Kwantyfikacja chronologicznej długości życia drożdży poprzez odrastanie starzejących się komórek

Podsumowanie

Starzenie chronologiczne u drożdży odnosi się do utraty żywotności komórek związanej z czasem przebywania w fazie stacjonarnej. W niniejszej pracy opisujemy wysokoprzepustową metodę ilościowego określania chronologicznej długości życia drożdży.

Streszczenie

Drożdże pączkująceSaccharomyces cerevisiaeokazał się być istotnym organizmem modelowym w badaniach nad starzeniem¹Długość życia replikacyjnego oraz chronologicznego to dwa uznane paradygmaty stosowane w badaniu starzenia się drożdży. Starzenie replikacyjne definiuje się jako liczbę komórek potomnych, które pojedyncza macierzyńska komórka drożdży produkuje przed wejściem w stan senescencji; starzenie chronologiczne definiuje się jako czas, przez który komórki mogą przeżyć w niedzielącym się stanie przypominającym spoczynek.²Opracowaliśmy wysokoprzepustową metodę ilościowego pomiaru chronologicznej długości życia. Metoda ta polega na starzeniu komórek w określonym medium, w warunkach mieszania i przy stałej temperaturze. W każdym punkcie czasowym starzenia subpopulacja komórek jest pobierana z hodowli starzejącej się i szczepiona w bogatym medium wzrostowym. Następnie, przy użyciu urządzenia Bioscreen C MBR, uzyskuje się krzywą wzrostu o wysokiej rozdzielczości dla tej subpopulacji starzejących się komórek. W dalszej kolejności stosuje się algorytm w celu określenia względnej proporcji żywych komórek w każdej subpopulacji na podstawie kinetyki wzrostu w każdym punkcie czasowym. Metoda ta wymaga znacznie mniej czasu i zasobów w porównaniu z innymi testami chronologicznej długości życia, zachowując jednocześnie powtarzalność i precyzję. Wysokoprzepustowy charakter tego testu powinien umożliwić prowadzenie wielkoskalowych przesiewów genetycznych i chemicznych w celu zidentyfikowania nowych modyfikatorów długowieczności do dalszych badań na bardziej złożonych organizmach.

Protokół

Część 1: Przygotowanie kultur starzejących się

1. Wysiać interesujące szczepy z zamrożonych stoków na płytki z agarem YEPD (1% ekstraktu drożdżowego, 2% bakto-peptonu, 2% agaru, 2% glukozy).
2. Inkubować komórki w temperaturze 30˚C przez 48 godzin lub do pojawienia się pojedynczych kolonii.
3. Wybrać pojedyncze kolonie i zaszczepić je do 5 mL płynnej pożywki YEPD (1% ekstraktu drożdżowego, 2% bakto-peptonu, 2% glukozy) w probówkach.
4. Hodować kultury przez noc w temperaturze 30˚C, zapewniając stałe mieszanie za pomocą wytrząsarki lub bębna obrotowego.
5. Zaszczepić 5 mL syntetycznej pożywki kompletnej (SC) (Tabela 1) za pomocą 50 µL kultury nocnej. Zazwyczaj dla każdego szczepu przygotowuje się trzy kultury SC, aby zapewnić potrójną powtórzalność biologiczną analizy długości życia dla każdego badanego szczepu.
6. Utrzymywać kultury w temperaturze 30˚C przy stałym mieszaniu na bębnie obrotowym przez cały czas trwania eksperymentu (zazwyczaj 2 lub więcej tygodni).

