Opisujemy sposób pomiaru dynamiki wapnia wewnątrzkomórkowego w pobliżu błony oraz w całej objętości komórki w hodowlach astrocytów, wykorzystując mikroskopię całkowitego wewnętrznego odbicia oraz epifluorescencyjną.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Pomiar dynamiki wapnia w pobliżu błony plazmatycznej oraz w całej przestrzeni wewnątrzkomórkowej astrocytów
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Mózg zawiera komórki glejowe. Od dawna wiadomo, że astrocyty, będące rodzajem komórek glejowych, pełnią pasywną rolę wspierającą dla neuronów. Jednak coraz więcej dowodów sugeruje, że astrocyty mogą również aktywnie uczestniczyć w funkcjonowaniu mózgu poprzez funkcjonalne interakcje z neuronami. Niemniej wiele fundamentalnych aspektów biologii astrocytów pozostaje kontrowersyjnych, niejasnych i/lub nieopisanych eksperymentalnie. Ważną kwestią jest dynamika wewnątrzkomórkowych przejściowych zmian stężenia wapnia w astrocytach. Ma to istotne znaczenie, ponieważ wapń jest uznany za ważny drugi przekaźnik, a ponadto wysunięto hipotezę, że wzrost stężenia wapnia w astrocytach może wywoływać uwalnianie z nich neurotransmiterów. Brakuje jednak szczegółowego lub satysfakcjonującego opisu sygnalizacji wapniowej w obrębie błony plazmatycznej astrocytów. Mikroskopia fluorescencyjna z całkownym wewnętrznym odbiciem (TIRF) jest potężnym narzędziem do analizy fizjologicznie istotnych zdarzeń sygnalizacyjnych w odległości około 100 nm od błony plazmatycznej żywych komórek. W niniejszej pracy wykorzystujemy mikroskopię TIRF i opisujemy sposób niemal symultanicznego monitorowania dynamiki wapnia w obrębie błony plazmatycznej oraz globalnej dynamiki wewnątrzkomórkowej. Dalsze dopracowanie i systematyczne zastosowanie tego podejścia może dostarczyć precyzyjnych informacji na temat sygnalizacji wapniowej astrocytów. Szczegółowe zrozumienie dynamiki wapnia w astrocytach może stanowić podstawę do wyjaśnienia, czy, w jaki sposób, kiedy i dlaczego astrocyty i neurony wchodzą w zależne od wapnia interakcje funkcjonalne.
Protokół
PROCEDURY EKSPERYMENTALNE
Procedura eksperymentalna składa się z dwóch kluczowych części, które opisano poniżej krok po kroku.
Część 1: PRZYGOTOWANIE KULTUR ASTROCYTÓW HIPOKAMPA
W skrócie, mieszane kultury astrocytów i neuronów hipokampa przygotowano zgodnie z dobrze ugruntowanym protokołem1,2,3. Zoptymalizowaliśmy procedurę w celu uzyskania zdrowych hodowlanych astrocytów. Wszystkie wymienione poniżej czynności powinny być przeprowadzane w środowisku sterylnym, np. w komorze z laminarnym przepływem powietrza.
Przygotowanie szkiełek nakrywkowych
- szkiełka nakrywki 22 mm (VWR, 48380-068)
- poly-D-lizyna (PDL, Sigma P0899), alikwoty (1 mg/ml)
- alikwoty lamininy (20 μg/ml): do roztworu lamininy 1 mg/ml (Sigma L2020) dodać 49 ml sterylnej wody, przygotować alikwoty po 1,2 ml i przechowywać w temperaturze -20°C
- Rozpuścić PDL w wodzie sterylnej (50 μg/ml)
- Autoklawować szkiełka nakładki, przepłukać wodą sterylną i umieścić w PDL (20 ml na 100 szkiełek). Pozostawić w temperaturze pokojowej przez noc.
- Zastąpić PDL wodą sterylną (3 dokładne płukania). Następnie osuszyć szkiełka i przechowywać w temperaturze 4°C.
