Pomiar długości życia Caenorhabditis elegans na podłożach stałych

Podsumowanie

W niniejszym artykule przedstawiamy ogólny protokół pomiaru długości życia nicieni utrzymywanych na pożywkach stałych z bakteriami zneutralizowanymi za pomocą promieniowania UV.

Streszczenie

Starzenie się jest procesem degeneracyjnym charakteryzującym się postępującym pogarszaniem stanu komponentów komórkowych i organelli, co prowadzi do śmierci. NicielCaenorhabditis eleganswyłonił się jako główny model wykorzystywany do badania biologii starzenia. Ponieważ niemal każdy podsystem biologiczny ulega spadkowi funkcjonalnemu wraz ze wzrostem wieku, długość życia jest głównym punktem końcowym zainteresowania przy rozważaniu całkowitego tempa starzenia. U nicieni długość życia jest zazwyczaj definiowana jako liczba dni, przez które zwierzę pozostaje reaktywne na bodźce zewnętrzne. Nicienie mogą być rozmnażane zarówno w mediach płynnych, jak i na mediach stałych na szalkach, a opracowano techniki pomiaru długości życia w obu tych warunkach. Przedstawiamy tutaj uogólniony protokół pomiaru długości życia nicieni hodowanych na stałych mediach wzrostowych dla nicieni i karmionych dietą składającą się z bakterii zabitych promieniami UV. Procedury te można łatwo dostosować do oceny długości życia w różnych powszechnych warunkach, w tym przy diecie składającej się z żywych bakterii, restrykcji kalorycznej oraz interferencji RNA.

Protokół

Część 1: Przygotowanie płytek z pożywką do wzrostu nicieni (NGM)

W tej sekcji opisano przygotowanie stałych płytek NGM do wykorzystania w eksperymencie określającym długość życia. Podstawowy eksperyment dotyczący długości życia wymaga dwóch rodzajów płytek: standardowych płytek NGM, które nie zawierają dodatków, oraz płytek Amp/FUDR, do których w podłożu NGM dodano ampicylinę (Amp) i fluorodeoksyurydynę (FUDR). Ampicylina jest stosowana w celu zapobiegania zanieczyszczeniom obcymi bakteriami. FUDR hamuje podziały komórkowe, zmniejsza produkcję jaj i zapobiega ich wykluwaniu. Zastosowanie FUDR w analizie długości życia nie wpływa na czas życia osobników dorosłych i eliminuje konieczność przenoszenia nicieni co kilka dni w celu oddzielenia ich od rozwijających się larw. Oba rodzaje płytek są zaszczepiane bakteriami E. coli OP50, które są następnie zabijane poprzez ekspozycję na promieniowanie UV.

