Pomiar długości życia Caenorhabditis elegans na nośnikach stałych

Podsumowanie

W tym artykule przedstawiamy ogólny protokół pomiaru długości życia nicieni utrzymywanych na podłożu stałym z użyciem pokarmu bakteryjnego zabijanego przez promieniowanie UV.

Streszczenie

Starzenie się to proces degeneracyjny, charakteryzujący się postępującą degradacją składników komórkowych i organelli, prowadzącą do śmiertelności. Nicienie Caenorhabditis elegans stały się głównym modelem wykorzystywanym do badania biologii starzenia. Ponieważ praktycznie każdy podsystem biologiczny ulega funkcjonalnemu spadkowi wraz ze wzrostem wieku, długość życia jest głównym punktem zainteresowania przy rozważaniu całkowitego tempa starzenia. U nicieni długość życia jest zazwyczaj definiowana jako liczba dni, w których zwierzę pozostaje wrażliwe na bodźce zewnętrzne. Nicienie mogą być rozmnażane zarówno w medium ciekłym, jak i na podłożu stałym na płytach, a opracowano techniki pomiaru żywotności w obu tych warunkach. Przedstawiamy tutaj ogólny protokół pomiaru długości życia nicieni utrzymywanych na stałym nośniku wzrostu nicieni i karmionych bakteriami zabijanymi przez promieniowanie UV. Procedury te można łatwo dostosować do oceny długości życia w różnych typowych warunkach, w tym w diecie składającej się z żywych bakterii, ograniczeń dietetycznych oraz interferencji RNA.

Protokół

Część 1: Przygotowanie płytek do wzrostu nici nicieni (NGM)

Ta sekcja opisuje przygotowanie stałych płyt NGM do wykorzystania w eksperymencie dotyczącym długości życia. Podstawowy eksperyment z żywotnością wymaga dwóch typów płyt: standardowych płytek NGM, które nie zawierają dodatków, oraz płyt Amp/FUDR, do których do NGM dodano zarówno ampicylinę (Amp), jak i fluorodeoksyurydynę (FUDR). Ampicylina jest stosowana do zapobiegania zakażeniu bakteriami obcymi. FUDR hamuje podział komórkowy, ogranicza produkcję jaj i zapobiega wykluciu się jaj. Stosowanie FUDR do analizy długości życia nie wpływa na długość życia dorosłych i eliminuje potrzebę przenoszenia robaków co kilka dni, aby oddzielić je od rosnących larw. Oba typy płytek są zasiane bakterią E. coli OP50, która następnie jest niszczona przez działanie promieni UV.

1. Przygotuj NGM (patrz sekcja 5, gdzie znajdziesz notatki dotyczące przepisów i przechowywania) i oznaczaj talerze Petriego. Będziesz potrzebować 1 płytki Petriego o średnicy 60 mm na każde 10 mL NGM. Jeśli zaczynasz od wcześniej przygotowanego solidnego NGM, kontynuuj krok 1.2. Jeśli zaczynasz od świeżo zautoklawowanego NGM, przejdź do kroku 1.4.
2. Całkowicie roztopić stałe NGM przez podgrzewanie w mikrofalówce na wysokim poziomie w 30-sekundowych impulsach. Mieszaj medium między impulsami, aby zapobiec gromadzeniu się pęcherzyków gazu pod ciśnieniem.
3. Umieść płynny NGM w kąpieli wodnej o temperaturze 55 °C lub na stole, aby ostygła.
4. Gdy NGM osiągnie 55 °C, dodaj 33 μL 150 mM FUDR i 100 μL ampicyliny 100 mg/mL na 100 mL NGM (dla płyt Amp/FUDR) i mieszaj w celu wymieszania. Dla płytek NGM bez dodatkowych leków przejdź bezpośrednio do kroku 1,5.
5. Stosując technikę sterylną, pipetuj 10 mL NGM do każdej płytki Petriego o średnicy 60 mm. Unikaj tworzenia bąbelków, jeśli to możliwe. Jeśli powstaną bąbelki, można je przebić końcówką pipety.
6. Zostaw talerze na stole z pokrywkami, aby NGM mogła się stwardzić i wyschnąć. Jeśli to możliwe, zostaw talerze na stole przez 2 dni przed dodaniem bakterii, ale 1 dzień wystarczy, jeśli płytki będą potrzebne wcześniej.
7. Dzień przed zakończeniem wysychania płyt, nasiono w płynnej hodowli LB z pojedynczą kolonią świeżego śladu bakterii E. coli OP50 na agarze LB. Powinieneś przygotować co najmniej 1 ml nocnej hodowli OP50 na płytkę 60 mm.
8. Umieść hodowlę OP50 w shakerze 37 °C i pozwól bakteriom rosnąć przez noc (hodowla powinna osiągnąć nasycenie).
9. Pellet bakterii OP50, wirując przy 3 500 g przez 10 minut.
10. Usuń 90% supernatantu i ponownie zawiesij bakterie, aby skoncentrować hodowlę 10 razy.
11. Pipeta 100 μL 10x skoncentrowanej kultury OP50 do środka stwardniałych płytek NGM. Delikatnie mieszaj płytki, aby rozprowadzić kulturę bakterii, jeśli zajdzie taka potrzeba (idealnie bakterie powinny pokrywać centralną część NGM, nie zbliżając się do ścian płyt). Staraj się unikać dotykania końcówki pipety z powierzchnią NGM, ponieważ niedoskonałości powierzchni ośrodka pozwalają robakom wnikać do NGM.
12. Zostaw płytki na stole na noc, aby pozwolić wyschnąć kulturze bakterii na stałym NGM (zazwyczaj trwa około 24 godzin).
13. Po wyschnięciu wystaw powierzchnię płytek na dawkę UV wystarczającą, by zatrzymać rozwój bakterii. Jeśli używasz Stratagene UV Stratalinker 2400:
    • Włóż talerze do Stratalinkera i zdejmij pokrywki
    • Zamknij drzwi i włącz Stratalinker
    • Naciśnij 'Energy'
    • Wprowadź '9999' za pomocą klawiatury
    • Naciśnij 'start'
    • Płyty będą wystawione na promieniowanie UV przez około 5 minut
14. Płytki z bakteriami zabijanymi promieniami UV można przechowywać do góry nogami w temperaturze 4 °C przez nawet 1 miesiąc.