- Dzień przed wysianiem astrocytów, umieścić poszczególne szkiełka nakładki w sterylnych dołkach płytki 6-dołkowej (Multiwell Flat-Bottom Plates with Lids, Sterile od BD Bioscience). Na każde szkiełko nanieść 400 μl lamininy i inkubować przez noc w inkubatorze, aby zapobiec odparowaniu.
Disekcja
Podłoża do sekcji:
- 500 ml zrównoważonego roztworu soli Earle'a (EBSS) (1X), ciecz (Invitrogen, 14155-063)
- 5 ml roztworu HEPES (Sigma, H0887)
Pożywka hipokampalna:
- 412,5 ml Minimum Essential Medium (MEM) (1X), roztwór zawiera sole Earle'a, ale nie zawiera L-glutaminy ani czerwieni fenolowej (Invitrogen, 51200-038)
- 10 ml glukozy (Sigma, D-(+)-GLUCOSE ANHYDROUS SIGMA ULTRA G7528) 1 M w MEM
- 5 ml Penicyliny-Streptomycyny (Invitrogen, 15140-122)
- 5 ml roztworu pirogronianu sodu (Sigma, S8636)
- 12,5 ml roztworu HEPES 1 M (Sigma, H0887)
- 5 ml suplementu N-2 (100X), roztwór (Invitrogen, 17502-048)
- 50 ml surowicy konia, inaktywowanej ciepłem (Invitrogen, 26050-088)
Roztwór papainy:
- Dodać 5 ml medium do dyssekcji do fiolki Worthington PAPAIN-022 (LK003178; stężenie końcowe 20 U/ml) i inkubować w temperaturze 37°C przez 60 min.
- Wykonaj dekapitację szczurek w wieku P1 (zazwyczaj 2 osobniki) zgodnie z wytycznymi zatwierdzonymi przez przepisy krajowe oraz lokalną Komisję ds. Dobrostanu i Opieki nad Zwierzętami (IACUC).
- Usuń skórę oraz czaszkę i umieść mózg w szalce Petri wypełnionej zimnym medium do sekcji.
- Usuń opony mózgowe, wypreparuj obie półkule, a następnie wypreparuj hipokampy.
- Pokrój hipokampy na fragmenty o rozmiarach ~1x1 mm i poddaj trawieniu w roztworze papainy w temperaturze 37°C przez 11-13 min.
- Gdy fragmenty tkanki osiądą, ostrożnie usuń papainę i dodaj 5 ml medium hipokampowego, aby usunąć wszelkie ślady enzymu. Powtórz ten krok, a następnie resuspenduj w medium hipokampowym (2 ml).
- Trituruj komórki około 5 razy, aż do całkowitego usunięcia grudek, używając trzech wypalanych pipet o progresywnie mniejszej średnicy otworu (1000 μm, ~500 μm i ~300 μm).
- Po trituracji przefiltruj komórki przez sitko do komórek (rozmiar oczek 70 μm, BD Bioscience). Policz komórki w 10 μl zawiesiny. Dostosuj objętość medium hipokampowego tak, aby uzyskać stężenie 400000 komórek/ml.
- Odsącz lamininę z szkiełek nakrywkowych i, zanim wyschną, nanieś 200 μl zawiesiny komórkowej na każde szkiełko.
- Pozostaw je na 60 min w inkubatorze w celu przytwierdzenia, a następnie dodaj 2 ml medium hipokampowego na każdą studnię.
- Następnego dnia odciągnij zużyte medium hipokampowe, aby usunąć martwe komórki i zanieczyszczenia, i dodaj 2 ml uprzednio ogrzanego, świeżego medium hipokampowego.
Konserwacja
Pożywka Neurobasal:
- 500 ml medium Neurobasal (Invitrogen, 12348-017)
- 10 ml suplement bezsurowiczy B27 (Invitrogen, 17504-044)
- 5 ml penicyliny-streptomycyny (Invitrogen, 15140-122)
- 1,25 ml L-glutaminy (Invitrogen, 25030-149)
Dokarmiaj hodowle astrocytów i neuronów dwa razy w tygodniu przy użyciu medium neurobasal, zaczynając cztery dni po wysianiu. Inkubuj medium wstępnie przez około 30 min w inkubatorze w wentylowanej kolbie w celu wyrównania temperatury i stężenia CO2.
