Filtracja próbek wody morskiej z wybrzeża o dużej objętości (20L+)

Podsumowanie

W niniejszym filmie przedstawiono proces filtracji dużych objętości (≥20 L) biomasy drobnoustrojowej o średnicy od 0.22μm do 2.7μm z kolumny wody.

Streszczenie

Procedura rozpoczyna się od poboru wód morskich z obszarów przybrzeżnych w celu przeprowadzenia dalszych analiz składu społeczności mikroorganizmów, zawartości składników odżywczych oraz gazów śladowych. W ramach tej metody próbki pobrano z pokładu jednostki HMS John Strickland operującej w zatoce Saanich Inlet. Niniejszy film dokumentuje filtrację dużych objętości (≥20 l) biomasy mikrobownej o średnicy od 0,22 μm do 2,7 μm z kolumny wody. Dwie próbki o objętości 20 l można filtrować jednocześnie, korzystając z jednej pompy wyposażonej w cztery obrotowe głowice. Filtrację przeprowadza się w terenie podczas długich wypraw lub niezwłocznie po powrocie w przypadku wycieczek jednodniowych. Istotne jest odnotowanie objętości wody przepływającej przez każdą jednostkę filtra Sterivex. Aby zapobiec tworzeniu się biofilmu pomiędzy wyprawami pobieralniczymi, cały sprzęt do filtracji musi zostać przepłukany rozcieńczonym HCl i wodą dejonizowaną, a następnie poddany autoklawowaniu niezwłocznie po użyciu. Procedura ta trwa około 5 godzin, plus dodatkowa godzina na oczyszczenie sprzętu.

Protokół

1. Konfiguracja aparatury do filtracji
   1. Aby skonfigurować aparaturę do filtracji, należy za pomocą pęsety umieścić filtr klasy GF/D w obudowie przedfiltra. Dokręcić lekko obudowę ręką. Jako ogólną zasadę należy przyjąć, aby nie dokręcać zbyt mocno, ponieważ może to spowodować nieszczelność jednostki po uruchomieniu pompowania.
   2. Zastąpić korek bani autoklawowanym korkiem z dołączonym przewodem, ostrożnie wkładając wewnętrzny przewód do bani, tak aby go nie dotknąć. W razie potrzeby użyć pęsety do wprowadzenia przewodu do wnętrza bani.
   3. Przeciągnąć zewnętrzny przewód przez pompę perystaltyczną.
   4. Do końców obu zewnętrznych przewodów przymocować obudowy przedfiltrów (tj. 2 jednostki na każdą banię). Połączenie należy dokręcić szczypcami.
2. Filtracja wody morskiej
   1. Aby rozpocząć filtrację wody morskiej, należy włączyć pompę i ustawić prędkość przepływu na 1. Sprawdzić, czy woda jest pompowana w odpowiednim kierunku.
   2. Pozwolić 500 ml wody swobodnie przepłynąć przez jednostkę przedfiltra do zlewki o pojemności 1 L.
   3. Wyłączyć pompę i przymocować filtr Sterivex do męskiego złącza Luer na wolnym końcu zestawu przedfiltru. Dokręcić obudowę przedfiltra mocno ręką.
   4. Obserwować obudowę przedfiltra oraz połączenie między obudową przedfiltra a przewodem prowadzącym do bani. W przypadku wystąpienia wycieków należy wyłączyć pompę, a następnie poluzować i ponownie dokręcić obudowę przedfiltra w odpowiedni sposób. Ponownie włączyć pompę.
   5. Filtrat zbierać do kolb o pojemności 4 L. Po ich napełnieniu opróżnić kolby do czystej bani. Należy koniecznie odnotować objętość wody przeprowadzoną przez każdy filtr. Zebrany filtrat można poddać dalszej obróbce, np. filtracji w celu wydzielenia wirusów.
   6. Kontynuować filtrację do momentu, aż w baniach nie zostanie woda. Typowy czas filtracji wynosi od 4-5 h na banię 20 L; zależy to jednak w znacznym stopniu od ilości biomasy w wodzie.
   7. Po zakończeniu filtracji wyłączyć pompę i odłączyć filtry Sterivex.
3. Przechowywanie filtrów
   1. Aby przechować filtry, należy najpierw usunąć pozostałą wodę za pomocą strzykawki o pojemności 30-60 ml.
   2. Za pomocą pipety dodać do filtra 1,8 ml buforu lizującego, pozostawiając ok. 200 µl wolnej przestrzeni w filtrze na późniejsze dodanie odczynników.
   3. Zapieczętować dół i górę filtra Sterivex małym kawałkiem Parafilmu, a następnie opisać filtry datą i identyfikacją próbki.
   4. Przechowywać filtry w wcześniej opisanej probówce typu Falcon 50 ml w temperaturze -80°C.
   5. Wyjąć filtry z jednostki obudowy i umieścić je w opisanych probówkach Falcon 50 ml zawierających 2 ml buforu lizującego. Przechowywać w temperaturze -80°C.
4. Czyszczenie
   1. W celu końcowego czyszczenia umieścić przewód, który znajdował się w bani, w kolbie zawierającej 0,1 M HCl.
   2. Skierować przewód prowadzący do kolby 4 L z powrotem do oryginalnej bani.
   3. Włączyć pompę i uruchomić ją na poziomie 3, zbierając przepływ w oryginalnej bani.
   4. Na koniec przepłukać przewody autoklawowaną wodą.

