Obrazowanie na żywo migracji komórek glejowych w tarczceImaginal oka Drosophila

Podsumowanie

W niniejszej pracy opisujemy protokół badania migracji komórek glejowych do rozwijającego się oka Drosophila za pomocą analizy mikroskopowej żywych tkanek z wykorzystaniem komórek glejowych znakowanych GFP.

Streszczenie

Komórki glejowe organizmów kręgowców i bezkręgowców muszą migrować do docelowych obszarów, aby otoczyć osłonkami i wspierać powiązane z nimi neurony. Chociaż w ostatnim czasie poczyniono postępy w opisie migracji żywych komórek glejowych w rozwijającym się skrzydle poczwarki (1), badania nadDrosophilabadania nad migracją komórek glejowych zazwyczaj opierały się na analizie utrwalonych tkanek. Mikroskopowa analiza żywych, ruchliwych komórek umożliwia badanie zachowania komórkowego w trakcie całego procesu migracji, w tym określanie szybkości i zmian kierunku wzrostu. W połączeniu z narzędziami genetycznymi obrazowanie na żywo może być wykorzystywane do precyzyjnego określania roli konkretnych genów w procesie rozwoju. Wcześniejsze prace Silieset al.(2) opisano migrację gleju pochodzącego z łodyżki nerwu wzrokowego — struktury łączącej rozwijające się oko z mózgiem — do tarczki wyobraźnięcia oka w utrwalonej tkance. W niniejszym materiale przedstawiamy protokół badania migracji żywych komórek glejowych doDrosophilatarcza imaginalna oka. Wykorzystujemy linię Drosophila, która wykazuje ekspresję GFP w rozwijających się glejach, aby śledzić progresję komórek glejowych u zwierząt typu dzikiego oraz u mutantów.

Protokół

Część 1: Przygotowanie przed eksperymentem.

1. Na tydzień przed badaniem należy skrzyżować muchy w celu uzyskania larw wykazujących ekspresję GFP pod kontrolą promotora specyficznego dla gleju. W naszym doświadczeniu wizualizowano GFP z sekwencją lokalizacji jądrowej eksprymowaną w komórkach glejowych przy użyciu promotora reversed polarity (repo) (3, 4).
2. Przykrywki należy przygotować co najmniej jeden dzień wcześniej, namaczając okrągłe przykrywki o średnicy 18 mm przez 10 minut w 1% roztworze poli-L-lizyny, a następnie pozostawiając do wyschnięcia na powietrzu przez noc.
3. W dniu poprzedzającym badanie należy oczyścić magnetyczną komorę hodowlaną Chamlide, namaczając jej elementy przez noc w 70% etanolu.
4. W dniu badania należy przygotować pożywkę hodowlaną, dodając do 10 ml pożywki dla owadów Schneidera serum płodowe cieląt, roztwór penicyliny i streptomycyny oraz insulinę, stosując technikę aseptyczną. Stężenia robocze to: 1X serum płodowe cieląt; 100U/ml penicyliny; 0.1mg/ml streptomycyny oraz 0.2 mg/ml insuliny w pożywce dla owadów Schneidera (zmodyfikowano na podstawie (5)).
5. Należy pozostawić komorę hodowlaną do wyschnięcia na powietrzu w dygestorium do hodowli komórkowych. Pozostałości etanolu z komory hodowlanej należy usunąć, płucząc ją przygotowaną pożywką hodowlaną.

Część 2: Disekcja kompleksu oko-mózg Drosophila.