Część 2: OBRAZOWANIE POZIOMU WAPNIA
Bufor do rejestracji z hipokampa: 110 mM NaCl, 5.4 mM KCl, 1.8 mM CaCl2, 0.8 mM MgCl2, 10 mM D-glucose, 10 mM HEPES (wszystkie odczynniki firmy Sigma) pH 7.4 (skorygowane za pomocą NaOH).
Wprowadzanie barwnika wskaźnika wapnia do astrocytów
- Umieścić kulturę w dołku płytki 6-dołkowej wypełnionej 2 ml buforu do rejestracji hipokampa zawierającego 2,5 μM Fluo-4, AM (Invitrogen, F-14217) i 0,05% 20% roztworu Pluronic® F-127 w DMSO (Invitrogen, P-3000MP) i inkubować w temperaturze pokojowej przez 10-30 min.
- Usunąć roztwór Fluo-4 i przemyć szkiełka nakrywkowe 3 razy buforem do rejestracji hipokampa, a następnie inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 min.
- Umieścić szkiełko nakrywowe w komorze i oczyścić drugą stronę szkiełka płynem do czyszczenia soczewek.
- Nałożyć jedną małą kroplę olejku imersyjnego (Immersion Oil TYPE DF od Cargille) na obiektyw i umieścić komorę (Open chamber for 25 mm round coverslip od Warner Instruments) na stole mikroskopu (Olympus IX71).
- Obejrzeć komórki w świetle przechodzącym, aby ocenić ich wygląd i ustawić ostrość. Następnie oświetlić komórki światłem o długości 488 nm z monochromatora (Polychrome V od TILL Vision) i sprawdzić, czy sygnał fluorescencji Fluo-4 w astrocytach jest jednorodny i wykrywalny.
- Użyć oświetlenia EPI i TIRF do pomiaru poziomu wapnia w astrocytach.
Mikroskopia TIRF
W skrócie, wykorzystujemy mikroskop Olympus IX71 wyposażony w kamerę EMCCD Andor IXON DV887DCS. Sterowanie wzbudzeniem i akwizycją obrazów odbywa się za pomocą oprogramowania TILLVision. Wiązki laserów argonowych 454/488/515 nm (100 mW) oraz laserów półprzewodnikowych 442 nm (45 mW) są łączone i kontrolowane za pomocą łącznika laserowego TILL Polyline, dwuportowego kondensora TIRF oraz akustyczno-optycznego filtru i kontrolera strojonego (AOTF; wszystkie od TILL Photonics), a następnie wprowadzane do szerokopasmowego włókna Kineflex w celu dostarczenia ich do kondensora TIRF. Do uzyskania efektu TIRF stosujemy obiektyw Olympus 60X 1.45 NA. Wzmocnienie sygnału w kamerze jest dostrajane dla każdego astrocytu, aby uzyskać obrazy o najlepszym stosunku sygnału do szumu. Podstawy i zasady mikroskopii TIRF zostały niedawno opisane w przeglądach literatury4, 5. Większość użytych komponentów optycznych została zakupiona w firmie TILL Photonics, która obecnie jest częścią Agilent Technologies (http://www.till-photonics.com/). Głębokość penetracji TIR można obliczyć z poniższych równań.
d = głębokość penetracji
n1 = współczynnik załamania światła szkła
n2 = współczynnik załamania światła komórki
a = kąt padania
NAi = apertura numeryczna padania
Aby upewnić się, że laser jest optymalnie ustawiony do TIRF, pomocne jest obserwowanie fluorescencyjnych kulek o średnicy 100 nm (Invitrogen, F8803). Przedstawiamy nieruchome klatki oraz filmy z kulek obrazowanych za pomocą mikroskopii EPI i TIRF. W trybie TIRF obserwuje się gwałtowny wzrost stosunku sygnału do szumu, a kulki wykazują dyfuzję Browna. Regularna obserwacja zachowania kulek 100 nm za pomocą mikroskopii TIRF (około raz w tygodniu) jest przydatna, aby mieć pewność, że zachodzi optymalny efekt TIRF, a nie niepełne oświetlenie skośne, które wystąpiłoby, gdyby kąt krytyczny nie był równy α (patrz Rys. 1).