1. Przygotuj NGM (patrz sekcja 5 w celu uzyskania receptury i uwag dotyczących przechowywania) i opisz szalki Petriego. Będzie potrzebna jedna szalka 60 mm na każde 10 mL NGM. W przypadku korzystania z wcześniej przygotowanego stałego NGM przejdź do kroku 1.2. W przypadku korzystania ze świeżo autoklawowanego NGM przejdź do kroku 1.4.
2. Całkowicie rozpuść stały NGM, podgrzewając go w kuchence mikrofalowej na wysokiej mocy w 30-sekundowych impulsach. Między impulsami delikatnie mieszaj pożywkę, aby zapobiec gromadzeniu się pęcherzyków gazu pod ciśnieniem.
3. Umieść ciekły NGM w kąpieli wodnej o temperaturze 55 °C lub na blacie w celu schłodzenia.
4. Gdy NGM osiągnie temperaturę 55 °C, dodaj 33 µL FUDR o stężeniu 150 mM oraz 100 µL ampicyliny o stężeniu 100 mg/mL na każde 100 mL NGM (dla szalek Amp/FUDR) i wymieszaj przez delikatne kołysanie. W przypadku szalek NGM bez dodatkowych leków przejdź bezpośrednio do kroku 1.5.
5. Stosując technikę sterylną, pipetuj 10 mL NGM do każdej szalki Petriego 60 mm. Jeśli to możliwe, unikaj tworzenia pęcherzyków powietrza. Jeśli pęcherzyki powstaną, można je przebić końcówką pipety.
6. Pozostaw szalki na blacie z zamkniętymi pokrywkami, aby NGM mógł stężeć i wyschnąć. Jeśli to możliwe, pozostaw szalki na blacie przez 2 dni przed dodaniem bakterii, choć 1 dzień będzie wystarczający, jeśli szalki są potrzebne szybciej.
7. W dniu poprzedzającym zakończenie schnięcia szalek, zaszczep płynną kulturę LB pojedynczą kolonią bakterii E. coli OP50 z świeżego posiewu na agarze LB. Należy przygotować co najmniej 1 mL nocnej kultury OP50 na każdą szalkę 60 mm.
8. Umieść kulturę OP50 w inkubatorze z wytrząsaniem w temperaturze 37 °C i pozwól bakteriom rosnąć przez noc (kultura powinna osiągnąć fazę nasycenia).
9. Odwirować bakterie OP50 w celu uzyskania osadu, wirując przy 3 500 g przez 10 minut.
10. Usuń 90% supernatantu i resuspenduj bakterie, aby skoncentrować kulturę 10-krotnie.
11. Pipetuj 100 µL 10-krotnie skoncentrowanej kultury OP50 na środek stężałych szalek NGM. W razie potrzeby delikatnie zakręć szalkami, aby rozprowadzić kulturę bakterii (idealnie bakterie powinny pokryć obszar centralny NGM, nie zbliżając się do ścianek szalki). Staraj się nie dotykać końcówką pipety powierzchni NGM, ponieważ uszkodzenia powierzchni pożywki umożliwiają nicieniom wgryzanie się w NGM.
12. Pozostaw szalki na blacie przez noc, aby kultura bakterii wyschła na stałym NGM (zazwyczaj trwa to około 24 godzin).
13. Po wyschnięciu poddaj powierzchnię szalek dawce UV wystarczającej do zahamowania wzrostu bakterii. W przypadku korzystania z urządzenia Stratagene UV Stratalinker 2400:
    • Umieść szalki w urządzeniu Stratalinker i zdejmij pokrywki
    • Zamknij drzwiczki i włącz Stratalinker
    • Naciśnij „Energy”
    • Wprowadź „9999” za pomocą klawiatury
    • Naciśnij „Start”
    • Szalki będą naświetlane promieniowaniem UV przez około 5 minut
14. Szalki z bakteriami zabitymi promieniami UV można przechowywać do góry dnem w temperaturze 4 °C przez maksymalnie 1 miesiąc.

Część 2: Wykonanie kontrolowanego czasowo składania jaj w celu uzyskania populacji zwierząt zsynchronizowanej pod względem wieku

W tej sekcji generujemy populację nicieni o wspólnej dacie wyklucia. Osiąga się to poprzez umożliwienie reprodukcyjnie aktywnym osobnikom dorosłym składania jaj na szalce przez określony czas, a następnie umożliwienie rozwoju tych jaj.