Część 2: Wykonaj znoszenie jaj na czas, aby pozyskać populację zwierząt zsynchronizowaną z wiekiem

W tej sekcji generujemy populację robaków o wspólnej dacie wyklucia. Osiąga się to, pozwalając aktywnym rozrodczo osobnikom składać jaja na talerzu przez określony czas i pozwalając im się rozwijać.

1. (Opcjonalnie) Przenieś około 20 młodych dorosłych robaków na świeżą płytkę NGM bez FUDR. Zostaw talerze w temperaturze 25 °C, aby dżdżownice mogły się rozprzestrzenić i zjadać cały pokarm bakteryjny. Po spożyciu pokarmu bakteryjnego nowo wyklute robaki wchodzą w stadium zatrzymanego wzrostu dauer. Larwy dauera zaczniesz widzieć w ciągu tygodnia, w zależności od tego, ile robaków przeniesiesz na płytkę. Larwa Dauera może być używana do kolejnych etapów do miesiąca.
2. (Opcjonalnie) Przenieś larwy 20 do 30 dauer na świeżą płytkę NGM bez FUDR. W obecności pokarmu larwy dauerów stają się dorosłe osobniki aktywne rozrodczo w ciągu 2 dni i pozostają aktywne rozrodczo przez kilka kolejnych dni w temperaturze 25 °C.
3. Przenieś 10 do 15 aktywnych dorosłych osobników rozrodczych na świeżą płytkę NGM bez FUDR. Ta tablica nazywana jest tablicą do składania jaj z czasem (TEL).
4. Zostawić płytkę TEL w temperaturze 25 °C przez 6 godzin, aby dżdżownice miały czas złożyć jaja.
5. Usuń dorosłe robaki z płyty TEL. Płytki można wizualnie sprawdzić pod kątem jaj przed usunięciem dorosłych osobników. Jeśli robaki nie złożą wystarczającej liczby jaj, płytka TEL może być pozostawiona w temperaturze 25 °C przez łącznie do 24 godzin przed usunięciem dorosłych robaków.
6. Umieść płytkę TEL w temperaturze 20 °C, aż jaja się wyklują, a robaki nie osiągną stadium larwalnego L4 (zwykle trwa to 2 dni u dzikich typów C. elegans, ale może to trwać dłużej u szczepów o fenotypach o wolnym rozwoju).

Część 3: Ocena zwierząt pod kątem długości życia

W tej sekcji śledzimy zsynchronizowaną wiekowo populację robaków od części 2 aż do ich śmierci. Robaki są przechowywane na płytkach Amp/FUDR, aby zapobiec produkcji jajeczek i zakażeniu bakteryjnym, a są uważane za martwe, gdy nie reagują na bodźce zewnętrzne.

