Dwufotonowa aksotomia i konfokalne obrazowanie time-lapse w żywych embrionach danio pręgowanego

Podsumowanie

W niniejszej pracy opisujemy metodę montowania embrionów zebrafish do długotrwałego obrazowania, obrazowania dwufotonowego, technik uszkadzania tkanek oraz konfokalnego obrazowania time-lapse.

Streszczenie

Zebry danina od dawna są wykorzystywane do badania komórkowych i molekularnych mechanizmów rozwoju za pomocą obrazowania time-lapse żywych, przezroczystych embrionów. W niniejszym opracowaniu opisujemy metodę montowania embrionów zebry daniny do długotrwałego obrazowania oraz demonstrujemy, jak zautomatyzować rejestrację obrazów time-lapse przy użyciu mikroskopu konfokalnego. Opisujemy również metodę tworzenia kontrolowanych, precyzyjnych uszkodzeń poszczególnych odgałęzień obwodowych aksonów sensorycznych u zebry daniny, wykorzystując skupioną moc lasera femtosekundowego zamontowanego na mikroskopie dwufotonowym. Parametry skutecznej aksonotomii dwufotonowej muszą zostać zoptymalizowane dla każdego mikroskopu. W celu przedstawienia dwóch przykładów zademonstrujemy aksonotomię dwufotonową zarówno na mikroskopie dwufotonowym zbudowanym na specjalne zamówienie, jak i na mikroskopie konfokalnym/dwufotonowym Zeiss 510.

Neurony sensoryczne nerwu trójdzielnego u danio pręgowanego można wizualizować w linii transgenicznej wykazującej ekspresję GFP pod kontrolą promotora specyficznego dla neuronów sensorycznych ¹. Dostosowaliśmy ten model nerwu trójdzielnego u danio pręgowanego, aby bezpośrednio obserwować regenerację aksonów sensorycznych w żywych embrionach tych ryb. Embriony są znieczulane trikainą i umieszczane w kropli agarozy, która następnie zastyga. Unieruchomione embriony są zamykane w komorze obrazowania wypełnionej roztworem Ringera z fenylotiomocznikiem (PTU). Ustaliliśmy, że embriony w tych komorach mogą być obrazowane w sposób ciągły przez 12-48 godzin. Następnie wykonuje się pojedynczy obraz konfokalny, aby wyznaczyć pożądane miejsce aksonotomii. Obszar zainteresowania jest lokalizowany w mikroskopie dwufotonowym poprzez obrazowanie aksonów sensorycznych przy niskiej, nieuszkadzającej mocy. Po powiększeniu pożądanego miejsca aksonotomii zwiększa się moc, a pojedyncze skanowanie tego zdefiniowanego obszaru jest wystarczające do przerwania aksonu. Następnie w mikroskopie konfokalnym konfiguruje się obrazowanie time-lapse w wielu lokalizacjach, aby bezpośrednio obserwować regenerację aksonów po urazie.

