Wysokorozdzielcza podwójna fluorescencyjna hybrydyzacja in situ w całych embrionach ryby danio-ostrobłysku

Podsumowanie

Hybrydyzacja in situ w preparatach całych jest jedną z najszerzej stosowanych technik w biologii rozwoju. Przedstawiamy tutaj protokół podwójnej fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ o wysokiej rozdzielczości, służący do analizy precyzyjnego wzorca ekspresji pojedynczego genu oraz określania nakładania się domen ekspresji dwóch genów. Włączyliśmy barwienie jąder jodkiem propidyny w celu uwydatnienia organizacji tkanki.

Streszczenie

Montaż całego preparatuin situhybrydyzacja jest jedną z najpowszechniej stosowanych technik w biologii rozwoju. Przedstawiamy tutaj wysokorozdzielczą podwójną fluorescencyjnąin situprotokół hybrydyzacji służący do analizy precyzyjnego wzorca ekspresji pojedynczego genu oraz do określenia nakładania się domen ekspresji dwóch genów. Protokół ten jest zmodyfikowaną wersją standardowejin situhybrydyzacja z wykorzystaniem fosfatazy zasadowej i substratów takich jak NBT/BCIP oraz Fast Red^1,2Niniejszy protokół wykorzystuje standardowe sondy znakowane digoksygeniną i fluoresceiną wraz z tyramidową amplifikacją sygnału (TSA)³Dostępne komercyjnie zestawy TSA umożliwiają elastyczne projektowanie eksperymentów, ponieważ emisję fluorescencji od zielonej do dalekiej czerwieni można stosować w połączeniu z różnymi barwnikami jądrowymi, takimi jak jodek propidyny, lub z fluorescencyjną immunohistochemią białek. TSA wytwarza reaktywny substrat fluorescencyjny, który szybko wiąże się kowalencyjnie z grupami, zazwyczaj resztami tyrozyny, znajdującymi się w bezpośrednim sąsiedztwie znakowanej antysensownej sondy rybo-probe. Uzyskane wzory barwienia charakteryzują się wysoką rozdzielczością, co pozwala na obserwację subkomórkowej lokalizacji mRNA przy użyciu konfokalnej mikroskopii skaningowej laserem.^3,4Można zaobserwować powstające transkrypty w locus chromosomowych, odróżnić barwienie jądrowe od cytoplazmatycznego oraz zwizualizować inne wzorce, takie jak kortykalna lokalizacja mRNA. Badania wDrosophilawskazuje, że około 70% mRNA wykazuje specyficzne wzorce lokalizacji subkomórkowej, które często korelują z funkcją kodowanego białka⁵W połączeniu z rekonstrukcją zestawów danych konfokalnych 3D wspomaganą komputerowo, nasz protokół umożliwia szczegółową analizę rozkładu mRNA z rozdzielczością podkomórkową w całych embrionach kręgowców.

Protokół

1. FIKSACJA

1. Utrwalaj zarodki przez noc w temperaturze 4°C w 4% paraformaldehydzie (PFA) w PBS.
2. Usuń utrwalacz i przemyj 2 x PBS, po 5 minut każdy w temperaturze pokojowej (RT).
3. Przeprowadź manualną dechorionację zarodków w PBS w szklanej płytce z zagłębieniami, używając pęsety zegarmistrzowskiej. Po dechorionacji przenoś zarodki za pomocą wypalanej szklanej pipety Pasteura, ponieważ mogą one przywierać do pipet polipropylenowych.
4. Przenieś zarodki przez serię roztworów metanolu w PBS o stężeniach 25%, 50% i 75%, po 5 minut w każdym z nich.
5. Wymień płyn na 100% metanol, inkubuj przez 5 minut, a następnie wymień na świeży metanol.
6. Przechowuj zarodki w temperaturze -20°C przez co najmniej jedną godzinę. (Zwyczajowo inkubujemy zarodki przez noc. Standardowa hybrydyzacja in situ działa na zarodkach przechowywanych przez ponad rok, jednak nie badaliśmy, czy wysoka rozdzielczość fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ ulega utracie podczas długotrwałego przechowywania).
7. Przemywaj zarodki przez 5 minut każdy w 75%, 50% i 25% metanolu w PBST w temperaturze RT. Przemyj dwukrotnie po 5 minut w PBST w temperaturze RT.
8. Ponownie utrwalaj przez 20 minut w 4% PFA w PBS w temperaturze RT.
9. Przemyj dwukrotnie po 5 minut w PBST w temperaturze RT.

UWAGA DOTYCZĄCA PFA:
Przechowujemy 4% PFA w alikwotach w temperaturze –20ºC (patrz tabela odczynników). Do pierwszej fiksacji używamy wyłącznie PFA, które nie było wcześniej rozmrażane. Do kolejnych fiksacji często wykorzystujemy PFA, które było już rozmrażane. Pierwsza fiksacja wydaje się być kluczowa dla powodzenia barwienia w tym protokole.