1. Przenieś larwę L4 na zasiane płytki Amp/FUDR. Dla każdego testowanego odkształcenia lub schorzenia zazwyczaj przygotowuje się 2-3 płyty po 25-30 robaków na płytę. Obrazy stadij życiowych C. elegans są udostępnione jako odniesienie (Rysunek 1). ¹
2. Umieść płytki Amp/FUDR w temperaturze 20 °C przez 24 godziny.
3. Po 24 godzinach oceń wizualnie robaki, podłoże i bakterie. Przenieś robaki na świeże płyty Amp/FUDR, jeśli zaobserwuje się którykolwiek z następujących objawów:
   • Robaki zjadły większość pokarmu bakteryjnego. Na początku eksperymentu robaki będą musiały być przenoszone 1 do 2 razy w tygodniu, aby zapobiec ich wyczerpaniu.
   • Obecna jest znaczna liczba larw. Zazwyczaj oznacza to, że robaki zostały przeniesione na płytki Amp/FUDR jako młode dorosłe osoby, a nie jako L4, i były w stanie złożyć kilka jaj przed wejściem FUDR. FUDR zazwyczaj uniemożliwia larwam rozwój w pełnoprawne dorosłe osobniki, ale czasem kilka z nich dorasta w dorosłe i myli się z zwierzętami doświadczalnymi.
   • Obserwuje się żywe lub rosnące bakterie. Zazwyczaj połączenie Amp i UV zabijających sprawia, że żadne żywe bakterie nie zanieczyszczą eksperymentu, choć czasami się to zdarza.
   • Na podłożu obserwuje się wzrost grzybów. Jeśli wykryje się to wystarczająco wcześnie, wzrost grzybów można zwykle wyciąć za pomocą końcówki pipety lub łopatki. Gdy robaki urosną do średnicy powyżej kilku milimetrów, zwykle łatwiej jest przenieść robaki na nową płytę.
   • Za pomocą mikroskopu secekcyjnego określ, czy każdy robak jest żywy czy martwy.
   • Delikatnie stuknij w talerz. Robak żyje, jeśli porusza się w odpowiedzi na stukanie.
   • Jeśli robak nie reaguje na stuknięcie w płytkę, przybliż okolicę głowy.
   • Delikatnie stuknij głowę robaka platynowym kostką transferowym. Oceń robaka jako martwego, jeśli nie zareaguje ruchem głowy.
   • Martwe robaki można usunąć z płyty.
4. Zanotuj datę oraz liczbę żywych i martwych robaków.
5. Płyty przywróć do 20 °C.
6. Powtarzaj kroki od 3,3 do 3,6 co 2-3 dni, aż wszystkie robaki zginą.

Część 4: Reprezentatywne wyniki.

Surowe dane uzyskane w eksperymencie długości życia nicieni to lista dat z odpowiadającą liczbą żywych i martwych robaków dla każdego testowanego szczepu. Liczba robaków, które giną każdego dnia, jest zazwyczaj odwrócona, aby obliczyć odsetek żywych robaków w danym dniu (Rysunek 2A), co jest graficznie przedstawione jako krzywa przetrwania (Rysunek 2B; dzień znoszenia jaj w określonym czasie uważany jest za dzień 0). Długość życia każdego pojedynczego robaka w badaniu można obliczyć na podstawie liczby umierających dżdżownic każdego dnia i wykorzystać do obliczenia średniej oraz mediany długości życia w celu porównania szczepów. Liczba żywych robaków każdego dnia nie jest bezpośrednio wykorzystywana w analizie długości życia. Robaki utrzymywane na solidnym podłożu czasami "uciekają" lub pełzają po ścianie płytki lub pod podłożem. Liczba żywych robaków każdego dnia może posłużyć do określenia, ile robaków uciekło w trakcie eksperymentu. Robaki, które uciekły, są zazwyczaj usuwane z analizy. Jako punkt odniesienia, typowa mediana życia N2, szczepu typu dzikiego C . elegans , utrzymywana na bakteriach zabijanych promieniowaniem UV w temperaturze 20 °C, wynosi około 25 dni mierzonych z jaja.

Część 5: Rozwiązania

Medium wzrostu nicieni (NGM), 100 mL:
Mieszać:
0,3 g	NaCl
0,25 g	Peptone
2 g	Agar
Złóż w autoklawie przez 40 minut i pozwól ostygnąć do 55 °C, następnie dodać:
100 μL	1 M MgSO4
100 μL	5 mg/mL cholesterolu
100 μL	1 M CaCl2
1,625 mL	1,5 M KPi pH 6,0
Ciekłe NGM można natychmiast użyć do wylewania płyt lub pozwolić na zastygnięcie i długotrwałe przechowywanie w temperaturze pokojowej

Bulion z Lurii (LB), 1L:
10 g	Bactotrypton
5 g	Ekstrakt drożdżowy
10 g	NaCl
10 mL	1 M Tris pH 8,0
1 L	Dejonizowana
Zautoklawuj i przechowuj w temperaturze pokojowej.

1 M MgSO4, 300 mL:
73,95 g	MgSO4
300 mL	Dejonizowana
Zautoklawuj i przechowuj w temperaturze pokojowej.

5 mg/mL cholesterolu, 200 mL:
1 g	cholesterol
200 mL	100% etanol
Przefiltruj, sterylizuj i przechowuj w temperaturze pokojowej.