1. Wybierz larwę wędrującą w trzecim stadium z boku fiolki z muchami i umieść ją w kropli schłodzonej pożywki hodowlanej na szalce Petriego na lodzie na kilka minut. Schłodzenie larwy jest zalecane w celu spowolnienia perystaltycznych skurczów ciała, co ułatwia sekcję.
2. Umieść schłodzoną larwę w kropli pożywki hodowlanej na szalce pokrytej Sylgardem pod mikroskopem sekcyjnym.
3. Pod mikroskopem sekcyjnym, używając precyzyjnej pęsety Dumont, mocno chwyć larwę w odległości około jednej trzeciej od końca tylnego. Poczekaj, aż larva wysunie haki gębowe z końca przedniego. Chwyć haki gębowe drugą pęsetą po ich pełnym wysunięciu. Aby przeprowadzić sekcję larwy, powoli pociągnij obie pęsety w przeciwnych kierunkach. Kompleks oko-mózg wraz z gruczołami ślinowymi, ciałami tłuszczowymi i tkanką imaginalną zostanie oddzielony od ciała larwy. Nie pociągnij haków gębowych zbyt gwałtownie, w przeciwnym razie mogą one zostać oderwane od kompleksu oko-mózg.
4. Odetnij gruczoły ślinowe, ciała tłuszczowe i krążki imaginalne za pomocą ultraprecyzyjnych nożyczek chirurgicznych. Dwie półkule mózgu i krążki oczne pozostaną przytwierdzone do brzusznego sznura nerwowego i haków gębowych.
5. Połóż szkiełko podstawowe o średnicy 18 mm na szkiełku przedmiotowym. Pozostaw jedną krawędź szkiełka podstawowego poza krawędzią szkiełka przedmiotowego, aby ułatwić jego późniejsze podniesienie. Dodaj kroplę pożywki hodowlanej na szkiełko podstawowe 18 mm. Przenieś kompleks oko-mózg do pożywki hodowlanej, chwytając haki gębowe pęsetą. Nie chwytaj bezpośrednio kompleksu oko-mózg pęsetą, aby nie uszkodzić tkanki.
6. Używając precyzyjnych nożyczek sekcyjnych, odetnij haki gębowe od kompleksu oko-mózg i wyrzuć je. Usunięcie haków gębowych jest ważne w przypadku obrazowania żywych tkanek, ponieważ haki gębowe będą nadal kurczyć się w pożywce hodowlanej, co spowoduje przemieszczanie się tkanki podczas mikroskopii.
7. Aby zwizualizować migrację gleju w obrębie krążka imaginalnego oka, ostrożnie przetnij szypułkę optyczną (cienka tkanka łącząca mózg z krążkiem oka) i odsuń lub usuń mózg (patrz ryc. 1A). Aby zwizualizować glej w obrębie szypułki optycznej, pozostaw mózg, szypułkę optyczną i krążek imaginalny oka nienaruszone (patrz ryc. 1E).
8. Podnieś szkiełko podstawowe pęsetą i narysuj pod nim okrąg wokół interesującej tkanki za pomocą markera permanentnego. Okrąg ten pomoże w zlokalizowaniu tkanki podczas mikroskopii w Części 4.

Część 3: Montaż tarczki wyobraźliowej oka w magnetycznej komorze hodowlanej.

1. Za pomocą pęsety chwyć zwisający brzeg szkiełka nakrywki. Przenieś szkiełko nakrywki na płytkę denną magnetycznej komory Chamlide, nie naruszając tkanki w hodowli.
2. Umieść silikonowy pierścień O-ring na korpusie komory Chamlide. Zamontuj korpus na płytce dennej.
3. Powoli dodaj pożywkę hodowlaną do komory. Nie dodawaj pożywki zbyt szybko, aby nie naruszyć badanej tkanki. Nie wypełniaj komory całkowicie, aby umożliwić wymianę gazową pod przykryciem.
4. Ostrożnie połóż niewidoczną pokrywkę na górze komory Chamlide.

Część 4: Wizualizacja migrujących komórek glejowych w tarczce oka.

1. Umieść komorę hodowlaną na stole mikroskopu konfokalnego lub fluorescencyjnego. Zlokalizuj próbkę przy małym powiększeniu, używając kółka na szkiełku nakrywkowym jako punktu odniesienia.
2. Ustaw ostrość na próbce, korzystając z obiektywu 40x. Pozostaw tkankę do czasu jej osadzenia się na szkiełku nakrywkowym. Wykonuj zdjęcia tarczy oka lub szypuły nerwu wzrokowego co 10-15 min przez okres od 3 do 4 godzin. Tkanka może drgać i wypadać z płaszczyzny ostrości. Ręczne ustawienie ostrości na tkance przed wykonaniem zdjęcia pozwoli rozwiązać ten problem.

Część 5: Reprezentatywne wyniki:

Prawidłowo wykonany protokół pozwolił nam zebrać serię obrazów komórek glejowych z markerem GFP, które migrowały z szypuły nerwu wzrokowego do pryzmorycznej tarczy oka (Rycina 1 B-D). Podczas gdy obrazowanie na żywo w okresie 60 minut było wystarczające do zaobserwowania zmian w położeniu jąder komórek glejowych w pryzmorycznej tarczy oka typu dzikiego, jądra komórek glejowych u mutanta genu niezbędnego do migracji komórek glejowych całkowicie nie opuściły szypuły nerwu wzrokowego (strzałki Rycina 1 F-H).