1. (Opcjonalnie) Przenieś około 20 młodych dorosłych nicieni na świeżą płytkę NGM bez FUDR. Pozostaw płytki w temperaturze 25 °C, aby umożliwić nicieniom rozmnażanie się i zjedzenie całego pokarmu bakteryjnego. Po skonsumowaniu pokarmu bakteryjnego nowo wyklute nicienie wejdą w stadium dauer, w którym wzrost zostaje zatrzymany. Larwy dauer powinny pojawić się w ciągu tygodnia, w zależności od liczby nicieni przeniesionych początkowo na płytkę. Larwy dauer mogą być wykorzystywane w kolejnych etapach przez maksymalnie 1 miesiąc.
2. (Opcjonalnie) Przenieś od 20 do 30 larw dauer na świeżą płytkę NGM bez FUDR. W obecności pokarmu larwy dauer w ciągu 2 dni staną się reprodukcyjnie aktywnymi osobnikami dorosłymi i pozostaną takimi przez kilka kolejnych dni w temperaturze 25 °C.
3. Przenieś od 10 do 15 reprodukcyjnie aktywnych osobników dorosłych na świeżą płytkę NGM bez FUDR. Płytka ta jest określana jako płytka do czasowego składania jaj (TEL).
4. Pozostaw płytkę TEL w temperaturze 25 °C przez 6 godzin, aby nicienie miały czas na złożenie jaj.
5. Usuń dorosłe nicienie z płytki TEL. Przed usunięciem osobników dorosłych można wizualnie sprawdzić obecność jaj na płytce. Jeśli nicienie nie złożyły wystarczającej liczby jaj, płytkę TEL można pozostawić w temperaturze 25 °C łącznie przez maksymalnie 24 godziny przed usunięciem dorosłych nicieni.
6. Przechowuj płytkę TEL w temperaturze 20 °C do czasu wyklucia się jaj i rozwoju nicieni do stadium larwalnego L4 (zazwyczaj trwa to 2 dni dla typu dzikiego C. elegans, lecz może potrwać dłużej w przypadku szczepów z fenotypem spowolnionego rozwoju).

Część 3: Ocena długości życia zwierząt

W tej sekcji śledzimy zsynchronizowaną pod względem wieku populację nicieni z części 2 aż do ich śmierci. Nicienie są utrzymywane na płytkach Amp/FUDR, aby zapobiec produkcji jaj oraz kontaminacji bakteryjnej; uznaje się je za martwe, gdy przestają reagować na bodźce zewnętrzne.

1. Przenieś larwy w stadium L4 na posiane płytki Amp/FUDR. Dla każdego badanego szczepu lub warunku zazwyczaj przygotowuje się 2-3 płytki z 25-30 niciami na płytkę. Zdjęcia stadiów życiowych C. elegans zamieszczono w celu odniesienia (Rysunek 1).¹
2. Umieść płytki Amp/FUDR w temperaturze 20 °C na 24 godziny.
3. Po 24 godzinach dokonaj wizualnej oceny nicieni, podłoża i bakterii. Przenieś nicienie na świeże płytki Amp/FUDR, jeśli zaobserwowano którykolwiek z poniższych punktów:
   • Nicienie zjadły większość pożywki bakteryjnej. Na wczesnym etapie eksperymentu nad długością życia nicienie będą musiały być przenoszone 1 do 2 razy w tygodniu, aby zapobiec wyczerpaniu bakterii.
   • Obecna jest znaczna liczba larw. Zazwyczaj wskazuje to, że nicienie zostały przeniesione na płytki Amp/FUDR jako młode dorosłe osobniki zamiast w stadium L4 i zdążyły złożyć jaja, zanim FUDR zaczął działać. FUDR zazwyczaj zapobiega wzrostowi larw do pełnej dojrzałości, ale sporadycznie kilka osobników może stać się dorosłymi, co może prowadzić do pomyłek z zwierzętami doświadczalnymi.
   • Obserwowane są żywe/rosnące bakterie. Zazwyczaj kombinacja Amp i sterylizacji promieniami UV zapewnia, że żadne żywe bakterie nie zanieczyszczą eksperymentu, jednak zdarza się to sporadycznie.
   • Na podłożu zaobserwowano wzrost grzybów. Jeśli zostanie on wykryty wystarczająco wcześnie, wzrost grzybów można zazwyczaj wyciąć za pomocą końcówki pipety lub szpatułki. Gdy wzrost przekroczy kilka milimetrów średnicy, zazwyczaj łatwiej jest przenieść nicienie na nową płytkę.
   • Używając stereomikroskopu, określ, czy każdy nicień jest żywy czy martwy.
   • Delikatnie stuknij w płytkę. Nicień jest żywy, jeśli porusza się w odpowiedzi na stuknięcie.
   • Jeśli nicień nie reaguje na stuknięcie w płytkę, powiększ obszar głowy.
   • Delikatnie dotknij głowy nicienia platynową igłą transferową. Uznaj nicienia za martwego, jeśli nie reaguje ruchem głowy.
   • Martwe nicienie można usunąć z płytki.
4. Zapisz datę oraz liczbę nicieni żywych i martwych.
5. Wróć płytki do temperatury 20 °C.
6. Powtarzaj kroki od 3.3 do 3.6 co 2 do 3 dni, aż wszystkie nicienie wyginą.

