Artykuł metodologiczny

Przygotowanie zarodków Drosophila do obrazowania na żywo z wykorzystaniem protokołu wiszącej kropli

14.9K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/1206

⸱

13 marca 2009

 ,  , 
1Department of Biology, University of Waterloo

W tym artykule

Podsumowanie

Przedstawiono prostą, niedrogą i skuteczną metodę przygotowania embrionów Drosophila do analizy za pomocą obrazowania na żywo. Nasz protokół zapewnia wilgotność i wymianę gazową oraz nie powoduje kompresji embrionu Drosophila. Metoda ta jest odpowiednia do obrazowania na żywo embrionów Drosophila w oparciu o GFP z wykorzystaniem stereomikroskopu lub pionowego mikroskopu złożonego.

Streszczenie

Obrazowanie na żywo w trybie timelapse z wykorzystaniem białka zielonej fluorescencji (GFP) jest potężną techniką badania regulacji genetycznej procesów dynamicznych, takich jak morfogeneza tkanek, adhezja międzykomórkowa czy śmierć komórek. Zarodki *Drosophila* wykazujące ekspresję GFP można łatwo obrazować przy użyciu mikroskopii stereoskopowej lub konfokalnej. Celem każdego protokołu obrazowania na żywo jest zminimalizowanie szkodliwych efektów, takich jak odwodnienie i hipoksja. Poprzednie protokoły przygotowania zarodków *Drosophila* do analizy obrazowania na żywo polegały na umieszczaniu zdechorionowanych zarodków w oleju halokarbonowym i zamykaniu ich pomiędzy przepuszczalną dla gazów membraną halokarbonową a szkiełkiem podstawowym.1-3Wprowadzenie kompresji poprzez montowanie embrionów w ten sposób stanowi niepożądane utrudnienie dla każdej analizy morfogenezy opartej na biomechanice. Nasza metoda, którą nazywamy protokołem wiszącej kropli, zapewnia doskonałą żywotność embrionów podczas obrazowania na żywo i nie wymaga ich kompresji. W skrócie, protokół wiszącej kropli polega na umieszczeniu embrionów w kropli oleju halowęglowego zawieszonej na szkiełku nakrywkowym, które z kolei jest przymocowane nad komorą wilgotną. Oprócz zapewnienia wymiany gazowej i zapobiegania odwodnieniu, układ ten wykorzystuje wyporność embrionów w oleju halowęglowym, aby zapobiec ich przemieszczaniu się podczas akwizycji timelapse. Niniejsze wideo szczegółowo opisuje sposób zbierania i przygotowywania embrionów Drosophila do obrazowania na żywo z wykorzystaniem protokołu wiszącej kropli. Protokół ten jest odpowiedni do obrazowania zdechorionowanych embrionów przy użyciu stereomikroskopii lub dowolnego pionowego złożonego mikroskopu fluorescencyjnego.

Protokół

Przygotowanie

  1. Zebrać zarodki na standardowych płytkach z agarem z sokiem z winogron4. Wygodne jest użycie automatycznego kolektora jaj Drosophila (Flymax Scientific Equipment Ltd.). Stosowanie zsynchronizowanych zbiorów zarodków w określonych stadiach pozwoli zmniejszyć liczbę koniecznych zabiegów dechorionacji w celu uzyskania odpowiedniej liczby zarodków w pożądanym stadium rozwojowym.
  2. Przygotować szkiełko do dechorionacji, przyklejając kawałek dwustronnej taśmy klejącej do szkiełka przedmiotowego, a następnie zdjąć warstwę ochronną z taśmy.
  3. Przygotować komorę do obrazowania żywych tkanek, wycinając kawałek tkanki pasujący do otworu komory. Umieścić tkankę w otworze i zwilżyć ją wodą destylowaną.
  4. Wymieszać olej halowęglowy (Halocarbon Products Corp.) z serii lepkości 700 i 56 w stosunku 1:1. Mieszaninę można przechowywać i używać bezterminowo.
  5. Nanieść kilka małych kropel oleju halowęglowego na powierzchnię szkiełka nakrywkowego (22 X 40 mm, No. 2). Objętość nie jest krytyczna, ale powinna wynosić około 20-40 µl.