Zastosowanie agonistów receptorów sprzężonych z białkiem G
Astrocyty wykazują ekspresję różnorodnych receptorów sprzężonych z białkiem Gq6, 7, w tym metabotropowych receptorów glutaminianu oraz receptorów P2Y (agoniści: ATP, ADP). Aktywacja tych receptorów prowadzi do znacznego wzrostu wewnątrzkomórkowego poziomu wapnia w astrocytach. Przykładowo, można łatwo zaobserwować wzrost stężenia wapnia wewnątrzkomórkowego podczas aplikacji ATP (30 μM) do astrocytów8-10. Wykorzystujemy szybki przełącznik roztworów firmy Warner Instruments, zwany VC-77SP Fast-Step Perfusion System (http://www.warneronline.com/index.cfm). Dzięki tej metodzie roztwory mogą być aplikowane w czasie krótszym niż ~10 ms.
RYSUNEK 1. Schemat i fotografie układu obrazowania. A. Przedstawia fotografię mikroskopu zamontowanego na stole pneumatycznym, natomiast (B) pokazuje fotografię zestawu laserowego, sterowników i skrzynek wiązki. C. Przedstawia fotografię stolika mikroskopowego z zamontowaną komorą do obrazowania. Po lewej stronie widoczne jest urządzenie do szybkiej perfuzji (wraz z silnikiem krokowym i przewodami theta). Po prawej stronie widoczna jest głowica wzmacniacza Axopatch 200A. Schemat ilustruje drogę światła w układzie oraz sposób uzyskania TIRF. Laser jest ogniskowany na tylnej płaszczyźnie ogniskowej obiektywu 60X 1,45 NA, a jego pozycja jest przesunięta względem centrum, tak aby wchodził do olejku imersyjnego pod kątem krytycznym α. W tym punkcie wiązka ulega całkowitemu wewnętrznemu odbiciu i zanika wraz z odległością λ (patrz równanie w tekście głównym) w ośrodku o niższym współczynniku załamania. W tym przypadku jest to bufor rejestracyjny otaczający astrocyt oraz same astrocyty. Wynikiem jest wzbudzenie optyczne (a tym samym obrazowanie) cząsteczek znajdujących się w odległości ~100 nm od błony komórkowej. Na schemacie komórki jest to przedstawione jako zielone „wzbudzone” receptory błonowe, podczas gdy te wewnątrz komórki lub na jej górnej powierzchni nie są wzbudzone. Pełny opis mikroskopii TIRF został przedstawiony przez Steyera i Almersa4.
RYSUNEK 2. Obrazy 100 nm fluorescencyjnych kulek uzyskane za pomocą mikroskopii EPI oraz TIRF. A. Przedstawia obrazy EPI pola widzenia z kilkudziesięcioma 100 nm fluorescencyjnymi kuleczkami. Czerwone strzałki wskazują kuleczki, które osiądąły na szklanej lamellce, podczas gdy niebieskie groty strzałek wskazują kuleczki dyfundujące w wodzie. B. Przedstawia obraz TIRF tego samego pola widzenia, co na rysunku A. W tym widoku widoczne są tylko przylegające kuleczki wskazane czerwonymi strzałkami. Wynika to z faktu, że osiądąły one na szklanej lamellce i znajdowały się zatem w obrębie pola ewanescentnego o zasięgu ~100 nm. Kuleczki pokazane na rysunku A niebieskimi strzałkami nie znajdują się w tym obszarze, przez co są niewidoczne na obrazach TIRF. Dolne wykresy przedstawiają renderowanie 3D obrazów. Wyraźnie widać, że w przypadku kuleczek w polu ewanescentnym obserwowanych za pomocą mikroskopii TIRF następuje znaczny wzrost stosunku sygnału do szumu. W rzeczywistości dla tych obrazów stosunek sygnału do szumu dla EPI wynosił 7,1 ± 0,6, natomiast dla TIRF wynosił on 20 ± 0,7.
