W niniejszym materiale opisujemy sposób optymalizacji pozyskanego obrazu wideo dla aparatury do magnetycznego więzienia węchowego (OMT). Przedstawiamy również dwa przykładowe protokoły eksperymentalne służące do badania fuzji wzrokowo-węchowej.
Artykuł metodologiczny
Wizualnie zapośredniczone śledzenie zapachu podczas lotu u Drosophila
Otwiera się w nowej karcie
W tym artykule
Podsumowanie
Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Streszczenie
Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Latające owady wykorzystują sygnały wizualne do stabilizacji swojego kierunku lotu w strumieniu powietrza. Wiele zwierząt dodatkowo śledzi zapachy przenoszone przez wiatr. W związku z tym wizualna stabilizacja śledzenia kierunku pod wiatr bezpośrednio wspomaga śledzenie zapachów. Czy jednak sygnały olfaktoryczne bezpośrednio wpływają na zachowanie śledzenia wizualnego niezależnie od sygnałów wiatrowych? Co więcej, ostatnie postępy w genetyce molekularnej i neurofizjologii węchu zainspirowały nowe ilościowe analizy behawioralne mające na celu ocenę wpływu na zachowanie (np.) genetycznej inaktywacji specyficznych obwodów aktywacji olfaktorycznej. Zmodyfikowaliśmy system magnetycznego uwięzienia, opracowany pierwotnie do eksperymentów wizualnych, wyposażając arenę w wąskie, laminarne pióropusze zapachowe. W niniejszej pracy skupiamy się na eksperymentach, które można przeprowadzić po uwiązaniu muchy i uzyskaniu przez nią zdolności do nawigowania w magnetycznej arenie. Pokazujemy, jak pozyskiwać obrazy wideo zoptymalizowane pod kątem pomiaru kąta ciała, jak oceniać stabilne śledzenie zapachu oraz przedstawiamy dwa eksperymenty badające wpływ sygnałów wizualnych na śledzenie zapachów.
Protokół
Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
OMT jest adaptacją systemu magnetycznej uwięzi 1 zaprojektowaną w celu włączenia wirtualnego symulatora pióropusza zapachowego 2. Poniższe protokoły wyjaśnią, jak zoptymalizować pozyskane obrazy wideo (Część 1) oraz jak przeprowadzić dwa rodzaje podstawowych eksperymentów wizualno-olfaktorycznych (Część 2 i 3).
Część 1: Akwizycja wideo
Optymalizacja obrazu wideo jest kluczowa dla jakości pozyskanych danych. Aby uzyskać wyraźniejsze obrazy, należy wykonać następujące kroki.
- Za pomocą pęsety umieść świeżo przymocowaną muchę w arenie.
- Ustaw kamerę Firewire (Fire-I 1394store.com) pod przezroczystą akrylową komorą próżniową w taki sposób, aby pole widzenia kamery było skierowane bezpośrednio w górę przez komorę i szklaną rurkę na stronę brzuszną przymocowanej muchy. Upewnij się, że obiektyw systemu wideo nie posiada powłoki filtra IR.
- W celu oświetlenia muchy użyj okrągłego układu diod LED w podczerwieni (Small-Parts Inc) umieszczonego bezpośrednio pod panelami LED. Ustaw ostrość każdej diody LED indywidualnie na ciele muchy, aby uzyskać równomierne oświetlenie.
- Aby zredukować odblaski z systemu paneli i zminimalizować wskazówki wizualne dostrzegane przez muchę, warto pomalować wszystkie powierzchnie odbijające w polu widzenia kamery matową czarną farbą. Światła w pomieszczeniu powinny być wyłączone, aby ograniczyć odblaski i modulacje jasności wykrywalne przez oko muchy.
- Wizualnie sprawdź obraz z kamery. Mucha powinna być jasnobiała na czarnym tle. Jeśli obraz jest rozmazany, może być konieczne ustawienie ostrości obiektywu. Jeśli mucha jest ciemna, układ LED może być nieostry lub niedostatecznie zasilany, aby zapewnić odpowiednie oświetlenie. Jeśli w tle znajdują się jasne obiekty, zamontuj dysk z czarnego papieru flokowanego bezpośrednio nad muchą, aby zminimalizować odbicia tła.
- Nagrywanie wideo realizujemy za pomocą niestandardowych podprogramów napisanych w programie Matlab z wykorzystaniem Image Acquisition toolbox.
