Opisujemy sposób pomiaru dynamiki wapnia wewnątrzkomórkowego w pobliżu błony oraz w całej objętości komórki w hodowlach astrocytów, wykorzystując mikroskopię całkowitego wewnętrznego odbicia oraz epifluorescencyjną.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Pomiar dynamiki wapnia w pobliżu błony plazmatycznej oraz w całej przestrzeni wewnątrzkomórkowej astrocytów
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Mózg zawiera komórki glejowe. Od dawna wiadomo, że astrocyty, będące rodzajem komórek glejowych, pełnią pasywną rolę wspierającą dla neuronów. Jednak coraz więcej dowodów sugeruje, że astrocyty mogą również aktywnie uczestniczyć w funkcjonowaniu mózgu poprzez funkcjonalne interakcje z neuronami. Niemniej wiele fundamentalnych aspektów biologii astrocytów pozostaje kontrowersyjnych, niejasnych i/lub nieopisanych eksperymentalnie. Ważną kwestią jest dynamika wewnątrzkomórkowych przejściowych zmian stężenia wapnia w astrocytach. Ma to istotne znaczenie, ponieważ wapń jest uznany za ważny drugi przekaźnik, a ponadto wysunięto hipotezę, że wzrost stężenia wapnia w astrocytach może wywoływać uwalnianie z nich neurotransmiterów. Brakuje jednak szczegółowego lub satysfakcjonującego opisu sygnalizacji wapniowej w obrębie błony plazmatycznej astrocytów. Mikroskopia fluorescencyjna z całkownym wewnętrznym odbiciem (TIRF) jest potężnym narzędziem do analizy fizjologicznie istotnych zdarzeń sygnalizacyjnych w odległości około 100 nm od błony plazmatycznej żywych komórek. W niniejszej pracy wykorzystujemy mikroskopię TIRF i opisujemy sposób niemal symultanicznego monitorowania dynamiki wapnia w obrębie błony plazmatycznej oraz globalnej dynamiki wewnątrzkomórkowej. Dalsze dopracowanie i systematyczne zastosowanie tego podejścia może dostarczyć precyzyjnych informacji na temat sygnalizacji wapniowej astrocytów. Szczegółowe zrozumienie dynamiki wapnia w astrocytach może stanowić podstawę do wyjaśnienia, czy, w jaki sposób, kiedy i dlaczego astrocyty i neurony wchodzą w zależne od wapnia interakcje funkcjonalne.
Protokół
PROCEDURY EKSPERYMENTALNE
Procedura eksperymentalna składa się z dwóch kluczowych części, które opisano poniżej krok po kroku.
Część 1: PRZYGOTOWANIE KULTUR ASTROCYTÓW HIPOKAMPA
W skrócie, mieszane kultury astrocytów i neuronów hipokampa przygotowano zgodnie z dobrze ugruntowanym protokołem1,2,3. Zoptymalizowaliśmy procedurę w celu uzyskania zdrowych hodowlanych astrocytów. Wszystkie wymienione poniżej czynności powinny być przeprowadzane w środowisku sterylnym, np. w komorze z laminarnym przepływem powietrza.
Przygotowanie szkiełek nakrywkowy....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Jest dobrze udokumentowane, że astrocyty wykazują wzrosty stężenia wewnątrzkomórkowego wapnia. Zjawiska te występują spontanicznie lub mogą być wywoływane przez aktywność neuronalną bądź przez aplikację agonistów aktywujących receptory na powierzchni astrocytów11. Ważną i kontrowersyjną kwestią jest to, czy wewnątrzkomórkowe wzrosty stężenia wapnia w astrocytach mogą wywoływać uwalnianie cząsteczek sygnałowych, które aktywują receptory w neuronach11, 12. Kwestia ta pozostaje sporna, ponieważ istniej.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Podziękowania
Praca ta była wspierana przez japońską fundację Uehara Memorial Foundation (dla ES), a także przez Whitehall Foundation, National Institute of Neurological Disorders and Stroke oraz nagrodę Stein-Oppenheimer Endowment Award (dla BSK).
