Pobieranie i gromadzenie próbek wody morskiej

Podsumowanie

Niniejszy film dokumentuje metody pobierania próbek przybrzeżnych wód morskich oraz ich przetwarzania na potrzeby różnych zastosowań analitycznych, w tym zagęszczania biomasy, oczyszczania kwasów nukleinowych, oznaczania liczby komórek oraz analizy składników odżywczych i gazów śladowych.

Streszczenie

W niniejszym filmie przedstawiono metody pobierania próbek wody morskiej z obszarów przybrzeżnych oraz ich przetwarzania na potrzeby różnych zastosowań analitycznych, w tym koncentracji biomasy, oczyszczania kwasów nukleinowych, oznaczania liczebności komórek oraz analiz składników odżywczych i gazów śladowych. W dzisiejszej demonstracji próbki pobrano z pokładu statku HMS John Strickland operującego w zatoce Saanich Inlet. Do poboru próbek wykorzystano żuraw A-frame z wielofunkcyjną wciągarką i systemem lin oraz butle do poboru wody Niskin lub Go-Flo. Do badania parametrów masy wody wykorzystano również czujniki przewodności, temperatury i głębokości (CTD). W celu zminimalizowania efektu odgazowania w pierwszej kolejności pobrano próbki gazów śladowych. Następnie oznaczono zawartość składników odżywczych, skład chemiczny wody oraz liczebność komórek. Na koniec pobrano próbki wody do filtracji biomasy. Czas przygotowania i poboru próbek podczas jednego rzutu wynosi ok. 1,5 godziny przy maksymalnej głębokości 215 metrów. W związku z tym do przeprowadzenia opisanej tutaj serii pobrań potrzeba zazwyczaj łącznie 6 godzin.

Protokół

Część 1: Pobieranie wody

1. Każdemu rzutowi przypisuje się odpowiednie głębokości.
2. Określa się głębokości, z których pobierane będą próbki, oraz całkowitą objętość do zebrania podczas bieżącego rzutu.
3. Należy upewnić się, że butle Go-Flo i Niskin są otwarte, a ich zawory i kraniki zamknięte.
4. Sonda CTD jest montowana na dole liny i opuszczana do wody.
5. Butla przeznaczona do najgłębszego punktu poboru w pierwszym rzucie jest montowana na linie za sondą CTD; należy upewnić się, że lina jest prawidłowo osadzona w uchwycie, a śruby są dokręcone.
6. Przed opuszczeniem do każdej butli (z wyjątkiem najgłębszej) przytwierdza się posłańca.
7. Lina jest opuszczana na odległość między pierwszą a kolejną głębokością, po czym montuje się następną butlę. Należy pamiętać, że dla głębokości, z których pobierane jest 20L do filtracji, montuje się kolejno dwie butle o pojemności 12L w odstępie ok. 0,75m.
8. Gdy wszystkie butle znajdą się na linie, jest ona opuszczana na pożądaną głębokość i oczekuje się 2 minut.
9. Wysyłany jest posłaniec i oczekuje się kilka minut, aby upewnić się, że wszystkie butle zostały zamknięte.
10. Lina jest wciągana, a butle zdejmowane w miarę ich pojawiania się na stelażach.
11. W przypadku głębokości wymagających próbek 20L do analiz DNA i RNA, pobiera się dwie butle Niskin. Jedna butla służy do pomiaru parametrów chemicznych (patrz. poniżej), natomiast zawartość drugiej jest przelewana do kanistra. RNA jest izolowane natychmiast z drugiej butli Niskin. Pozostała część pierwszej butli jest również przelewana do kanistra, aby uzyskać końcową objętość ~20L. W przypadku próbek o niskiej rozdzielczości tylko 1L wody jest odstawiany do filtracji w sterylnych butelkach Nalgene.

Część 2: Pobieranie próbek gazu

1. W przypadku potrzeby pobrania próbek tlenu, wykonuje się to w pierwszej kolejności.
2. Kawałek cienkiej rurki przyczepia się do kranu butli Niskin/Go-Flo, a drugi koniec rurki umieszcza się w szklanych butelkach z surowicą.
3. Butelkę z surowicą płucze się 3 krotnie wodą z próbki, a następnie napełnia po brzegi w taki sposób, aby nie pojawiły się pęcherzyki powietrza.
4. Do butelki z surowicą dodaje się 50μl chlorku rtęci (HgCl₂) w sposób, który nie wprowadzi pęcherzyków powietrza do próbki.
5. Butelkę uszczelnia się gumowym korkiem i zaciska aluminiową kapslowaniem, a następnie przechowuje w lodzie w lodówce przenośnej.