Protokół

Część 1: Montowanie zarodków danio pręgowanego do długoterminowego obrazowania

1. Przygotować 1% roztwór nisko-topiącej się agarozy do zatapiania. Rozpuścić agarozę w wodzie dejonizowanej (DI) poprzez podgrzewanie w mikrofalówce, rozdzielić na mniejsze porcje do probówek i przechowywać w bloku grzejnym w temperaturze 42 °C.
2. Wybrać embriony do obrazowania i usunąć ich choriony, ostrożnie rozdzielając chorion pęsetą. Embriony można umieścić w 5% roztworze Ringera z PTU w 22-24 godzinach po zapłodnieniu (hpf), aby zahamować powstawanie pigmentu. Poprawia to klarowność obrazowania i jest niezbędne do przeprowadzania aksotomii aksonów sensorycznych metodą dwufotonową. Jeśli dopuści się do powstania naturalnego pigmentu, autofluorescencja przesłoni aksony w mikroskopie dwufotonowym. Roztwór Ringera dla danio pręgowanego zawiera 116 mM NaCl, 2.9 mM KCl, 1.8 mM CaCl₂ oraz 5mM HEPES, pH 7.2.
3. Zanestetyzować embriony, dodając ~0.02% trikainy do roztworu Ringera z PTU. Przed kontynuacją upewnić się, że zwierzęta nie reagują na dotyk.
4. Przygotować komorę do długoterminowego obrazowania, nakładając smar próżniowy na jedną stronę szklanego lub teflonowego pierścienia i mocując go do szklanego szkiełka nakrywki.
5. Przenieść jeden embrion do 42-stopniowego roztworu agarozy za pomocą szklanej pipety, dbając o to, aby nie przenieść zbyt wiele roztworu Ringera z PTU, a następnie przenieść embrion wraz z jedną kroplą agarozy na przygotowaną nakrywkę.
6. Ustawić embrion w pożądanej pozycji w czasie twardnienia agarozy. Należy pamiętać, że po zakończeniu prac komora obrazowania zostanie odwrócona, tak aby szkiełko nakrywki stało się powierzchnią górną.
7. W przypadku posiadania stolika zmotoryzowanego i możliwości obrazowania wielu lokalizacji jednocześnie, powtórzyć kroki 1.4-1.6 dla każdego embrionu.
8. Odczekać do całkowitego stężenia agarozy, a następnie wypełnić pierścień 0.02% roztworem Ringera z PTU i trikainą.
9. Nałożyć smar próżniowy na drugą stronę pierścienia (pierścieni), a następnie przykryć pierścień (pierścienie) szkiełkiem przedmiotowym. Odwrócić uszczelnioną komorę (komory). Komory te mogą być używane do obrazowania w mikroskopach prostych lub odwróconych.

Część 2: Aksotomia dwufotonowa z użyciem zbudowanego na zamówienie mikroskopu dwufotonowego z laserem tytano-szafirowym Chameleon

1. Przygotowanie do obrazowania. Umieść zamontowany embrion (lub embriony) w uchwycie do szkiełek pod mikroskopem. Ustaw ostrość na jednym embrionie, korzystając z obiektywu wodnego 40X (0.8 NA). Włącz laser. Wykorzystując poniższe parametry, udało nam się powtarzalnie wizualizować i uszkadzać neurony wykazujące ekspresję GFP. Aby wizualizować aksony przy mocy niepowodującej uszkodzeń, ustaw długość fali lasera na 910 nanometrów (nm) i moc na 30 miliwatów (mW – podana wartość to moc w miejscu próbki). Otwórz oprogramowanie do obrazowania. Używamy oprogramowania ScanImage opracowanego w laboratorium Karela Svobody ^{2, 3}.
2. Naciśnij przycisk focus, aby zeskanować embrion laserem dwufotonowym, zlokalizuj akson, który chcesz poddać aksotomii, i wykonaj zdjęcie tego aksonu. Zaznacz pierwszą i ostatnią pozycję Z, wykonaj obrazowanie i utwórz projekcję maksymalną (maximum projection) ze stosów Z.
3. Zastosuj powiększenie 70X na odgałęzieniu aksonu, który chcesz poddać aksotomii, i zatrzymaj skanowanie. Zwiększ moc w miejscu próbki do wartości powodującej uszkodzenie, tj. 180 mW, i wykonaj pojedyncze skanowanie laserem. Robimy to, ustawiając liczbę warstw Z na 1 i naciskając „Grab”. Powinno to być wystarczające do przerwania aksonu. Metody optymalizacji tej procedury dla Twojego mikroskopu i celu eksperymentalnego opisano w dyskusji.
4. Zmniejsz powiększenie, zredukuj moc do 30 mW i wykonaj zdjęcie.

Część 3: Aksotomia dwufotonowa przy użyciu mikroskopu konfokalnego/dwufotonowego Zeiss 510

