Niniejszy film dokumentuje filtrację małych objętości (~1 L) biomasy mikrobowej z kolumny wody.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Filtracja małych objętości (1–3 l) próbek przybrzeżnej wody morskiej
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Procedura rozpoczyna się od poboru przybrzeżnych wód morskich do późniejszych analiz składu społeczności mikrobiologicznej, zawartości składników odżywczych i gazów śladowych. Na potrzeby dzisiejszej demonstracji próbki pobrano z pokładu jednostki HMS John Strickland operującej w Saanich Inlet. Niniejszy film dokumentuje filtrację małych objętości (~1 L) biomasy mikrobiologicznej z kolumny wody. Protokół ten stanowi rozszerzenie opisanego wcześniej protokołu poboru dużych objętości, z jedną istotną różnicą: w tym przypadku pominięto etap wstępnej filtracji, dzięki czemu zbierane są wszystkie klasy wielkości biomasy, aż do granicy odcięcia filtra 0,22 $\mu$m. Próbki pobrane w ten sposób są idealne do analiz kwasów nukleinowych. Przygotowanie układu, filtracja oraz czyszczenie trwają odpowiednio około 20–30 minut. Przy jednoczesnym użyciu dwóch pomp perystaltycznych można filtrować do 8 próbek jednocześnie. Aby zapobiec tworzeniu się biofilmu pomiędzy wyprawami pobierającymi próbki, cały sprzęt do filtracji musi zostać przepłukany rozcieńczonym HCl oraz wodą dejonizowaną, a następnie poddany autoklawowaniu niezwłocznie po użyciu.
Protokół
- Przygotowanie aparatu do filtracji
- Przed rozpoczęciem filtracji należy wytrzeć kondensację z pełnych butelek, a następnie je zważyć
- Umieścić pojemnik do autoklawowania po jednej stronie pompy, a kolbę odpadową po drugiej.
- Następnie umieścić pełną butelkę z próbką w pojemniku do autoklawowania; nie należy jednak jeszcze zdejmować zakrętki z butelki.
- Przeciągnąć rurkę przez pompę perystaltyczną tak, aby koniec rurki z złączem Luer znajdował się w kolbie.
- Za pomocą pęsety usunąć watę ze sterylnej pipety 25 ml i przyłączyć pipetę do drugiego końca rurki.
- Filtracja wody morskiej
- Aby rozpocząć filtrację wody morskiej, należy otworzyć butelkę i włożyć do niej pipetę. Włączyć pompę i ustawić prędkość przepływu na 1. Upewnić się, że woda jest pompowana w odpowiednim kierunku.
- Pozwolić, aby ok. 100 ml wody przepłynęło przez całą rurkę.
- Wyłączyć pompę i przymocować filtr Sterivex do męskiego złącza Luer na wolnym końcu rurki.
- Kontynuować filtrację, aż w butelkach nie zostanie woda.
- Przechowywanie filtrów
- W celu przechowywania filtrów, najpierw usunąć pozostałą wodę za pomocą strzykawki 30-60 ml.
- Uszczelnić dół filtra Sterivex folią Parafilm. Za pomocą pipety dodać do filtra 1,8 ml buforu lizującego, pozostawiając ok. 200 ul wolnej przestrzeni w filtrze na późniejsze dodanie odczynników.
- Następnie uszczelnić górną część filtra Sterivex małym kawałkiem folii Parafilm i oznaczyć filtry datą oraz identyfikatorem próbki.
- Przechowywać filtry w uprzednio oznaczonych probówkach Falcon 50 ml w temperaturze -80°C
- Prace porządkowe
- Włożyć pipetę 25 ml do kolby zawierającej 0,1% HCl i włączyć pompę.
- Po przemyciu HCl opłukać rurkę wodą autoklawowaną.
Na koniec zmierzyć i zapisać masę teraz pustych butelek 1L w celu obliczenia objętości wody, która przepłynęła przez filtr.
Reprezentatywne wyniki: Każda 1 L próbka wody dostarcza jeden filtr Sterivix, zawierający biomasę o rozmiarze większym niż 0.22 µm. Jest on przechowywany w buforze lizującym w celu późniejszej ekstrakcji i analizy DNA. Wynik końcowy to jeden filtr Sterivix na każdą 1-litrową butelkę, przechowywany w buforze lizującym i przygotowany do ekstrakcji DNA. Filtr zawiera biomasę o rozmiarze większym niż 0.22 µm. Filtry mogą być przechowywane w temperaturze -80°C przed ekstrakcją eDNA.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Po zakończeniu pracy niezbędne jest przetarcie blatów i pomp wilgotną ściereczką w celu usunięcia wszelkich pozostałości słonej wody, która w przeciwnym razie spowodowałaby korozję sprzętu. Chociaż procedura jest prosta, czas jej realizacji może być znaczny, w zależności od stężenia biomasy lub zanieczyszczeń w filtrowanej próbce.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie zgłaszają żadnych konfliktów interesów.
Podziękowania
Pragniemy podziękować Canadian Foundation for Innovation, British Columbia Knowledge Development Fund oraz National Sciences and Engineering Research Council (NSERC) w Kanadzie za wsparcie prowadzonych badań nad obszarami o niskiej zawartości tlenu w wodach przybrzeżnych i otwartych oceanach. D.A.W. otrzymał wsparcie w ramach stypendiów z NSERC, Killam oraz fundowanego przez fundację TULA Centre for Microbial Diversity and Evolution.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Pompa perystaltyczna | Masterflex (Cole Palmer) | 77913-20, 77200-62, 77200-04 | |
| Przewód Tygon LFL | Masterflex (Cole Palmer) | 06429-24 | Do aparatury filtracyjnej |
| Opaski zaciskowe do węży | Cole-Parmer | 0683204 | Do aparatury filtracyjnej |
| Adaptery rur 1/4” x 3/16” | Cole-Parmer | 31702-20 | Do aparatury filtracyjnej |
| Polipropylenowa obudowa przedfiltra | ADVANTEC | 501200 | Do aparatury filtracyjnej |
| Metalowe złącze Luer (końcówka węża do męskiego zamka Luer) | Cole-Parmer | 31507-27 | Do aparatury filtracyjnej |
| Magnesy 2“ | Do aparatury filtracyjnej | ||
| 3-portowe zakrętki do gąsiorów | Do aparatury filtracyjnej | ||
| Filtry GV 0.22 μm STERIVIX | EMD Millipore | SVGV01R5 | |
| Filtry GF/D o średnicy 47 mm i wielkości porów 2.7 μm | Whatman, GE Healthcare | 1823047 | |
| Bufor do lizy | 0.75 M sacharozy, 40 mM EDTA, 50 mM Tris (pH 8.3) | ||
| 0.1 % HCl | Do płukania po filtracji | ||
| Woda autoklawowana | Do płukania po filtracji |
Przedruki i uprawnienia