Część 2: Wyznaczanie punktu wiekowego przeżywalności

Po dwóch dniach hodowli w medium SC komórki powinny znajdować się w fazie stacjonarnej, co oznacza, że można pobrać pierwszy punkt czasowy (wiek komórek). Kolejne punkty czasowe należy pobierać co 2-3 dni przez minimum dwa tygodnie. Dla każdego punktu czasowego:

1. Przygotuj 100-dołkowe płytki Bioscreen Honeycomb do szczepienia, napełniając każdą studzienkę 145 µL pożywki YEPD. Należy pozostawić przynajmniej jedną studzienkę wypełnioną samą pożywką YEPD, bez komórek, do późniejszej analizy danych.
2. Wyjmij starzejące się kultury z inkubatora.
3. Krótko wymieszaj na wirówce typu vortex pierwszą kulturę przeznaczoną do zaszczepienia na płytce Honeycomb, uważając, aby nie rozlać zawartości.
4. Pobierz 5 µL wymieszanej kultury i pipetuj ją do pierwszej studzienki płytki Honeycomb. Wypal płomieniem wylot każdej probówki przed i po pobraniu 5 µL alikwotu.
5. Powtórz tę procedurę dla każdej starzejącej się kultury, pamiętając o zapisaniu położenia studzienki odpowiadającej każdej kulturze. W całym eksperymencie dla każdego kolejnego punktu czasowego (wieku) należy stosować te same położenia studzienek.
6. Po zakończeniu szczepienia umieść kultury z powrotem w inkubatorze w temperaturze 30˚C.

Część 3: Załadunek maszyny Bioscreen C MBR

1. Odsłoń komorę inkubatora, podnosząc pokrywę, a następnie zdejmij osłonę tacy na próbki.
2. Włóż nowo zaszczepioną płytkę Honeycomb do tacy na próbki (w przypadku odczytu tylko jednej płytki użyj lewego slotu).
3. Załóż ponownie osłonę tacy na próbki i opuść pokrywę komory inkubatora.
4. Upewnij się, że poziom cieczy przenoszącej ciepło znajduje się powyżej minimalnego poziomu wypełnienia. W przypadku niskiego poziomu, dolej cieczy, używając pipety 1000 µL i dostarczonego medium przenoszącego ciepło.
5. W oprogramowaniu Bioscreen „EZExperiment” ustaw następujące parametry, aby uzyskać odpowiednie krzywe wzrostu dla Saccharomyces cerevisiae:
   • Liczba próbek (Number of samples): wpisz liczbę studzienek z pożywką lub 200
   • Filtr (Filter): 420-580nm, Wideband
   • Temperatura (Temperature): 30˚C
   • Czas trwania eksperymentu (Experiment Length): 1 dzień, 0 godzin, 0 sekund
   • Interwał pomiarowy (Measurement Interval): 30 minut
   • Wstrząsanie (Shaking): Włączone (On), wstrząsanie ciągłe (Continuous shaking), wysokie (High)
6. Kliknij „Start”, aby rozpocząć odczyty.

Część 4: Analiza danych

Zazwyczaj w ciągu dwóch tygodni wyznacza się sześć punktów czasowych (wiekowe). Punkty te przypadają na dni 2, 4, 6, 9, 11 i 13. W zależności od projektu eksperymentalnego oraz testowanych szczepów, może być korzystne wyznaczanie punktów czasowych częściej, rzadziej lub przez okres dłuższy niż 2 tygodnie. Ważne jest, aby płytkę Honeycomb wypełniać w tej samej kolejności dla każdego punktu czasowego, tak aby każda starzejąca się kultura odpowiadała tej samej pozycji studzienki w każdym punkcie; znacznie ułatwi to późniejszą analizę danych.

1. Pobierz pliki wyjściowe z urządzenia Bioscreen C MBR. Oprogramowanie „EZExperiment” eksportuje dane Bioscreen do pliku z rozdzielaczami tabulacyjnymi, który jest kompatybilny z programem Microsoft Excel oraz innym oprogramowaniem. Pierwsza kolumna wskazuje czas wykonania pomiaru OD podczas eksperymentu, a kolejne kolumny reprezentują poszczególne studzienki w płytkach Bioscreen Honeycomb (Rycina 1).
2. Usuń pierwszy odczyt OD z każdej kolumny. Odczyt ten stanowi „szum”.
3. Znormalizuj dane, odejmując wartość OD studzienki zawierającej samą pożywkę YEPD od wszystkich wartości OD w każdej kolumnie. Pozwala to usunąć tło absorbancji pożywki.
4. Wykreśl krzywe wzrostu. Krzywe będą przesuwać się w zależności od wieku (Rycina 2). Na przykład, wykreślając krzywe wzrostu z kolumny 1 (studzienka 1 płytki Honeycomb) dla sześciu punktów czasowych, można zaobserwować wyraźne przesunięcie krzywych w prawo wraz z upływem czasu.
5. Oblicz czas podwojenia (δ) dla każdej studzienki na podstawie kinetyki wzrostu dla punktu wiekowego z dnia 2. Równanie używane do obliczenia czasu podwojenia to:
   
