Procedura transplantacji nerki u myszy

Podsumowanie

Przeszczepianie nerek u myszy jest procedurą wymagającą technicznie, która w celu odniesienia sukcesu wymaga starannej opieki i leczenia pooperacyjnego.

Streszczenie

Ortotopowa transplantacja nerek u myszy jest procedurą wymagającą pod względem technicznym. Chociaż pierwsze przeszczepy nerek u myszy zostały wykonane przez Russella i wsp. ponad 30 lat temu (1) i udoskonalone przez Zhanga i wsp. kilka lat później (2), niewielu badaczy na świecie opanowało tę procedurę. W naszym laboratorium z sukcesem przeprowadziliśmy 1200 ortotopowych przeszczepów nerek przy przeżywalności > 90%. Kluczowe aspekty sukcesu obejmują rygorystyczną kontrolę uszkodzeń reperfuzyjnych, krwawienia i zakrzepicy, zarówno w trakcie zabiegu, jak i po transplantacji, a także zastosowanie nici chirurgicznej 10-0 zamiast 11-0 do wykonywania anastomoz.

Opieka pooperacyjna i leczenie biorcy są niezwykle istotne dla powodzenia i oceny przeszczepu. Wszyscy biorcy przeszczepów nerek otrzymują antybiotyki w postaci wstrzyknięcia penicyliny bezpośrednio po transplantacji oraz sulfatrim w wodzie pitnej w sposób ciągły. Ogólny stan zdrowia zwierząt jest oceniany codziennie, a rutynowo przeprowadza się analizy poziomu kreatyniny w krwi pełnej za pomocą przenośnego urządzenia I-STAT w celu oceny funkcji przeszczepu.

Protokół

Pobieranie organu od dawcy (2):

1. Zanurzyć dawcę w narkozie, podając 65mg/kg pentobarbitalu IP; znieczulenie utrzymuje się za pomocą izofluranu (2-3%).
2. Wyonać cięcie w linii środkowej od mostka do spojenia łonowego, aby dostać się do jamy brzusznej dawcy i odsłonić lewą nerkę, przesuwając jelita bocznie na prawą stronę.
3. Wyizolować lewą nerkę poprzez podwiązanie i przecięcie naczyń nadnerczowych i jawowych za pomocą jedwabnej nici 8-0.
4. Zmobilizować aortę powyżej jej połączenia z tętnicą i żyłą nerkową.
5. Zmobilizować żyłę główną dolną (IVC) powyżej i poniżej jej połączenia z tętnicą i żyłą nerkową.
6. Podwiązać aortę poniżej tętnicy i żyły nerkowej jedwabną nicią 8-0, aby zminimalizować krwawienie.
7. Wypreparować lewy moczowód od wnęki nerkowej do pęcherza.
8. Odsłonić odejście moczowodu do pęcherza, stosując retrakcję kopuły pęcherza w kierunku ogonowym.
9. Wyciąć niewielki, eliptyczny fragment pęcherza zawierający lewe odejście moczowodu do pęcherza, który zostanie wykorzystany do rekonstrukcji układu moczowego poprzez anastomozę pęcherz-pęcherz. Prawy moczowód nie jest włączany do fragmentu pęcherza.
10. Podwiązać IVC poniżej tętnicy i żyły nerkowej jedwabną nicią 8-0.
11. Podwiązać aortę powyżej tętnicy i żyły nerkowej, a następnie powoli przepłukać przeszczep in situ 0,2-0,4ml zimnego, heparynowanego roztworu mleczanu Ringera poprzez aortę podnerkową.
12. Podwiązać IVC powyżej tętnicy i żyły nerkowej jedwabną nicią 8-0.
13. Przeciąć żyłę nerkową w miejscu jej połączenia z IVC.
14. Przeciąć aortę skośnie, około 2mm poniżej tętnicy nerkowej.
15. Usunąć nerkę wraz z unaczynieniem i moczowodem przytwierdzonym do fragmentu pęcherza en bloc. Przechowywać w roztworze mleczanu Ringera na lodzie.
16. Uśmiercić mysz dawcę poprzez zwichnięcie szyi w stanie znieczulenia.

Przeszczep do biorcy (2):