Część 2: Mucha odnajdująca pióropusz zapachowy
Jednym z prostych eksperymentów w OMT jest obserwacja głodnej (wygłodzonej) muchy lokalizującej, a następnie aktywnie śledzącej smugę atrakcyjnego zapachu pożywienia. Manipulowanie otoczeniem wizualnym wpływa na zdolność muchy do stabilnego śledzenia appetytywnego zapachu pożywienia. Należy zauważyć, że eksperymenty są zazwyczaj przeprowadzane w formacie bloków randomizowanych, aby zminimalizować wszelkie błędy wynikające z kolejności doświadczeń. Cały zewnętrzny sprzęt (multipleksery gazowe, arena LED, system akwizycji wideo) jest sterowany przez niestandardowe procedury programistyczne napisane w programie Matlab (Mathworks).
- Za pomocą pęsety umieść świeżo przymocowaną muchę w arenie.
- Przed każdym eksperymentem, korzystając z wyświetlacza wizualnego, obróć muchę o kilka pełnych obrotów 3, aby zapewnić płynny ruch wokół całej 360-stopniowej osi obrotu (yaw). Jeśli mucha nie obraca się płynnie, należy ją odrzucić. Jeśli problem będzie występował nadal, prawdopodobną przyczyną są źle wyrównane magnesy. Uwaga: Jeśli rozkład kierunku areny dla kilku trajektorii podczas próby obrotowej wykazuje znaczące piki (tj. nie jest płaski w zakresie 360 stopni), prawdopodobnie występuje błąd orientacji spowodowany źle wyrównanymi magnesami.
- Przedstaw musze następujące przykładowe warunki eksperymentalne w losowej kolejności: i) wysokokontrastowy wzór pasowy z parą wodną wydostającą się z portu zapachowego; ii) wysokokontrastowy wzór pasowy z atrakcyjnymi oparami zapachowymi; iii) pojedynczy pionowy pas przesunięty o 90 stopni względem dyszy pary wodnej; oraz iv) pojedynczy pas przesunięty o 90 stopni z oparami zapachowymi. W naszym doświadczeniu 30-sekundowe interwały sprawdzają się dobrze w eksperymentach, w których muchy mają za zadanie samodzielnie zlokalizować źródło zapachu. Nagrywamy wideo z częstotliwością 30 Hz przez cały czas trwania każdego warunku eksperymentalnego i analizujemy obrazy w trybie offline za pomocą niestandardowych procedur oprogramowania napisanych w Matlab (jedną z najużyteczniejszych wbudowanych funkcji Matlab jest regionprops.m, która analizuje właściwości geometryczne elipsy).
- Przy stosowaniu wysokich stężeń zapachu, z portu zapachowego po wyłączeniu dopływu mogą uwalniać się resztki zapachu. Aby zminimalizować ewentualne skutki tego zjawiska, warto obrócić muchę przez kilka sekund przy rotującej panoramie, aby umożliwić systemowi usunięcie wszelkich pozostałości zapachu.
- Korzystne jest również wizualne obracanie muchy pomiędzy zabiegami eksperymentalnymi, aby (i) utrzymać aktywność much w eksperymencie oraz (ii) zapobiec pozostawaniu much w jednym miejscu. Przykładowy eksperyment może mieć następującą kolejność: i) dwudziestosekundowy wstępny obrót diagnostyczny; ii) pięciosekundowy obrót pośredni; iii) dwudziestosekundowa para warunków nr 1; iv) pięciosekundowy obrót pośredni; v) dwudziestosekundowa para warunków nr 2.
Część 3: Pozostawanie muchy w obrębie pióropusza zapachowego
Drugim podstawowym eksperymentem w OMT jest wizualne wciągnięcie muchy w smugę zapachową, natychmiastowa zmiana warunków wizualnych, a następnie pomiar zdolności owada do pozostania w smudze. Ponownie należy zaznaczyć, że wszystkie eksperymenty są przeprowadzane w formacie bloków randomizowanych, aby zminimalizować wszelkie błędy wynikające z kolejności doświadczeń.
- Za pomocą pęsety umieść świeżo przymocowaną muchę w arenie.
- Przed każdym eksperymentem obróć wizualnie (zakręć) muchę kilka razy wokół areny w ramach kontroli diagnostycznej, aby upewnić się, że zwierzę ma zdolność orientacji w każdym kierunku (patrz część 2.2).
- Przed każdym warunkiem włącz zapach eksperymentalny (wodę lub ocet) i wizualnie „wciągnij” muchę w smugę zapachową poprzez oscylację małego pionowego paska w pozycji smugi. Wykorzystuje to silny odruch fiksacji paska obserwowany u much [4].
