Wysokoprzepustowa metoda globalnego badania morfologii organelli w *S. cerevisiae*

Podsumowanie

Białka fuzyjne z GFP są powszechnie wykorzystywane do wizualizacji organelli za pomocą mikroskopii konfokalnej. Jednak przesiewanie mutacji wpływających na morfologię organelli zazwyczaj wymaga indywidualnej mutogenezy i jest czasochłonne. W niniejszej pracy prezentujemy metodę jednoczesnego wprowadzenia markerów organelle-GFP do prawie 5 000 genów nieessentialnych u drożdży.

Streszczenie

Wysokoprzepustowe metody badania lokalizacji białek lub morfologii organelli stanowią skuteczne narzędzie do analizy interakcji białkowych i mogą pomóc w uzyskaniu kompleksowego zrozumienia szlaków molekularnych. W przypadku *Saccharomyces cerevisiae*, dzięki opracowaniu kolekcji mutantów z delecją genów nieessentialnych, możliwe jest globalne badanie morfologii różnych organelli, takich jak retikulum endoplazmatyczne (ER) i mitochondria, z wykorzystaniem markerów GFP (lub ich wariantów) na tle różnych genotypów. Jednak wprowadzanie markerów GFP do każdego pojedynczego mutanta z osobna jest procesem pracochłonnym. W niniejszym materiale opisujemy procedurę rutynowo stosowaną w naszym laboratorium. Dzięki zastosowaniu systemu robotycznego do obsługi wysokogęstościowych macierzy drożdży oraz technik selekcji za pomocą leków, możemy znacznie skrócić wymagany czas i poprawić powtarzalność badań. W skrócie: za pomocą robotycznego przeniesienia kolonii (replica pinning) krzyżujemy marker mitochondrialny znakowany GFP (Apc1-GFP) z wysokogęstościową macierzą 4672 mutantów z delecją genów nieessentialnych. Poprzez selekcję diploidów, sporulację, kiełkowanie i podwójną selekcję markerową odzyskujemy oba allele. W rezultacie każdy haploidalny pojedynczy mutant zawiera Apc1-GFP wbudowany w locus genomowe. Dzięki temu możemy badać morfologię mitochondriów na tle wszystkich mutantów nieessentialnych. Wykorzystując to wysokoprzepustowe podejście, możemy w wygodny sposób badać i określać szlaki oraz geny zaangażowane w dziedziczenie i formowanie organelli w skali całego genomu.

Protokół

Materiały i metody:

1. Szczepy drożdży:
   • Acp1-GFP (GFP::His): znacznik GFP na końcu C-terminalnym Acp1 został wprowadzony poprzez homologiczną rekombinację zapśredniczoną przez PCR z użyciem plazmidu pKT128 (zawierającego GFP i HIS5). Pozytywne transformanty potwierdzono za pomocą mikroskopii konfokalnej i PCR kolonii. Tłem szczepu był BY7043 (MAT alpha can1∆::STE2pr-lue2 lyp1∆ his3∆1 leu2∆0 ura3∆0 met15∆0) z laboratorium Boone (Tong i Boone, 2006).
   • Deletion Mutant Array (DMA) (xxx::KanR): jest to macierz około 5000 mutantów z delecjami genów nieessentialnych. Wszystkie te geny nieessentialne zostały wyłączone przy użyciu G418. Tłem szczepów w macierzy jest BY4741 (MATa his3_1 leu2_0 met15_0 ura3_0). Nasza macierz DMA pochodziła pierwotnie z laboratorium Boone.
2. Wprowadzenie Acp1-GFP do macierzy DMA:
   
   Poniższy protokół tworzenia macierzy GFP został zaadaptowany z technologii Syntetycznej Analizy Genetycznej (SGA) (Tong i Boone, 2006) z modyfikacjami. Wszystkie etapy przenoszenia kolonii (replica pinning) są wykonywane przy użyciu zautomatyzowanego systemu do tworzenia macierzy o wysokiej gęstości Singer ROTOR. Alternatywnie można zastosować manualne przenoszenie kolonii lub robota do macierzy o wysokiej gęstości w systemie ciekłym.
   
   Skróty: YPD, ekstrakt drożdżowy-pepton-dekstroza; SD, syntetyczna pożywka z brakami (dropout); LRK, pożywka z brakiem Lue/Arg/Lys; LHRK, pożywka z brakiem Lue/His/Arg/Lys
   
   Przygotowanie
   1. Wyhodować trawnik komórek Acp1-GFP, wylewając 5 ml nocnej hodowli Acp1-GFP na płytkę YPD. Pozostawić płytkę do całkowitego wyschnięcia nad płomieniem lub w biologicznej komorze z wyciągiem.
   2. Inkubować płytkę w temperaturze 30˚C przez noc.
   3. Za pomocą robota nanieść szczep Acp1-GFP w formie 1536 kolonii na płytkę. Jednocześnie przygotować świeżą kopię DMA poprzez przeniesienie kolonii na płytki YPD + G418.
   4. Inkubować płytki w temperaturze 30˚C przez noc.
      
      Krzyżowanie i selekcja diploidów
      
      
   5. Skrzyżować szczep Acp1-GFP z macierzą DMA poprzez przeniesienie kolonii i nałożenie ich na płytki YPD.
   6. Inkubować płytki w temperaturze 30˚C przez noc.
   7. Przenieść kolonie na płytki SD – His + G418 w celu wyselekcjonowania komórek diploidowych (MATa/MATalpha).
   8. Inkubować płytki w temperaturze 30˚C przez noc.
      