RYSUNEK 3. Obrazy astrocytów obciążonych wskaźnikiem wapnia Fluo-4, uzyskane za pomocą mikroskopii EPI i TIRF. A. Obrazy EPI pola widzenia zawierającego pięć astrocytów. B. Obraz TIRF tego samego pola widzenia przedstawionego w B. Należy zauważyć, że obrazy w A i B znacznie się od siebie różnią. Wynika to z faktu, że przy oświetleniu TIRF obrazowane są tylko regiony błony plazmatycznej znajdujące się w bliskim sąsiedztwie szklanego szkiełka cover slip. Dolne panele przedstawiają wywołane przez ATP przejściowe wzrosty stężenia wapnia wewnątrzkomórkowego, zobrazowane za pomocą mikroskopii EPI i TIRF.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Jest dobrze udokumentowane, że astrocyty wykazują wzrosty stężenia wewnątrzkomórkowego wapnia. Zjawiska te występują spontanicznie lub mogą być wywoływane przez aktywność neuronalną bądź przez aplikację agonistów aktywujących receptory na powierzchni astrocytów11. Ważną i kontrowersyjną kwestią jest to, czy wewnątrzkomórkowe wzrosty stężenia wapnia w astrocytach mogą wywoływać uwalnianie cząsteczek sygnałowych, które aktywują receptory w neuronach11, 12. Kwestia ta pozostaje sporna, ponieważ istniej...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Podziękowania
Praca ta była wspierana przez japońską fundację Uehara Memorial Foundation (dla ES), a także przez Whitehall Foundation, National Institute of Neurological Disorders and Stroke oraz nagrodę Stein-Oppenheimer Endowment Award (dla BSK).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze | |
|---|---|---|---|---|
| VWR® szkiełka nakrywkowe, okrągłe, nr 1 | Narzędzie | VWR International | 48380-068 | |
| Hydrobromek poli-D-lizyny | Odczynnik | Sigma-Aldrich | P0899 | |
| Laminina z błony podstawnej mięsaka mysiego Engelbreth-Holm-Swarm | Odczynnik | Sigma-Aldrich | L2020 | |
| Earle’zrównoważony roztwór soli Earle'a (EBSS) (1X), ciecz | Odczynnik | Invitrogen | 14155-063 | |
| Minimum Essential Medium (MEM) (1X), roztwór. Zawiera Earle’solem, ale bez L-glutaminy i czerwieni fenolowej | Odczynnik | Invitrogen | 51200-038 | |
| roztwór penicyliny i streptomycyny | Odczynnik | Invitrogen | 15140-122 | |
| Roztwór pirogronianu sodu | Odczynnik | Sigma-Aldrich | S8636 | |
| roztwór HEPES 1 M | Odczynnik | Sigma-Aldrich | H0887 | |
| Suplement N-2 (100X), ciecz | Odczynnik | Invitrogen | 17502-048 | |
| Surowica końska, inaktywowana termicznie | Odczynnik | Invitrogen | 26050-088 | |
| PAPAIN-022 | Odczynnik | Worthington Biochemical | LK003178 | |
| Neurobasal™ Pożywka (1X) płynna bez czerwieni fenolowej | Odczynnik | Invitrogen | 12348-017 | |
| Suplement bezsurowiczy B-27 (50X), ciecz | Odczynnik | Invitrogen | 17504-044 | |
| L-glutamina 200 mM (100X), roztwór | Odczynnik | Invitrogen | 25030-149 | |
| Sita do oddzielania komórek | Narzędzie | BD Biosciences | 352350 | |
| Sterylne wielodołkowe płytki z płaskim dnem i pokrywkami BD Falcon | Narzędzie | BD Biosciences | 353046 | |
| NaCl | Odczynnik | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| KCl | Odczynnik | Sigma-Aldrich | P3911 | |
| CaCl22 heksahydrat | Odczynnik | Sigma-Aldrich | 21108 | |
| MgCl₂2 heksahydrat | Odczynnik | Sigma-Aldrich | M2670 | |