Część 4: Reprezentatywne wyniki.

Surowe dane uzyskane z eksperymentu nad długością życia nicieni to lista dat z odpowiadającymi im liczbami żywych i martwych osobników dla każdego badanego szczepu. Liczbę nicieni, które giną każdego dnia, zazwyczaj odwraca się, aby obliczyć proporcję nicieni żyjących w każdym dniu (Rysunek 2A), co przedstawia się graficznie w postaci krzywej przeżywalności (Rysunek 2B; dzień zsynchronizowanego składania jaj uznaje się za dzień 0). Długość życia każdego pojedynczego nicienia w badaniu można obliczyć na podstawie liczby osobników ginących każdego dnia, co służy do wyznaczenia średniej i mediany długości życia w celu porównania szczepów. Liczba nicieni żyjących każdego dnia nie jest wykorzystywana bezpośrednio w analizie długości życia. Nicienie utrzymywane na podłożach stałych mogą sporadycznie „uciekać”, czyli pełznąć w górę ścianki płytki lub zapadać się pod podłoże. Liczbę nicieni żyjących każdego dnia można wykorzystać do ustalenia, ile osobników uciekło w trakcie trwania eksperymentu. Nicienie, które uciekną, są zazwyczaj wykluczane z analizy. Jako punkt odniesienia, typowa mediana długości życia dla N2, szczepu dzikiego C. elegans, utrzymywanego na bakteriach zabitych promieniami UV w temperaturze 20 °C, wynosi około 25 dni, licząc od stadium jaja.

Część 5: Roztwory

Pożywka do wzrostu nicieni (NGM), 100 mL:
Połączyć:
0.3 g	NaCl
0.25 g	Pepton
2 g	Agar
Autoklawować przez 40 minut i schłodzić do 55 °C, a następnie dodać:
100 µL	1 M MgSO4
100 µL	5 mg/mL cholesterolu
100 µL	1 M CaCl2
1.625 mL	1.5 M KPi pH 6.0
ciekła pożywka NGM może być użyta natychmiast do wlewania szalek lub pozostawiona do zastygnięcia i przechowywana długoterminowo w temperaturze pokojowej

Pożywka Luria-Bertani (LB), 1 l:
10 g	BactoTryptone
5 g	Ekstrakt drożdżowy
10 g	NaCl
10 mL	1 M Tris pH 8,0
1 L	woda dejonizowana
Autoklawować i przechowywać w temperaturze pokojowej.

1 M MgSO4, 300 mL:
73,95 g	MgSO4
300 mL	woda dejonizowana
Autoklawować i przechowywać w temperaturze pokojowej.

5 mg/mL cholesterolu, 200 mL:
1 g	cholesterol
200 ml	100% etanol
Przefiltruj w celu sterylizacji i przechowuj w temperaturze pokojowej.

1 M CaCl22, 500 ml:
27,75 g	CaCl22
500 ml	woda dejonizowana
Przefiltrować w celu sterylizacji i przechowywać w temperaturze pokojowej.

1,5 M KI pH 6,0, 1 L:
Połącz:
31,4 g	fosforan potasu zasadowy
179,6 g	KPi jednobazowy
850 ml	woda dejonizowana
Podgrzewać podczas mieszania, aby KPi rozpuściło się w roztworze. Doprowadzić pH do wartości 6,0 za pomocą 10 N NaOH.
Dopełnić wodą dejonizowaną do objętości 1 L.
Autoklawować i przechowywać w temperaturze pokojowej.

1 M Tris, pH 8,0:
60,57 g	Tris
400 ml	woda dejonizowana
Dostosować pH do wartości 8,0 za pomocą HCl.
Dopełnić wodą dejonizowaną do objętości 500 ml.
Przesiączować przez filtr sterylizujący i przechowywać w temperaturze pokojowej.