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze | |
|---|---|---|---|---|
| VWR® szkiełka nakrywkowe, okrągłe, nr 1 | Narzędzie | VWR International | 48380-068 | |
| Hydrobromek poli-D-lizyny | Odczynnik | Sigma-Aldrich | P0899 | |
| Laminina z błony podstawnej mięsaka mysiego Engelbreth-Holm-Swarm | Odczynnik | Sigma-Aldrich | L2020 | |
| Earle’zrównoważony roztwór soli Earle'a (EBSS) (1X), ciecz | Odczynnik | Invitrogen | 14155-063 | |
| Minimum Essential Medium (MEM) (1X), roztwór. Zawiera Earle’solem, ale bez L-glutaminy i czerwieni fenolowej | Odczynnik | Invitrogen | 51200-038 | |
| roztwór penicyliny i streptomycyny | Odczynnik | Invitrogen | 15140-122 | |
| Roztwór pirogronianu sodu | Odczynnik | Sigma-Aldrich | S8636 | |
| roztwór HEPES 1 M | Odczynnik | Sigma-Aldrich | H0887 | |
| Suplement N-2 (100X), ciecz | Odczynnik | Invitrogen | 17502-048 | |
| Surowica końska, inaktywowana termicznie | Odczynnik | Invitrogen | 26050-088 | |
| PAPAIN-022 | Odczynnik | Worthington Biochemical | LK003178 | |
| Neurobasal™ Pożywka (1X) płynna bez czerwieni fenolowej | Odczynnik | Invitrogen | 12348-017 | |
| Suplement bezsurowiczy B-27 (50X), ciecz | Odczynnik | Invitrogen | 17504-044 | |
| L-glutamina 200 mM (100X), roztwór | Odczynnik | Invitrogen | 25030-149 | |
| Sita do oddzielania komórek | Narzędzie | BD Biosciences | 352350 | |
| Sterylne wielodołkowe płytki z płaskim dnem i pokrywkami BD Falcon | Narzędzie | BD Biosciences | 353046 | |
| NaCl | Odczynnik | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| KCl | Odczynnik | Sigma-Aldrich | P3911 | |
| CaCl22 heksahydrat | Odczynnik | Sigma-Aldrich | 21108 | |
| MgCl₂2 heksahydrat | Odczynnik | Sigma-Aldrich | M2670 | |
| kwas HEPES | Odczynnik | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| D-(+)-glukoza | Odczynnik | Sigma-Aldrich | G7528 | |
| roztwór Fluo-4, AM o stężeniu 1 mM w DMSO | Odczynnik | Invitrogen | F-14217 | |
| Pluronic® 20% roztwór F-127 w DMSO | Odczynnik | Invitrogen | P-3000MP | |
| Olejek imersyjny TYPU DF | Mikroskop | Cargill Labs | 16242 | |
| Otwarta komora do okrągłych szkiełek nakrywkowych 25 mm, 100 szt. μobjętość | Narzędzie | Warner Instruments | 64-0362 (RC-21BDW) | |
| Platforma P-2 dla komór serii 20, bez grzałki | Narzędzie | Warner Instruments | 64-0278 (P-2) | |
| mikrosfery FluoSpheres modyfikowane karboksylowo, 0,1 μm, żółto-zielone fluorescencyjne (505/515) 2% ciało stałe | Odczynnik | Invitrogen | F8803 |
Bibliografia
- Richler, E., Chaumont, S., Shigetomi, E., Sagasti, A., Khakh, B. S. An approach to image activation of transmitter-gated P2X receptors in vitro and in vivo. Nature Methods. 5, 87-93 (2008).
- Granseth, B., Odermatt, B., Royle, S. J., Lagnado, L.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