   gdzie OD₁ i OD₂ reprezentują kolejne pomiary OD, a t₁ i t₂ to czas między pomiarami. Obliczaj czasy podwojenia wyłącznie dla wartości OD w zakresie od 0,2 do 0,5. Średnia z tych wartości stanowi czas podwojenia dla danej studzienki. Większość szczepów drożdży typu dzikiego powinna dawać wartość czasu podwojenia od 85 do 90 minut.
6. Dla każdego punktu wiekowego oblicz przesunięcie czasowe (∆t) w krzywych wzrostu względem początkowego punktu wiekowego (dzień 2). Prostym sposobem jest wyznaczenie różnicy w czasie potrzebnym na osiągnięcie OD 0,3 w każdej studience pomiędzy początkowym punktem wiekowym a każdym kolejnym punktem wiekowym. Czas, w którym dana studzienka osiągnęła OD 0,3, można obliczyć z równania regresji liniowej dla ln(OD) jako funkcji czasu pomiędzy dwoma punktami czasowymi obejmującymi wartość OD=0,3.
7. Oblicz frakcję przeżywalności dla każdego punktu wiekowego, aby wygenerować krzywą przeżywalności (Rycina 3). Przyjmij, że początkowy punkt wiekowy (dzień 2) odpowiada 100% żywotności. Dla każdego kolejnego punktu wiekowego oblicz procent przeżywalności, korzystając z równania:
   
   gdzie s_n to procent przeżywalności, ∆t_n to przesunięcie czasowe, a δ_n to czas podwojenia.
8. Wygeneruj krzywe przeżywalności (Rycina 3B) zgodnie z potrzebami dla każdej studzienki (lub powtórzeń studzienek), wykreślając frakcję (lub procent) żywych komórek jako funkcję wieku.
9. Oblicz całkę przeżywalności (SI) dla każdej studzienki. SI jest definiowana jako pole pod krzywą przeżywalności i może być szacowana według wzoru:
   
   gdzie age_n to punkt wiekowy (np. 2, 4, 6, 9, 11 i 13), a s_n to wartość przeżywalności w tym punkcie wiekowym.
10. Wyznacz parametry statystyczne powtórzeń studzienek z danych SI i przeżywalności. Typowe istotne parametry statystyczne obejmują średnią, medianę i wariancję dla każdego zestawu powtórzeń biologicznych. Do porównywania parzystego SI dla różnych grup eksperymentalnych i kontrolnych można zastosować test t-Studenta lub podobną analizę. Wskazane może być również wygenerowanie krzywych przeżywalności, jak opisano w punkcie 4.8, na podstawie uśrednionych powtórzeń biologicznych.

Część 5: Reprezentatywne wyniki

Po zakończeniu eksperymentu wykreślona zostanie krzywa przeżywalności i przeprowadzona analiza danych wystarczająca do określenia potencjału starzenia chronologicznego dla kilku różnych szczepów lub warunków. Jeśli procedura zostanie przeprowadzona prawidłowo, krzywe wzrostu uzyskane z urządzenia Bioscreen C MBR powinny wyglądać podobnie do tych przedstawionych na Rysunku 2, a wynikowe krzywe przeżywalności powinny przypominać te ukazane na Rysunku 3. Zazwyczaj komórki typu dzikiego hodowane w opisanych tutaj warunkach wykazują medianowy czas życia chronologicznego rzędu 7 dni. Znaczne różnice w przeżywalności obserwuje się u różnych szczepów oraz w niektórych warunkach; na przykład w przypadku wzrostu w pożywce z 0,05% glukozy medianowa przeżywalność może przekroczyć 30 dni.