1. Umieść zamontowany embrion na stoliku i ustaw ostrość, używając obiektywu wodnego 25X lub innego odpowiedniego obiektywu.
2. Włącz lasery dwufotonowy (910 nm) oraz argonowy (488 nm) w ustawieniu wielościeżkowym, aby umożliwić przełączanie się między nimi. Chociaż oba lasery służą do detekcji GFP, emisję dwufotonową wizualizuje się kolorem czerwonym, a emisję lasera argonowego kolorem zielonym, aby rozróżnić oba sygnały.
3. Użyj lasera argonowego, aby zidentyfikować akson przeznaczony do uszkodzenia. W ustawieniach Z zaznacz pierwszy i ostatni przekrój optyczny. Wykonaj obraz konfokalny i utwórz projekcję maksymalną stosu Z.
4. Wybierz odcinek aksonu do uszkodzenia i ustaw ostrość na tym obszarze. Wyłącz laser argonowy i włącz laser dwufotonowy. Zeskanuj preparat laserem dwufotonowym przy intensywności lasera wynoszącej ok. 9% transmisji, aby upewnić się, że akson nadal znajduje się w ostrości.
5. Kliknij przycisk „stop”, aby aktywować narzędzie przycinania (crop). Użyj funkcji przycinania, aby powiększyć obszar zainteresowania. Zazwyczaj powiększenie ustawia się na ok. 70X (powiększenie można sprawdzić w zakładce „mode”). W zakładce „channels” zmień intensywność lasera dwufotonowego z ok. 9% transmisji na 15-20% transmisji.
6. Aby przeciąć akson, aktywuj przycisk „fast XY” na około 1 sekundę, a następnie naciśnij przycisk stop, aby uniknąć nadmiernych uszkodzeń. Jeśli procedura przebiegła pomyślnie, akson powinien być widoczny jako rozproszone szczątki.
7. Aby upewnić się, że akson został uszkodzony, przełącz się z powrotem na laser argonowy 488 nm, wykonaj kolejny obraz konfokalny i utwórz projekcję maksymalną.

