego lekkie uniesienie, tak aby można było przeciąć nerwy obwodowe unerwiające mięśnie znajdujące się tylnie w stosunku do zwoju brzusznego, bez uszkodzenia samych mięśni (Rycina 1). Następnie usuwa się mózg.
- Przygotowany preparat larwalny przemywa się dwukrotnie roztworem HL3.1 + 1 mM Ca2+.
Rycina 1. Schemat przedstawiający etapy przecinania aksonów ruchowych w preparowanych larwach. OUN jest uniesiony pęsetą, a aksony ruchowe są przecinane u podstawy mózgu.
Część 2: Rejestracje wewnątrzkomórkowe z komórek mięśniowych larwy.
- Umieść płytkę do sekcji na mikroskopie elektrofizjologicznym, zanurz preparat w roztworze HL3.1 + 1,5 mM Ca2+ i zamocuj elektrodę kąpielową tak, aby stykała się z roztworem.
- Wszystkie eksperymenty są przeprowadzane na mięśniu 6 w obrębie trzeciego segmentu brzusznego (A3). Nerwy obwodowe unerwiające mięśnie są stymulowane za pomocą elektrody ssącej5.
- W celu uniknięcia wibracji podczas wprowadzania elektrody wewnątrzkomórkowej, najpierw ustaw elektrodę stymulującą w naczyniu. Umieść elektrodę stymulującą w bliskim sąsiedztwie neuronu ruchowego unerwiającego mięsień 6 i stosuj delikatne ssanie, aż przecięty nerw znajdzie się wewnątrz szklanej pipety. Należy uważać, aby nie rozciągać nerwów podczas ssania. Nieznacznie unieś pipetę, aby nie dotykała mięśnia, i ustaw ją tak, aby nie naprężała przeciętych włókien nerwowych (Rycina 2).
Rycina 2. Schemat mięśni i unerwiających je neuronów ruchowych jednego segmentu brzusznego larwy Drosophila. Przedstawiono pozycję pipety stymulującej, przeciętych nerwów oraz elektrody rejestrującej ustawionej przy mięśniu 6. - Rejestracje wewnątrzkomórkowe są wykonywane za pomocą ostrych mikroelektrod wypełnionych 3 M KCl. Ustaw elektrodę rejestrującą nad środkiem mięśnia 6 w trzecim segmencie brzusznym (A3) i dostosuj offset wejściowy tak, aby wskazywał zero dla roztworu kąpielowego. Powoli opuszczaj elektrodę i zbliżaj ją do mięśnia przy dużym powiększeniu optycznym, aż dotknie ona powierzchni mięśnia. Obserwuj oscyloskop, aby potwierdzić penetrację mięśnia. Potencjał spoczynkowy błony powinien wynosić co najmniej -60 mV; w przeciwnym razie zwierzę nie powinno być wykorzystane. Powinny być teraz widoczne sporadyczne miniaturowe potencjały płytki końcowej. Pozostaw komórkę do stabilizacji na jedną minutę przed rozpoczęciem rejestracji.
- Zmiany potencjału błony są wykrywane za pomocą przedwzmacniacza Axon HS-2A i wzmacniacza Axoclamp 2B oraz rejestrowane programem Clampex v 8.2.0.235 (Axon Instruments). Axoclamp 2B jest połączony z komputerem z oprogramowaniem pCLAMP i współpracuje z interfejsem Digidata 1322A.
- Rejestracje z komórek prowadzono przez 3 minuty bez stymulacji w celu pomiaru odpowiedzi mEJP. Ślady analizowano przy użyciu oprogramowania Mini analysis (Synaptosoft, v 6.0.3), a następnie określono amplitudę i częstotliwość mEJP.
Stymulacja nerwów:
- Przecięty koniec neuronu ruchowego jest stymulowany serią prostokątnych impulsów napięciowych (czas trwania 0.3 ms) o natężeniu wystarczającym dla obu aksonów ruchowych, aby wywołać spójne odpowiedzi w całym mięśniu.
- Bodziec jest generowany za pomocą generatora impulsów Master-8, zaprogramowanego do ciągłego dostarczania impulsów zgodnie z określonym czasem trwania i odstępami.
- Należy zachować pięciosekundową przerwę między bodźcami w celu regeneracji synaptycznej w NMJ.
- Podczas określania siły bodźca należy zacząć od najniższego poziomu i powoli zwiększać natężenie w ciągu kilku prób. W eksperymentach należy stosować minimalne natężenie bodźca, które wywołuje odpowiedź.
- Po osiągnięciu odpowiedniego natężenia bodźca, bodziec ten powinien wywoływać jeden złożony EJP oraz jeden skurcz mięśnia.
- Należy zarejestrować co najmniej 10 potencjałów wywołanych z każdego mięśnia i obliczyć średnią ich amplitud.