      Sporulacja i kiełkowanie
      
      
   9. Przenieść kolonie diploidowe na pożywkę do wzmocnionej sporulacji, która zawiera obniżone poziomy źródeł węgla i azotu w celu indukowania tworzenia zarodników meiotycznych.
   10. Inkubować płytki w temperaturze 25˚C przez minimum 5 dni.
   11. Wyhodować progeny meiotyczne MATa, przenosząc kolonie na pożywkę LRK i inkubując płytki w temperaturze 30˚C przez dwa dni.
   12. Pożywka ta indukuje kiełkowanie haploidalnych komórek z zarodników. Ponieważ otwarta ramka odczytu (ORF) LUE2 jest zintegrowana z promotorem STE2 specyficznym dla MATa, wszystkie wykiełkowane haploidy będą posiadały typ MATa.
       
       Selekcja obu alleli
       
       
   13. Konieczne jest teraz wyselekcjonowanie zarówno allelu GFP, jak i allelu pojedynczego mutanta. W tym celu komórki MATa przenosi się na pożywkę LRK + G418, która selekcjonuje haploidy posiadające delecję genu (xxx::kanR).
   14. Inkubować płytki w temperaturze 30˚C przez noc.
   15. Na koniec progeny meiotyczne MATa przenosi się na pożywkę LHRK + G418 , aby wyselekcjonować wzrost pojedynczych mutantów (xxx::kanR) posiadających również Acp1-GFP (GFP::His). Płytki te można przechowywać w temperaturze 4˚C przez maksymalnie 3 miesiące.
   
   
   Poniższy protokół tworzenia macierzy GFP został zaadaptowany z technologii Syntetycznej Analizy Genetycznej (SGA) (Tong i Boone, 2006) z modyfikacjami. Wszystkie etapy przenoszenia kolonii są wykonywane przy użyciu zautomatyzowanego systemu do tworzenia macierzy o wysokiej gęstości Singer ROTOR. Alternatywnie można zastosować manualne przenoszenie kolonii lub robota do macierzy o wysokiej gęstości w systemie ciekłym.
   
   Skróty: YPD, ekstrakt drożdżowy-pepton-dekstroza; SD, syntetyczna pożywka z brakami (dropout); LRK, pożywka z brakiem Lue/Arg/Lys; LHRK, pożywka z brakiem Lue/His/Arg/Lys
   
   Przygotowanie
3. Mikroskopia:
   1. Wybrać wybrany mutant lub mutanty wykazujące ekspresję Acp1-GFP bezpośrednio z płytki.
   2. Hodować komórki w temperaturze 30 °C w pożywce YPD lub SD – His do wczesnej fazy logarytmicznej.
   3. Wizualizować za pomocą mikroskopii konfokalnej z użyciem zestawu filtrów GFP. Przykład oczekiwanego wyniku przedstawiono na Rysunku 1.

Pożywka SGA:

Pożywka wzrostowa (YPD) oraz pożywka selekcyjna (SD) wykorzystywane w tym protokole są rutynowo stosowane w biologii molekularnej drożdży. Szczegółowe opisy znajdują się w publikacji Methods in Yeast (Amberg et al., 2005).

pożywki LRK, LHRK (łącznie 400 ml)

Dodawać w podanej kolejności	Ilość
Azotowa baza drożdżowa z siarczanem amonu	2.7 g
Mieszanina aminokwasów	0.8 g
Agar	8 g
dH2O	360 mL
Autoklawować
20 % dekstroza	40 ml
Schłodzić do 65˚C
100 mg/ml kanawanina	0.2 ml
100 mg/ml tializyna	0.2 ml
Wymieszać, wlewać 50 ml na płytkę

pożywka LRK, LHRK + G418 (łącznie 400 ml)

Kolejność dodawania	Ilość
Azotowa baza dla drożdży bez siarczanu amonu	0.7 g
Mieszanina aminokwasów	0.8 g
Glutaminian monosodowy	0.4
Agar	8 g
dH2O	360 mL
Autoklawowanie
20 % dekstrozy	40 ml
Schłodzić do 65˚C
100 mg/ml kanawaniny	0.2 ml
100 mg/ml tializyny	0.2 ml
200 mg/ml G418	0.4 ml
Wymieszać, wlać 50 ml na płytkę

Wzbogacona pożywka do sporulacji (na całkowitą objętość 400 ml)

Kolejność dodawania	Ilość
Octan potasu	4 g
Ekstrakt drożdżowy	0.4 g
Dekstroza	0.2 g
Mieszanina aminokwasów do sporulacji	0.04 g
Agar	8 g
dH2O	360 mL
Autoklawowanie
Schładzanie do 65˚C
200 mg/ml G418	0.4 ml
Wymieszać, wylać po 50 ml na płytkę

Dyskusja

Ta metoda pozwala na efektywne wprowadzenie markera mitochondrialnego, Acp1-GFP, do różnych tła mutantów. Opiera się ona na wykorzystaniu systemu robotycznego i może zostać łatwo zaadoptowana do pracy z dowolnym systemem robotycznym. Procedurę tę można również stosować do wprowadzania innych rodzajów markerów. Na przykład do wizualizacji ER rutynowo stosujemy marker Erg11-GFP. Na naszych reprezentatywnych obrazach mutant oraz typ dziki z markerem Acp1-GFP zostały poddane mikroskopii konfokalnej w celu zbadania morfo...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Pożywki SGA			Pożywki wzrostowe (YPD) oraz syntetyczne pożywki selekcyjne (SD), w tym LRK i LHRK, a także wzbogacone pożywki do sporulacji wykorzystane w tym protokole, są rutynowo stosowane w biologii molekularnej drożdży. Szczegółowe opisy znajdują się w publikacji Methods in Yeast (Amberg et al., 2005).