Reprezentatywne wyniki:Końcowy wynik składa się z dwóch filtrów Sterivix, z których każdy zawiera biomasę mikrobową z około 10 L wody morskiej w zakresie wielkości od  0.22µm do 2.7µm. Jest ona przechowywana w buforze lizującym i gotowa do ekstrakcji DNA. Dodatkowo procedura ta pozwala na zebranie i skoncentrowanie biomasy o rozmiarze większym niż 2.7 µm na prefiltrach GF/D. Jest ona również przechowywana w buforze lizującym i gotowa do ekstrakcji DNA. W przypadku zastosowania dodatkowych etapów przetwarzania, przesącz o wielkości 0.22 µM może zostać poddany dalszej koncentracji w celu zebrania frakcji wirusowej.

Dyskusja

Niezbędne jest przetarcie blatów i pomp wilgotną ściereczką po zakończeniu pracy, aby usunąć wszelkie pozostałości wody słonej, które w przeciwnym razie mogłyby spowodować korozję sprzętu. Choć procedura jest prosta, wymagany czas jej wykonania może być znaczny, w zależności od stężenia biomasy lub zanieczyszczeń w filtrowanej próbce.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Pompa perystaltyczna		Masterflex (Cole Palmer)	77913-20, 77200-62, 77200-04
Przewody Tygon LFL		Masterflex (Cole Palmer)	06429-24	Do aparatury filtracyjnej
Zaciski do węży		Cole-Parmer	0683204	Do aparatury filtracyjnej
Adaptery rur 1/4” x 3/16”		Cole-Parmer	31702-20	Do aparatury filtracyjnej
Polipropylenowa obudowa przedfiltra		ADVANTEC	501200	Do aparatury filtracyjnej
Metalowe złącze luer (koniec węża do męskiego luer lock)		Cole-Parmer	31507-27	Do aparatury filtracyjnej
Magnesy 2“			Do aparatury filtracyjnej
3-portowe zakrętki do butli carboy				Do aparatury filtracyjnej
Filtry GV 0.22 μm STERIVIX		EMD Millipore	SVGV01R5
Filtry GF/D o średnicy 47 mm i wielkości oczek 2.7 μm		Whatman, GE Healthcare	1823047
Bufor lizujący	Odczynnik			0.75 M sacharozy, 40 mM EDTA, 50 mM Tris (pH 8.3)
0.1 % HCl	Odczynnik			Do płukania po filtracji
Woda autoklawowana	Odczynnik			Do płukania po filtracji