Hodowaliśmy kompleksy oko-mózg przez okresy do 240 minut przed zaobserwowaniem degradacji hodowanej tkanki. Po punkcie czasowym 240 minut zaczynamy obserwować komórki wykazujące ekspresję GFP w pożywce otaczającej hodowane kompleksy oko-mózg (strzałka Rysunek 2 C). Ponadto GFP będzie gromadzić się w postaci rozproszonych plamek w całej tkance, co sugeruje naruszenie jej integralności.

Rycina 1: Obrazowanie na żywo jąder komórek glejowych znakowanych GFP w rozwijających się systemach wzrokowych typu dzikiego oraz mutantów.
A, E) Obrazy wykonane za pomocą mikroskopii kontrastu interferencyjnego (DIC) hodowlanych tarcz wyobraźnych oka (ED) typu dzikiego oraz mutantów. W typie dzikim komórki glejowe powstają w szypule nerwu wzrokowego (OS) i migrują z niej do tarczy oka. Mózg został usunięty, aby ułatwić spłaszczenie i obrazowanie tarczy wyobraźnej oka. B-D) Mikroskopia fluorescencyjna hodowlanej tarczy wyobraźnej oka typu dzikiego z (A) w punktach czasowych 0, 30 i 60 minut wykazuje, że jądra komórek glejowych znakowane GFP migrują w obrębie tarczy oka.

F-H) Mikroskopia fluorescencyjna zmutowanego kompleksu oko-mózg z obrazu (E) w punktach czasowych 0, 30 i 60 minut wykazuje zatrzymanie jąder glejowych znakowanych GFP wewnątrz sznurowca wzrokowego (strzałka). Mózg (BR) pozostał przyłączony do sznurowca wzrokowego, aby ułatwić obrazowanie gleju wewnątrz sznurowca.

Rysunek 2: Obrazowanie na żywo błon glejowych znakowanych GFP w prążku imaginalnym oka typu dzikiego. Pomyślnie hodowano kompleksy oko-mózg przez okresy 240 minut. Tkanki hodowane dłużej niż 240 minut zaczynają ulegać degradacji. Pożywka hodowlana otaczająca prążek imaginalny oka (ED), szypułkę optyczną (OS) oraz płat mózgu (BR) w czasie 0 (A) i 150 minut (B), w porównaniu do punktu czasowego 300 minut (C), jest wolna od komórek GFP-dodatnich, co wskazano strzałką.

Dyskusja

W niniejszym protokole opisujemy obserwację migracji komórek glejowych do tarczki wyobrażeniowej oka przy użyciu mikroskopii żywych komórek. W naszym przykładzie wild type (rycina 1 A-D) wykorzystaliśmy jądrowy marker GFP do obserwacji ruchu komórek glejowych w tarczce oka w ciągu jednej godziny. W mutancie genu kandydującego, niezbędnego do migracji komórek glejowych, który jest obecnie badany w naszym laboratorium, zaobserwowaliśmy zatrzymanie jąder komórek glejowych wewnątrz sznurowata wzrokowa w okresie jedn...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Poly-L-lizyna	Odczynnik	Sigma-Aldrich	P8920
Pożywka dla owadów Schneidera’	Odczynnik	Sigma-Aldrich	S0146
Penicylina-streptomycyna	Odczynnik	Sigma-Aldrich	P4458
Roztwór insuliny z trzustki bydlęcej	Odczynnik	Sigma-Aldrich	I0516
Komora magnetyczna Chamlide	Narzędzie	Live cell Instrument	CM-R-10	Komora typu szalka 35 mm dla szkiełka nakrywkowego 18 mm
Nożyczki do precyzyjnego przycinania	Narzędzie	Fine Science Tools	15200-00
Pinceta Dumont #5	Narzędzie	Fine Science Tools	11251-20
Mikroskop fluorescencyjny	Mikroskop	Carl Zeiss, Inc.		Można użyć dowolnego systemu obrazowania fluorescencyjnego, który posiada odpowiednie filtry i wzbudzenie dla GFP.