| kwas HEPES | Odczynnik | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| D-(+)-glukoza | Odczynnik | Sigma-Aldrich | G7528 | |
| roztwór Fluo-4, AM o stężeniu 1 mM w DMSO | Odczynnik | Invitrogen | F-14217 | |
| Pluronic® 20% roztwór F-127 w DMSO | Odczynnik | Invitrogen | P-3000MP | |
| Olejek imersyjny TYPU DF | Mikroskop | Cargill Labs | 16242 | |
| Otwarta komora do okrągłych szkiełek nakrywkowych 25 mm, 100 szt. μobjętość | Narzędzie | Warner Instruments | 64-0362 (RC-21BDW) | |
| Platforma P-2 dla komór serii 20, bez grzałki | Narzędzie | Warner Instruments | 64-0278 (P-2) | |
| mikrosfery FluoSpheres modyfikowane karboksylowo, 0,1 μm, żółto-zielone fluorescencyjne (505/515) 2% ciało stałe | Odczynnik | Invitrogen | F8803 |
Bibliografia
- Richler, E., Chaumont, S., Shigetomi, E., Sagasti, A., Khakh, B. S. An approach to image activation of transmitter-gated P2X receptors in vitro and in vivo. Nature Methods. 5, 87-93 (2008).
- Granseth, B., Odermatt, B., Royle, S. J., Lagnado, L. Clathrin-mediated endocytosis is the dominant mechanism of vesicle retrieval at hippocampal synapses. Neuron. 51, 773-786 (2006).
- Nunez, J. Primary culture of hippocampal neurons from P0 newborn rats. J Vis Exp. 19, (2008).
- Steyer, J. A., Almers, W. A real-time view of life within 100 nm of the plasma membrane. Nat Rev Mol Cell Biol. 2, 268-275 (2001).
- Jaiswal, J. K., Fix, M., Takano, T., Nedergaard, M., Simon, S. M. Resolving vesicle fusion from lysis to monitor calcium-triggered lysosomal exocytosis in astrocytes. Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 14151-14156 (2007).
- Araque, A., Carmignoto, G., Haydon, P. G. Dynamic signalling between astrocytes and neurons. Annu Rev Physiol. 63, 795-813 (2001).
- Haydon, P. G. GLIA: listening and talking to the synapse. Nat Rev Neurosci. 2, 185-193 (2001).
- Bowser, D. N., Khakh, B. S. ATP excites interneurons and astrocytes to increase synaptic inhibition in neuronal networks. J Neurosci. 24, 8606-8620 (2004).
- Bowser, D. N., Khakh, B. S. Two forms of astrocyte single vesicle exocytosis imaged with total internal reflection fluorescence microscopy. Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 4212-4217 (2007).
- Bowser, D. N., Khakh, B. S. Vesicular ATP is the predominant cause of intercellular calcium waves in astrocytes. J Gen Physiol. 129, 485-491 (2007).
- Agulhon, C. What is the role of astrocyte calcium in neurophysiology. Neuron. 59, 932-946 (2008).
- Barres, B. A. The mystery and magic of glia: a perspective on their roles in health and disease. Neuron. 60, 430-440 (2008).
- Lee, S. Y., Haydon, P. G. Astrocytic glutamate targets NMDA receptors. J Physiol. 581, 887-888 (2007).
- Shigetomi, E., Bowser, D. N., Sofroniew, M. V., Khakh, B. S. Two forms of astrocyte calcium excitability have distinct effects on NMDA receptor-mediated slow inward currents in pyramidal neurons. J Neurosci. 28, 6659-6663 (2008).
- Cahoy, J. D. A transcriptome database for astrocytes, neurons, and oligodendrocytes: a new resource for understanding brain development and function. J Neurosci. 28, 264-278 (2008).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