Rysunek 1. Wyniki danych z programu Bioscreen „EZExperiment”. Kolumna A przedstawia czas, w którym dokonano pomiaru absorbancji. Kolejne kolumny reprezentują studzienki płytki Honeycomb zaszczepionej komórkami pobranymi z kultur starzejących się.

Rycina 2. Krzywe wzrostu z jednego powtórzenia biologicznego w trakcie trwania eksperymentu. Wraz z upływem czasu widoczne jest wyraźne przesunięcie krzywych, gdy komórki w starzejącej się kulturze tracą żywotność. Odstęp czasu między początkowym punktem pomiarowym (dzień 2) a kolejnym punktem pomiarowym określa żywotność w danym wieku.

Rysunek 3. A) Krzywa przeżywalności wygenerowana na podstawie danych o wzroście z Rysunku 1. Punkt czasowy w 2. dniu został przyjęty jako punkt 100% przeżywalności. B) Końcowe krzywe przeżywalności dwóch szczepów przetestowanych w tym samym eksperymencie. Krzywe te reprezentują średnią przeżywalność trzech powtórzeń biologicznych dla każdego szczepu. Słupki błędów reprezentują odchylenie standardowe w obrębie powtórzeń biologicznych. Zacieniowany obszar pod krzywą przeżywalności reprezentuje całkę przeżywalności (SI) dla szczepu 1.

Tabela 1. Syntetyczne medium zdefiniowane stosowane w badaniach starzenia chronologicznego (tło szczepu BY4743)
Składnik	Stężenie (g/L)
D-glukoza	20
Yeast nitrogen base (-AA/AS)	1.7
(NH4)2SO4	5.0
Adenina	0.04
L-arginina	0.02
Kwas L-asparginowy	0.1
Kwas L-glutaminowy	0.1
L-histydyna	0.1
L-leucyna	0.3
L-lizyna	0.03
L-metionina	0.02
L-fenyloalanina	0.05
L-seryna	0.375
L-treonina	0.2
L-tryptofan	0.04
L-tyrozyna	0.03
L-walina	0.15
Uracyl	0.1

Uwaga: Niniejsza receptura uwzględnia aukstrofie w diploidalnym szczepie BY4743. Aukstrofie aminokwasowe należy zrekompensować, dodając do syntetycznego medium kompletnego składniki do końcowego stężenia 5X.

Dyskusja

Opisany tutaj wysokoprzepustowy test chronologicznej długości życia jest skuteczną metodą ilościowego określania potencjału starzenia się dla dużej liczby szczepów z wysoką dokładnością i precyzją. Główną zaletą tej metody w stosunku do klasycznych metod określania przeżywalności poprzez zliczanie jednostek tworzących kolonie (np. patrz ³) jest zastosowanie urządzenia łączącego funkcje wytrząsarki, inkubatora i czytnika płytek, takiego jak aparat Bioscreen C MBR, w celu uzyskania wysokorozdzielczych krzywych w...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Pepton Bacto	Odczynnik	BD Biosciences	211677
Ekstrakt drożdżowy Bacto	Odczynnik	BD Biosciences	288620
Agar Difco	Odczynnik	BD Biosciences	214530
Yeast Nitrogen Base bez aminokwasów i siarczanu amonu	Odczynnik	MidSci	J630-500G
Aminokwasy	Odczynnik	Sigma-Aldrich
Siarczan amonu	Odczynnik	Spectrum	AM185
Dekstroza	Odczynnik	Fisher Scientific	D16-10
Urządzenie Bioscreen C MBR	Narzędzie	Growth Curves USA	5101370
Płytka Bioscreen 100-dołkowa typu Honeycomb	Narzędzie	Growth Curves USA	9502550