150 mM fluorodeoksyurydyny (FUDR), 10 ml:
0,3693 g	FUDR
10 ml	sterylna woda dejonizowana
Przechowywać w temperaturze -20 °C.

100 mg/ml ampicyliny (Amp), 10 ml:
1 g	Ampicylina
10 ml	sterylna woda dejonizowana
Przechowywać w temperaturze -20 °C.

50 mg/mL karbenicyliny (Carb), 10 mL:
500 mg	Karbencylinia
10 mL	sterylna woda dejonizowana
Przechowywać w temperaturze -20 °C.

1 M izopropyl-β-D-tiogalaktopiranozyd (IPTG), 10 mL:
2,38 g	IPTG
10 mL	sterylna woda dejonizowana
Przechowywać w temperaturze -20 °C.

Rycina 1. Obrazy w jasnym polu ukazujące stadia życiowe C. elegans, w tym jajo, cztery stadia larwalne (L1 – L4) oraz osobnika dorosłego. Wszystkie panele przedstawiają hermafrodyty z wyjątkiem dolnego prawego, który ukazuje dorosłego samca (obraz z publikacji Wood (1988)).

Rycina 2. Reprezentatywne wyniki z *C. elegans* eksperyment nad długością życia porównujący szczep dziki N2 ze szczepem zawierającym mutację w daf-2 gen. (A) Tabela przedstawiająca zebrane dane, w tym liczbę dni od momentu, gdy nicienie były w stadium jaj, liczbę martwych nicieni zaobserwowanych każdego dnia oraz procent pierwotnej próby, która pozostała przy życiu każdego dnia (obliczony na podstawie dziennych zliczeń martwych nicieni). (B) Krzywe przeżywalności odpowiadające danym dotyczącym długości życia przedstawionym w punkcie (A).

Rycina 3. Reprezentatywne porównanie poziomu lipofuscyny u młodych i starych dorosłych osobników C. elegans. Po lewej stronie przedstawiono obrazy w polu jasnym, a po prawej obrazy fluorescencyjne w kanale DAPI. Górne panele pokazują 4-dniowego nicienia, a dolne panele nicienia w wieku 11 dni (licząc od stadium jaja).

Dyskusja

Genetyczna kontrola długości życia była szeroko badana u C. elegans, głównie ze względu na łatwość i szybkość, z jaką można określić długość życia. Protokół omówiony w tym artykule opisuje podstawowe ramy pozwalające na uzyskanie powtarzalnych danych dotyczących długości życia u C. elegans i może być również stosowany u spokrewnionych gatunków nicieni.² Poprzez wprowadzenie kilku prostych zmian procedury te można dostosować do pomiaru długości życia w różnych warunkach. Omówimy tutaj kilka po...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Agar	Odczynnik	Fisher Scientific	DF0145-17-0 (214530)
Ampicylina	Odczynnik	MidSci	0339
BactoTryptone	Odczynnik	Fisher Scientific	DF0123-17-3 (211705)
BactoPeptone	Odczynnik	Fisher Scientific	DF0118-17-0 (211677)
CaCl2	Odczynnik	Fisher Scientific	NC9699248 (1332-01)
Karbenicylina	Odczynnik	Gold Biotechnology	C0109
Cholesterol	Odczynnik	Sigma-Aldrich	C75209
Fluorodeoksyurydyna (FUDR)	Odczynnik	Sigma-Aldrich	F0503
Izopropyl β-d-tiogalaktopiranozyd (IPTG)	Odczynnik	Gold Biotechnology	I2481C5
KPi zasadowy	Odczynnik	Fisher Scientific	5087862 (3252-01)
KPi jednododatkowy	Odczynnik	Fisher Scientific	5087861 (3246-01)
MgSO4	Odczynnik	Fisher Scientific	NC9561800 (2500-01)
NaCl	Odczynnik	Fisher Scientific	S251
Tris	Odczynnik	Sigma-Aldrich	T1503
Ekstrakt drożdżowy	Odczynnik	Fisher Scientific	DF0886-17-0 (288620)