Część 3: Pobieranie próbek składników odżywczych

1. Strzykawkę o pojemności 60 cc płucze się wodą z próbki, w obwodzie montuje się filtr (0.2 μm) i przepuszcza niewielką ilość wody przez acrodisc.
2. Butelkę polietylenową płucze się ~10 ml filtrowanej wody 3 razy (wstrząsając butelką podczas płukania).
3. Do butelek dolewa się filtrowaną wodę z próbki, wypełniając je w około ¾ objętości.
4. Próbkę przechowuje się w lodzie w chłodziarce.

Część 4: Pobieranie próbek amoniaku

1. Probówki płucze się wodą z próbki.
2. Probówki napełnia się całkowicie wodą z próbki.
3. Za pomocą pipety 10ml pobiera się 5ml wody z próbki; resztę wody w probówce wylewa się, a 5ml znajdujące się w końcówce pipety przelewa z powrotem do probówki z próbką.
4. Po pobraniu próbek ze wszystkich głębokości do każdej probówki dodaje się 7,5ml roboczego odczynnika amonowego.

Część 5: Pobieranie próbek do liczenia komórek

1. Wcześniej oznakowaną probówkę Falcona o pojemności 50 ml zawierającą 5,4 ml 37% formaldehydu wypełnia się po brzegi, aby uzyskać końcowe stężenie 4%. Należy zachować ostrożność, aby nie rozlać zawartości.

Część 6: Pobieranie próbek do pomiarów siarkowodoru

1. Wcześniej opisaną probówkę Falcon o pojemności 50 ml zawierającą 20% octanu cynku (Zn(O₂CCH₃)₂) napełnia się do pełna, uważając, aby nie rozlać zawartości.

Część 7: Pobieranie małych objętości w celu zagęszczenia biomasy

1. Butelki o pojemności 1 litra są napełniane po brzegi.

Część 8: Pobieranie dużych objętości w celu zagęszczenia biomasy

1. Napełnia się 20-litrowe kanistry.

Część 9: Reprezentatywne wyniki

Ostatecznym wynikiem pobierania próbek wody morskiej jest uzyskanie około 12 próbek tlenu rozpuszczonego, 32-48 próbek gazów, 16 próbek biogenów, 32 próbek amoniaku, 16 próbek siarkowodoru, 16 próbek do zliczeń komórkowych, 6 20-litrowych kanistrów, 16 1-litrowych butelek oraz 4 filtrów Sterivex 0.22μm zawierających biomasę mikrobową utrwaloną w RNA later.

Dyskusja

Ogólnie rzecz biorąc, tego rodzaju pobieranie próbek wymaga bardzo starannego przygotowania i planowania, dlatego należy zarezerwować 2 dni przed wyprawą na uporządkowanie spraw oraz jeden dzień po niej na wyczyszczenie całego sprzętu. Co do zasady, nie należy dopuścić do kontaktu wody słonej z pompą perystaltyczną ani do jej przedostania się do aluminiowej skrzyni Zarges używanej do transportu sprzętu terenowego. Właściwa dbałość o urządzenia zapewni ich bezawaryjne działanie przez długi czas.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Butle 20L		Fisher Scientific	02-960-15
Tygon 3/8"		Cole-Parmer	06429-36
Filtry Sterivex		Fisher Scientific	SVG010RS
Obudowa przedfiltra		AMD	501200
Złączka Luer		Cole-Parmer	31507-27
Przewód Tygon 1/4"		Cole-Parmer	06429-24
Przewód Tygon 1/4"		Cole-Parmer	06429-24
Przewód Tygon 1/4"		Cole-Parmer	06429-24
Plastikowe probówki 50ml
Szklane fiolki do serum				Pobieranie szklanych próbek
Septa i aluminiowe nakrętki do szklanych fiolek do serum
Zakuwarka ręczna
Pipeta 20-200ul i końcówki
Probówki szklane				Pobieranie próbek amonu
Plastikowe butelki 30ml				Pobieranie składników odżywczych
Filtry Acrodisc		EMD Millipore
Probówki 5 ml				Pobieranie próbek azotynów
37% formaldehyd	Odczynnik			Do próbek z liczeniem komórek
20% octan cynku	Odczynnik			Do próbek siarczków
Chlorek rtęci(II)	Odczynnik			Do próbek gazów
Woda milliQ	Odczynnik
Odczynnik roboczy do amonu	Odczynnik			Bufor borowy, siarczyn sodu, ortoftalodialdehyd
Sulfanilamid	Odczynnik			5g w 450ml wody i 50ml HCl
Roztwór dwuwodoroczlorku N-(1-naftylo)-etylenodiaminy	Odczynnik			0,5g w 500ml wody