1 M CaCl2 500 mL:
27,75 g	CaCl2
500 mL	Dejonizowana
Przefiltruj, sterylizuj i przechowuj w temperaturze pokojowej.

1,5 M KPi pH 6,0, 1L:
Mieszać:
31,4 g	KPi dibasic
179,6 g	KPi monobasic
850 mL	Dejonizowana
Podgrzewaj podczas mieszania, aby KPi rozpuściło się w roztworze. Zreguluj pH do 6,0 przy 10 N NaOH.
Dodaj wodę dejonizowaną do 1 L.
Zautoklawuj i przechowuj w temperaturze pokojowej.

1 M Tris, pH 8,0:
60,57 g	Tris
400 mL	Dejonizowana
Ustaw pH do 8,0 z HCl.
Dodaj wodę dejonizowaną do 500 mL.
Przefiltruj, sterylizuj i przechowuj w temperaturze pokojowej.

150 mM fluorodeoksyurydyny (FUDR), 10 mL:
0,3693 g	FUDR
10 mL	Sterylna woda dejonizowana
Przechowywać w -20 °C.

100 mg/mL ampicyliny (amper), 10 mL:
1 g	Ampicyliny
10 mL	Sterylna woda dejonizowana
Przechowywać w -20 °C.

50 mg/mL karbenicyliny (węglowodany), 10 mL:
500 mg	Karbenicylina
10 mL	Sterylna woda dejonizowana
Przechowywać w -20 °C.

1 M izopropylowego β-d-tiogalaktopyranozydu (IPTG), 10 mL:
2,38 g	IPTG
10 mL	Sterylna woda dejonizowana
Przechowywać w -20 °C.

Rysunek 1. Jasne obrazy polowe stadij życia C. elegans , w tym jaj, czterech larwalnych stadiów (L1 – L4) oraz dorosłych. Wszystkie panele przedstawiają hermafrodyty, z wyjątkiem prawego dolnego rogu, gdzie widać dorosłego samca (Zdjęcie z Wood (1988)).

Rysunek 2. Reprezentatywne wyniki eksperymentu długości życia C. elegans , porównującego szczep dzikiego typu N2 z szczepem zawierającym mutację w genie daf-2 . (A) Tabela pokazująca zebrane dane, w tym liczbę dni od momentu zaliczenia jaj robaków, liczbę martwych robaków obserwowanych każdego dnia oraz procent oryginalnej próbki pozostającej przy życiu każdego dnia (obliczany na podstawie dziennych liczb martwych robaków). (B) Krzywe przeżycia odpowiadające danym o długości życia podane w (A).

Rysunek 3. Reprezentatywne porównanie lipofuscyny między młodymi a starszymi dorosłymi C. elegans. Obrazy jasnego pola są wyświetlane po lewej, a z kanału DAPI po prawej. Górne panele pokazują 4-dniowego robaka, a dolne 11-dniowego robaka (mierzonego od jajka).

Dyskusja

Genetyczna kontrola długowieczności była szeroko badana u C. elegans, głównie ze względu na łatwość i szybkość, z jaką można określić długość życia. Protokół omówiony w tym artykule opisuje podstawowe ramy pozyskiwania powtarzalnych danych o długości życia u C. elegans i może być również stosowany do spokrewnionych gatunków nicieni. ² Dzięki prostym modyfikacjom procedury te można dostosować do pomiaru długości życia w różnych warunkach. Omówimy tutaj kilka powszechnych wariantów, w tym żywe ...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Agar	Odczynnik	Fisher Scientific	DF0145-17-0 (214530)
Ampicyliny	Odczynnik	MidSci	0339
Bactotrypton	Odczynnik	Fisher Scientific	DF0123-17-3 (211705)
BactoPeptone	Odczynnik	Fisher Scientific	DF0118-17-0 (211677)
CaCl2	Odczynnik	Fisher Scientific	NC9699248 (1332-01)
Karbenicylina	Odczynnik	Złota Biotechnologia	C0109
Cholesterol	Odczynnik	Sigma-Aldrich	C75209
Fluorodeoksyurydyna (FUDR)	Odczynnik	Sigma-Aldrich	F0503
Izopropyl β-d-Tiogalaktoforynozyd (IPTG)	Odczynnik	Złota Biotechnologia	I2481C5
KPi Dibasic	Odczynnik	Fisher Scientific	5087862 (3252-01)
KPi Monobasic	Odczynnik	Fisher Scientific	5087861 (3246-01)
MgSO4	Odczynnik	Fisher Scientific	NC9561800 (2500-01)
NaCl	Odczynnik	Fisher Scientific	S251
Tris	Odczynnik	Sigma-Aldrich	T1503
Ekstrakt drożdżowy	Odczynnik	Fisher Scientific	DF0886-17-0 (288620)