- Gdy mucha jest już zorientowana w stronę smugi, usuń oscylujący pasek i wprowadź następujące warunki wizualne: i) panoramiczne paski o wysokim kontraście z parą wodną (rys. 1A); ii) jednolite tło z parą wodną (rys. 1B); iii) panoramiczne paski o wysokim kontraście z oparami zapachowymi (rys. 1C); iv) jednolite tło z oparami zapachowymi (rys. 1D). Nagraj wideo zgodnie z opisem w 2.3. Przykładowy eksperyment może przebiegać w następującej kolejności: i) dwudziestosekundowy wstępny obrót diagnostyczny; ii) pięciosekundowa oscylacja paska smugi; iii) dwudziestosekundowa para warunków nr 1; iv) pięciosekundowa oscylacja paska smugi; v) dwudziestosekundowa para warunków nr 2.
Reprezentatywne wyniki:
Rysunek 1
W części 1 wyjaśniono, jak zoptymalizować obrazy wideo z OMT. Obraz wideo powinien przedstawiać wyraźny widok oświetlonej muchy na ciemnym, czarnym tle. Zbyt jasne obrazy można poprawić poprzez ograniczenie zakłóceń w tle, zmniejszenie natężenia diod IR lub wyłączenie światła w pomieszczeniu. Jeśli mucha jest niewłaściwie oświetlona, problem może zostać rozwiązany poprzez regulację ostrości diod IR lub modulację ich natężenia. Części 2 i 3 opisują proste eksperymenty, które należy przeprowadzić w celu weryfikacji prawidłowego działania OMT. W każdym przypadku mucha powinna zostać wizualnie „zmuszona” (poprzez reakcje optomotoryczne) do wykonania kilku pełnych obrotów w arenie, aby zapewnić płynny i pełny zakres ruchu. W części 2 mucha ma za zadanie samodzielnie odnaleźć smugę zapachową. Aby utrzymać zaangażowanie muchy w eksperymencie, ograniczyć efekt uwalniania resztkowego zapachu oraz zapobiec utrzymywaniu przez muchy jednego kierunku przez cały czas trwania badania, warto wizualnie obracać muchę przez kilka sekund pomiędzy próbami. Mucha nigdy nie powinna w znacznym stopniu lokalizować smugi pary wodnej, natomiast zawsze powinna lokalizować smugę zapachową w obecności bogatych, panoramicznych wskazówek wizualnych. W części 3 mucha jest wizualnie wciągana bezpośrednio do smugi zapachowej, a następnie ma za zadanie utrzymać swój kierunek wewnątrz smugi na tle różnych stacjonarnych tło wizualnych. Jeśli mucha zostanie wciągnięta do smugi pary wodnej, powinna szybko się od niej odwrócić. Jeśli mucha zostanie wciągnięta do smugi zapachowej i dostępne są wystarczające wskazówki wizualne do zapośredniczenia stabilnego śledzenia, mucha pozostanie w smudze.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Pozyskiwanie obrazów w tym systemie odbywa się za pomocą niedrogiej kamery płytkowej FireWire oraz oprogramowania napisanego w języku Matlab. Wyraźne obrazy są kluczowe dla uzyskania dokładnych przebiegów danych. Strategie opisane powyżej są przydatne do poprawy jakości obrazów w tym systemie. Inne procedury śledzenia wideo dla tego systemu zostały opisane 1. Ponadto system ten można łatwo zmodyfikować, aby wprowadzić śledzenie wideo w czasie rzeczywistym. Przykładowe protokoły eksperymentalne opisane w niniej...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Podziękowania
Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Sfinansowano z grantu National Science Foundation przyznanego MF
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Kamera Firewire | 1394store.com | Kamera BW z płytą Fire-I | Obiektyw 4,3mm bez powłoki IR |
| Diody LED IR | Small Parts, Inc. | ||
| Czarna farba w sprayu | Rustoleum | Matowa czerń | |
| Czarny papier flokowany | Edmund Scientific | ||
| System paneli | Caltech | 3 | |
| Matlab 2006a | Mathworks | Image acquisition toolbox |
Bibliografia
Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
- Bender, J. A., Dickinson, M. Visual stimulation of saccades in magnetically tethered Drosophila. J Exp Biol. 209, 3170-3182 (2006).
- Duistermars, B. J., Frye, M. A. Crossmodal visual input for odor tracking during fly flight. Curr Biol. 18, 270-275 (2008).
- Reiser, M. B., Dickinson, M. A modular display system for insect behavioral neuroscience. J Neurosci Methods. 167, 127-139 (2008).
- Götz, K. G. Course-control, metabolism and wing interference during ultralong tethered flight in Drosophila melanogaster. J. Exp. Biol. 128, 35-46 (1987).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE
Poproś o pozwolenie