Część 3: Reprezentatywne wyniki
Rycina 3. Reprezentatywny zapis wewnątrzkomórkowy z mięśnia 6 przedstawiający wywołane EJP w odpowiedzi na stymulację elektryczną nerwu segmentowego oraz sporadyczne miniaturowe potencjały płytki końcowej, czyli mEJP. Amplitudy EJP w mięśniu 6 zdrowych larw typu dzikiego, takich jak Canton S, wynoszą zazwyczaj około 40 mV, a amplitudy mEJP mieszczą się w przedziale 1-3 mV.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Opisane tutaj metody stanowią stosunkowo szybki i szeroki sposób wykrywania zmian w funkcji synaptycznej w NMJ. Możliwość rejestracji elektrofizjologicznej u nietkniętych zwierząt in vivo, a także przeprowadzania manipulacji genetycznych lub farmakologicznych, czyni Drosophila idealnym modelem zwierzęcym do badania fizjologicznych i genetycznych aspektów neurotransmisji.
Ponieważ komórki mięśniowe są bardzo duże, niektórzy mogą chcieć dodać do tego protokołu dodatkowy krok w celu rejestracji m...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Małe szalki Petriego (35 x 10 mm) | BD Biosciences | 1008 | |
| Zestaw elastomeru silikonowego SYLGARD 182 | Dow Corning | 3097366-1004 | |
| Mikroskop do sekcji | Carl Zeiss, Inc. | 475002-9902 | |
| Oświetlenie do mikroskopu | Schott AG | KLI500 | |
| Szpile do sekcji | Fine Science Tools | 26002-10 | |
| Oprogramowanie pClamp 9 | Molecular Devices | PCLAMP 9 STANDARD | |
| Nożyczki do sekcji: 3 mm nożyczki sprężynowe Vannasa | Fine Science Tools | 15000-0 | |
| Pinceta Dumont SS | Fine Science Tools | 11200-33 | |
| Pinceta Dumont nr 5 | Fine Science Tools | 11252-20 | |
| Cienkościenne kapilary szklane borokrzemowe z włóknem (1,0 mm, 4 cal) | World Precision Instruments, Inc. | TW100F-4 | |
| Kapilary szklane borokrzemowe z włóknem (1,2 mm, 4 cal) | World Precision Instruments, Inc. | 1B120F-4 | |
| Laserowy wyciągacz mikropipet Sutter P-2000 | Sutter Instrument Co. | Model P-2000 | |
| Polerka pipet | Narishige International | MF-83 | |
| Głowica Axon HS-2A | Molecular Devices | Model HS-2A | |
| Mikromanipulatory | Sutter Instrument Co. | MP-85 | |
| Wzmacniacz Axoclamp 2B | Molecular Devices | AXOCLAMP 2B | |
| Oprogramowanie Clampex | Molecular Devices | v 8.2.0.235 | |
| Oprogramowanie Mini analysis v 6.0.3 | Synaptosoft | ||
| Wzmacniacz precyzyjny Brownlee | Brownlee | Model 410 | |
| NaCl | Baker/VWR | 4058-01 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | p-9333 | |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | s6297-1kg | |
| Trezhaloza | Sigma-Aldrich | TO167 | |
| Sacharoza | Fisher Scientific | bp220-212 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | h-3375 | |
| MgCl-6H2O | Sigma-Aldrich | m2670-1kg | |
| CaCl2 | Fisher Scientific | c79-500 | |
| Generator impulsów Master-8 | A.M.P.I | ||
| Stół wibroizolacyjny do zestawu elektrofizjologicznego | Technical Manufacturing Corp. | ||
| Klatka Faradaya |
Bibliografia
- Atwood, H. L., Govind, C. K., Wu, C. F. Differential ultrastructure of synaptic terminals on ventral longitudinal abdominal muscles in Drosophila larvae. J. Neurobiol. 24 (8), 1008-1024 (1993).
- Feng, Y., Ueda, A., Wu, C. F. A modified minimal hemolymph-like solution, HL3.1, for physiological recordings at the neuromuscular junctions of normal and mutant Drosophila larvae. J Neurogenet. 18 (2), 377-402 (2004).
- Estes, P. S., Roos, J., van der Bliek, A., Kelly, R. B., Krishnan, K. S., Ramaswami, M. Traffic of dynamin within individual Drosophila synaptic boutons relative to compartment-specific markers. J Neurosci. 16, 5443-5456 (1996).
- Brent, J. R., Werner, K. M., McCabe, B. D. Protocol for dissection of Drosophila larvae. J Vis Exp. , (2008).
- Jan, L. Y., Jan, Y. N. Properties of the larval neuromuscular junction in Drosophila melanogaster. J Physiol (Lond). 262, 189-214 (1976).
- Katz, L. C., Shatz, C. J. Synaptic activity and the construction of cortical circuits. Science. 274, 1133-1138 (1996).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