1. Zanurzyć biorcę w narkozie, podając 65 mg/kg pentobarbitalu IP, a następnie podtrzymać znieczulenie izofluranem (2-3%).
2. Wyonać nacięcie w linii środkowej, przykryć jelita mokrą gazą i ostrożnie odsunąć je na lewą stronę.
3. Podwiązać prawym moczowód, tętnicę i żyłę nerkową, a następnie usunąć prawą nerkę.
4. Ostrożnie wyizolować i zapiąć zaciskami naczyniowymi 4-mm aortę podnerkową oraz IVC po uprzednim podwiązaniu gałęzi lędźwiowych.
5. Przewlec szew nylonowy 10-0 przez pełną grubość aorty i odciągnąć, aby wykonać eliptyczną aortotomię za pomocą jednego cięcia (około jedna piąta średnicy naczynia).
6. Wyonać podłużną wenotomię, przebijając IVC igłą 30 G i odpowiednio rozszerzając otwór za pomocą mikronożyczek.
7. Przepłukać aortę i IVC solą fizjologiczną z dodatkiem heparyny w celu usunięcia krwi lub skrzepów z wnętrza naczynia.
8. Wyjąć nerkę dawcy z lodu i umieścić ją w jamie brzusznej w prawym boku myszy. Nerkę dawcy należy utrzymywać w wilgoci za pomocą chłodnego gazika nasączonego solą fizjologiczną.
9. Założyć dwa szwy stabilizujące w proksymalnym i dystalnym wierzchołku aortotomii biorcy wraz z mankietem aorty dawcy.
10. Wykonać anastomozę koniec-bok między mankietem aorty dawcy a przednią ścianą aortotomii biorcy, stosując 2 ~ 3 ciągłe szwy nylonowe 10-0 na zewnątrz aorty.
11. Przenieść przeszczep nerki dawcy na lewy bok biorcy. Powtórzyć poprzednią procedurę między mankietem aorty dawcy a tylną ścianą aortotomii biorcy.
12. Wykonać anastomozę koniec-bok między żyłą nerkową dawcy a tylną ścianą IVC biorcy, stosując 4 do 5 ciągłych szwów nylonowych 10-0 wewnątrz IVC. Następnie zamknąć przednią ścianę IVC i żyłę nerkową dawcy za pomocą 4 ~ 5 ciągłych szwów na zewnątrz IVC.
13. Anastomoza zarówno żyły, jak i tętnicy musi zostać zakończona w ciągu 20 minut.
14. W czasie anastomozy kilkakrotnie płukać przeszczep zimną solą fizjologiczną.
15. Przeciąć kopułę pęcherza moczowego biorcy i zatamować krwawienie za pomocą kauteryzacji.
16. Wykonać niewielkie nacięcie na kopule.
17. Założyć dwa szwy stabilizujące z nylonu 10-0, aby zespolić niewielki płat pęcherza dawcy z kopułą pęcherza biorcy. Każda strona anastomozy zostaje zszyta 8 ~ 10 szwami ciągłymi.
18. Zamknąć jamę brzuszną w dwóch warstwach za pomocą ciągłego, sterylnego, syntetycznego wchłanialnego szwu Vicryl 4-0.
19. W trakcie operacji podawać myszom biorcom 0,4 ml ciepłej soli fizjologicznej poprzez przerywane wstrzykiwanie IV.

Opieka pooperacyjna nad biorcą

1. Po zamknięciu jamy brzusznej podaje się pojedynczy zastrzyk penicyliny (500U/10g) domięśniowo (2).
2. Dodatkowo, w celu uśmierzenia bólu, biorcy otrzymują 0,05 mg/kg buprenorfiny domięśnio w dniu 0 i w 1. dobie po operacji. Po zabiegu biorcy przeszczepu otrzymują wodę z dodatkiem sulfatrimu (100mg/kg) aż do zakończenia eksperymentu.
3. Przez pierwsze 24 h po operacji myszy są utrzymywane w inkubatorze z kontrolowaną temperaturą.
4. Myszy zazwyczaj budzą się z narkozy w ciągu godziny od operacji, po czym zapewnia się im regularny dostęp do pokarmu i wody ad libitum.
5. Szwy skórne usuwa się 2 tygodnie po operacji.

Nefrektomia biorcy

1. Zanurzyć biorcę w narkozie od 4 do 7 dni po transplantacji nerki, podając 65 mg/kg pentobarbitalu drogą dosytroniczną (IP); znieczulenie podtrzymać przy użyciu izofluranu (2-3%).
2. Otworzyć jamę brzuszną poprzez nacięcie w linii środkowej.
3. Przykryć jelita gazą nasączoną solą fizjologiczną i ostrożnie odsunąć je na prawą stronę.
4. Usunąć lewą nerkę po podwiązaniu lewego moczowodu, żyły oraz tętnicy nerkowej.
5. Zamknąć jamę brzuszną w dwóch warstwach, stosując szew ciągły z syntetycznej wchłanialnej nici vicryl 4-0.

Pomiary kreatyniny w krwi pełnej

1. Raz w tygodniu lub raz na dwa tygodnie pobiera się mniej niż 0.2 cc krwi, albo drogą podżuchwową bez znieczulenia, albo drogą retroorbitalną w znieczuleniu izofluranem.
2. Ilościowe stężenie kreatyniny w krwi pełnej jest oznaczane przy użyciu przenośnego analizatora klinicznego I-Stat (Heska Corp., Fort Collins, CO).
3. Jednostki konwencjonalne (mg/dl) przelicza się na jednostki SI (micromol/L), mnożąc wartość w jednostkach konwencjonalnych przez 88.4.

Dyskusja

Przeprowadziliśmy około 1200 przypadków transplantacji nerek u myszy, osiągając wskaźnik sukcesu technicznego wynoszący >90%. W porównaniu z transplantacją serca, wskaźnik sukcesu transplantacji nerek jest zazwyczaj niski. Niemniej jednak nasze laboratorium utrzymuje wysoki wskaźnik sukcesu (> 90%) w przypadku transplantacji nerek. Kluczowymi czynnikami warunkującymi sukces są ograniczenie obrażeń reperfuzyjnych zarówno w nerkach dawcy, jak i u biorcy, a także minimalizacja krwawienia i zakrzepicy w trakcie zabiegu...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
i-STAT	Inne	HESKA	Cat 5101
Wkład i-STAT	Inne	HESKA	CAT 5110-CREA
Sulfatrim	Inne	Actavis	R02109
Izofluran	Inne	NOVAPLUS	CA-0474
Nici chirurgiczne 10-0	Chirurgia	Sharpoint	AK0100