Procedura

  1. Przy pomocy stereomikroskopu zebrać embriony z płytek z agarem z sokiem z winogron, używając pęsety jubilerskiej (nr 5) lub bardzo cienkiego pędzla. Embriony mają tendencję do przyklejania się do siebie i do końcówek pęsety; łatwo gromadzą się w skupiskach.
  2. Przy pomocy stereomikroskopu delikatnie opuścić skupiska embrionów, które przylgnęły do końcówek pęsety, na powierzchnię taśmy na szkiełku do dechorionacji.
  3. Ponownie używając stereomikroskopu, delikatnie popchnąć lub przesunąć embriony bokiem pęsety, aby przerwać zewnętrzną woskową chorion, nie rozrywając wewnętrznej błony żółtkowej (embrion pęknie, jeśli błona żółtkowa zostanie przerwana).
  4. Po przerwaniu zewnętrznej chorion oddzielić embrion od chorion; zdechorionowany embrion ma tendencję do przylegania do powierzchni pęsety. Należy uważać, aby zdechorionowany embrion nie dotknął powierzchni taśmy.
  5. Natychmiast po zdechorionowaniu embrionu szybko przenieść go do wcześniej przygotowanej kropli oleju halokarbonowego na szkiełku nakrywkowym. Dotknąć końcówką pęsety z zdechorionowanym embrionem powierzchni kropli oleju halokarbonowego – spowoduje to oderwanie embrionu od pęsety i jego przedostanie się do oleju.
  6. Potwierdzić przeniesienie embrionu do kropli oleju. Można to zrobić gołym okiem, pod warunkiem pracy na czarnym tle i zastosowania światłowodowego źródła oświetlenia ustawionego pod kątem ukośnym.
  7. Przed próbą zdechorionowania kolejnego embrionu oczyścić pęsetę z oleju. Pęseta pokryta olejem ma słabszy chwyt na powierzchni chorion, co utrudnia dechorionację.
  8. Zdechorionowane embriony wypływają w oleju halokarbonowym. Używając pęsety lub pędzla i obserwując przez stereomikroskop, docisnąć embrion do dna kropli oleju i ułożyć go w pożądanej pozycji.
  9. Szybko odwrócić szkiełko nakrywkowe nad otworem komory do obrazowania na żywo. Potwierdzić, że embriony spoczywają przy szkiełku nakrywkowym w pożądanej orientacji. Ze względu na wyporność w oleju, embriony będą teraz unosić się przy dolnej powierzchni szkiełka nakrywkowego. Przymocować szkiełko nakrywkowe do komory do obrazowania na żywo za pomocą taśmy. Przewietrzyć komorę, wycinając otwory w taśmie w obszarze, w którym taśma zasłania szczelinę między końcem szkiełka nakrywkowego a końcem otworu komory do obrazowania na żywo.
  10. Do obrazowania embrionów można teraz użyć prostego mikroskopu fluorescencyjnego lub stereomikroskopu fluorescencyjnego.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Opisujemy nową metodę przygotowania embrionów Drosophila do analizy obrazowania na żywo, którą nazywamy protokołem kropli wiszącej. Niestety, protokołu kropli wiszącej nie można zastosować w przypadku pracy z mikroskopem odwróconym. W takim przypadku należy zastosować technikę kanapkową (opisaną w powyższym streszczeniu), a kompresja embrionów pozostaje problemem.

W eksperymentach, w których mierzy się kształt i rozmiar komórek w celu obliczenia sił związanych z ruchem morfogenetycznym, prefe...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Podziękowania

Z wdzięcznością potwierdzamy wsparcie udzielone B.H.R. w ramach Discovery Grant, a także Research Tools and Instrument Grant z Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC). Dziękujemy również H. Odzie oraz Bloomington Drosophila Stock Center za udostępnienie linii genetycznych wykorzystanych w przykładowych sekwencjach obrazowania na żywo.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Standardowy sprzęt i materiały wymagane do przygotowania embrionów do obrazowania na żywo z wykorzystaniem protokołu wiszącej kropli obejmują następujące elementy: szkiełka przedmiotowe
laminki (22 x 40 mm, nr 2)
taśma dwustronna
jubiler’pinceta (typ Dumont nr 5)
ole halowęglowe serii 56 i serii 700 (Halocarbon Products Corp.)
nóż introligatorski lub jednostronne ostrze do golenia
ręcznik papierowy
nożyczki
woda destylowana
taśma uniwersalna
pipeta odpowiednia do pobierania objętości 20-40 μl.
Protokół obrazowania na żywo wymaga również specjalnie wykonanej komory do obrazowania żywych komórek. Przygotowuje się ją poprzez wycięcie z arkusza poliwęglanu o grubości 5 mm kawałka o wymiarach standardowego szkiełka przedmiotowego (75 x 25 mm), a następnie za pomocą freza wykonuje się w nim wgłębienie o głębokości 3 mm (20 x 55 mm). Wymagany jest również dostęp do stereomikroskopu (mikroskopu sekcyjnego) oraz światłowodowego źródła oświetlenia.

Bibliografia

  1. Kiehart, D. P., Galbraith, C. G., Edwards, K. A., Rickoll, W. L., Montague, R. A. Multiple forces contribute to cell sheet morphogenesis for dorsal closure in Drosophila. J. Cell Biol. 149, 471-490 (2000).
  2. Schock, F., Perrimon, N. Cellular processes associated with germ band retraction in. , 248-2429 (2002).
  3. Reed, B. H., Wilk, R., Schock, F., Lipshitz, H. D. Integrin-dependent apposition of Drosophila extraembryonic membranes promotes morphogenesis and prevents anoikis. Curr. Biol. 14, 372-380 (2004).
  4. Wieschaus, E. p, Nusslein-Volhard, C. Drosophila: a practical approach. Roberts, D. B. , IRL Press Limited. Oxford, England. 199-227 (1986).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

olej halogenowanystereomikroskopiamikroskopia fluorescencyjnazbieranie embrion wdechorionizacjakomora wilgotnamontowanie na szkie ku nakrywkowym

Powiązane artykuły