Część 4: Konfokalne obrazowanie time-lapse na mikroskopie Zeiss LSM 510

1. Przygotowanie do obrazowania. W przypadku korzystania z podgrzewanego stolika należy go włączyć co najmniej 30 minut przed ustawieniem filmu time-lapse. Umieścić zamontowany embrion (lub embriony) w uchwycie do szkiełek pod mikroskopem. Ustawić ostrość na jednym embrionie przy użyciu wybranego obiektywu powietrznego. W tym przypadku stosujemy obiektyw 20X, 0.5 NA. Uruchomić oprogramowanie do obrazowania Zeiss LSM 510. Włączyć odpowiednie lasery i ustawić pożądaną konfigurację. Poniżej opisano szczegółowy protokół długoterminowego obrazowania z wykorzystaniem oprogramowania Zeiss LSM Multi Time. Metody te można dostosować do pracy na własnym mikroskopie z posiadanym oprogramowaniem do obrazowania.
2. Zdefiniowanie pozycji i konfiguracji pierwszego embrionu w oknie Multi Time. Otworzyć okna skanowania (scan), stolika (stage) oraz Multi Time. Aktywować funkcję fast scan w oknie skanowania. Przesunąć stolik do pożądanej pozycji XY. Zaznaczyć pierwszą i ostatnią pozycję Z w oknie skanowania. Nacisnąć stop, a następnie Mid, również w oknie skanowania. Odczekać do zakończenia skanowania środkowego przekroju Z, a następnie nacisnąć mark position w oknie stolika. Jeśli obrazowany jest tylko jeden embrion, należy kliknąć kartę „Single Location” w oknie Multi Time. Kliknąć „Replace XYZ”, a następnie „Save Configuration”. Potwierdzić nadpisanie poprzedniej konfiguracji. Przejść do kroku 4.4. W przypadku posiadania stolika zmechanizowanego można ustawić wiele lokalizacji w celu obrazowania wielu embrionów. W takim przypadku należy wybrać kartę „Multiple Locations” przed zdefiniowaniem współrzędnych XYZ i konfiguracji dla pierwszej lokalizacji. Należy również upewnić się, że w menu rozwijanym bezpośrednio pod kartą „Multiple Locations” wybrano location 1, a w sekcji konfiguracji menu rozwijane wskazuje multi loc 1, przed kliknięciem save configuration.
3. Zdefiniowanie pozycji i konfiguracji pozostałych embrionów w oknie Multi Time. Zlokalizować kolejny embrion, nacisnąć fast scan, przesunąć stolik do pożądanej pozycji XY i zaznaczyć pierwszą oraz ostatnią pozycję Z w oknie skanowania. Nacisnąć stop, a następnie Mid, również w oknie skanowania. Odczekać do zakończenia skanowania środkowego przekroju Z, a następnie nacisnąć mark position w oknie stolika. Kliknąć „Replace XYZ”. Sprawdzić, czy w menu rozwijanym pod kartą „Multiple Locations” wybrana jest lokalizacja 2 (location 2), a w sekcji konfiguracji menu rozwijane wskazuje multi loc 2, a następnie kliknąć „Save Configuration”. Potwierdzić nadpisanie poprzedniej konfiguracji. Powtórzyć ten proces dla pozostałych embrionów.
4. Ustawienie parametrów akwizycji obrazu w oknie Multi Loc. W sekcji „List of Blocks” wybrać opcję GR-G-L, a następnie wprowadzić pożądaną liczbę powtórzeń grupy. Jest to liczba razy, w których mikroskop konfokalny wykona obraz w każdej lokalizacji. W sekcji Parameters wprowadzić pożądany odstęp czasu (wait interval). Jest to czas od rozpoczęcia jednego powtórzenia obrazowania do rozpoczęcia następnego. W sekcji konfiguracji wybrać „ZStackXY”. W dolnej sekcji wprowadzić podstawową nazwę pliku. Kliknąć „Select Image DB” i wybrać plik mdb. Kliknąć przycisk „Options”. Wybrać folder mdb do zapisywania plików tymczasowych. Zaznaczyć opcje „keep final image open”, „save final image” oraz „middle of the z stack”. Wybrać wait interval. Kliknąć ok, aby zamknąć okno opcji. Kliknąć „start time”. Pozostawić okno Multi Time otwarte przez cały czas trwania obrazowania.
5. Analiza danych. Po zakończeniu obrazowania time-lapse oprogramowanie Multi Time skompiluje wszystkie pliki tymczasowe w plik podsumowujący dla każdej lokalizacji. Jeśli obrazowanie ma zostać przerwane przed zakończeniem, należy nacisnąć „Finish” zamiast „Stop”, aby utworzono plik podsumowujący. Pliki tymczasowe i podsumowujące powinny zostać automatycznie zapisane w wyznaczonym folderze mdb. Z menu oprogramowania LSM wybrać „3D View”, a następnie „Projection”. Po wybraniu pliku podsumowującego z menu rozwijanego kliknąć „Apply”. Wygeneruje to projekcje maksymalne stosu Z dla każdego obrazu konfokalnego. W menu oprogramowania LSM wybrać „File”, a następnie „Export”. Zapisać projekcje maksymalne jako serię plików tif. Z serii plików tif można następnie stworzyć film przy użyciu programu ImageJ lub QuickTime Pro. Aksony na obrazach LSM mogą być śledzone w trzech wymiarach za pomocą oprogramowania do analizy obrazu (np. NeuroLucida firmy MicroBrightfield) w celu uzyskania szczegółowych informacji ilościowych na temat morfologii aksonów.

Część 5: Reprezentatywne wyniki

Pomyślnie przeprowadzony eksperyment pozwoli na dokładne przedstawienie dynamiki komórkowej regeneracji aksonu po urazie. Embriony po obrazowaniu powinny pozostać zdrowe, bez widocznych oznak degeneracji i z silnym biciem serca. Aksotomia powinna spowodować precyzyjne uszkodzenie, przecinając wyłącznie określoną gałąź aksonu. Nie powinno dojść do uszkodzenia sąsiednich aksonów, a śmierć komórek powinna być minimalna. W około 50% eksperymentów obserwujemy śmierć pojedynczej komórki naskórka bezpośrednio nad miejscem aksotomii. W przypadku zaobserwowania większych uszkodzeń należy zoptymalizować protokół dwufotonowy zgodnie z opisem w sekcji dyskusji.

Dyskusja

Opisane metody wykorzystaliśmy do precyzyjnej aksotomii obwodowych aksonów sensorycznych oraz do bezpośredniej obserwacji regeneracji w żywym embrionie danio pręgowanego. Długoterminowe obrazowanie konfokalne typu time-lapse u danio pręgowanego może być stosowane do obserwacji wielu procesów rozwojowych in vivo. Opisana procedura aksotomii dwufotonowej może zostać zmodyfikowana w zależności od wielu różnych celów eksperymentalnych. Tę samą ogólną procedurę zastosowaliśmy do ablacji całych ciał komórek neuronów s...