2. PROTEINAZA I POSTFIKSACJA

1. Trawienie proteinazą K (5μg/ml w PBST) w RT przez 3 do 12 minut w celu permeabilizacji embrionów. (Czas inkubacji zależy od wieku embrionów, gdyż wcześniejsze stadia są bardziej wrażliwe. Zależy on również od partii enzymu). W przypadku embrionów w stadium somitogenezy typowo przeprowadzamy permeabilizację przez 3-4 minuty. Podczas tej inkubacji probówkę do mikrocentryfugi kładziemy na boku.
2. Krótkie płukanie w PBST, a następnie jednokrotne przemycie przez 5 minut w PBST.
3. Ponowna fiksacja przez 20 minut w 4% PFA w PBS w RT.
4. Dwukrotne przemycie w PBST w RT po 5 minut każdy z etapów.

3. PREHYBRYDYZACJA

1. Inkubować zarodki przez 5 minut w temperaturze 65º C w roztworze HYB-.
2. Przeprowadzić prehybrydyzację w temperaturze 65º C przez co najmniej 1 godzinę w roztworze HYB+.

4. HYBRYDYZACJA

1. Usuń cały preHYB poza 50 μl, dbając o to, aby embriony pozostały całkowicie zanurzone.
2. Dodaj 1-2 μl każdej sody riboprobe (riboprobe znakowane digoksigeniną i fluoresceiną) do embrionów i wymieszaj, delikatnie potrząsając probówką. Ilość sondy to zazwyczaj 1-2µl z 20µl reakcji syntezy sondy.
3. Z uwagi na to, że fluoresceina jest światłoczuła, probówki powinny być od tego momentu owinięte folią aluminiową lub w inny sposób chronione przed światłem.
4. Inkubuj embriony przez noc w temperaturze 65ºC.

5. USUWANIE SOND

Należy zwrócić uwagę, że od tego momentu roztwory nie zawierają detergentu. Eliminacja detergentu wydaje się wspomagać reakcje barwienia, ale powoduje, że embriony stają się dość lepkie.

1. Usunąć sondę rybosomową.
2. Przepłukać 2 x 30 minut w temperaturze 65ºC w 50% formamidzie/2xSSC.
3. Przepłukać przez 15 minut w temperaturze 65ºC w 2 x SSC.
4. Przepłukać przez 30 minut w temperaturze 65ºC w 0.2 x SSC.

6. INKUBACJA Z PRZECIWCIAŁEM PRZECIW FLUORESCEINIE

1. Blokować przez co najmniej 1 godzinę w RT w 500μl roztworu buforu kwasu maleinowego 1x z dodatkiem 2% odczynnika blokującego (patrz tabela odczynników).
2. Dodać przeciwciało anty-Fluoresceina-POD, dostarczone przez firmę Roche, w rozcieńczeniu 1:500 w roztworze blokującym.
3. Inkubować przez noc w 4ºC. Podczas tej inkubacji probówkę do mikrowirówki kładziemy na boku.
4. Przemyć 4 x 20 minut w buforze kwasu maleinowego 1x. Przemyć dwukrotnie po 5 minut w PBS.

7. WYKRYWANIE ZONDY ZNACZONEJ FLUORESCEINĄ

1. Inkubować przez 30-60 minut w roztworze TSA z fluoresceiną. (Przed przygotowaniem roztworu barwiącego należy odwirować substrat TSA. W celu przeprowadzenia reakcji odczynnik tyramidowy rozcieńcza się 1:50 w buforze rozcieńczającym do amplifikacji Perkin Elmer). Podczas tej inkubacji probówkę do mikrocentryfugi kładzie się na boku. Czas reakcji należy określić empirycznie dla każdej sondy. Niestety, reakcji barwienia nie można monitorować wizualnie, ponieważ substrat jest fluorescencyjny i przez cały czas trwania procesu barwienia widoczna będzie wszechobecna zielona fluorescencja.
2. Przemywać po 10 minut w kolejnych roztworach metanolu w PBS o stężeniach 30%, 50%, 75% i 100%.
3. Inkubować przez 30 minut w roztworze 1% H₂0₂ w metanolu w celu inaktywacji pierwszej peroksydazy.
4. Przemywać po 10 minut w kolejnych roztworach metanolu w PBS o stężeniach 75%, 50% i 30%. Następnie przemywać dwukrotnie po 10 minut w PBS. Ważne jest, aby całkowicie usunąć cały metanol.

UWAGI DOTYCZĄCE WZMACNIANIA SYGNAŁU TYRAMIDOWEGO:
Korzystamy z zestawów TSA firmy Perkin Elmer. Stwierdziliśmy, że podłoża Alexa-Tyramide barwią prawidłowo przy użyciu buforu rozcieńczającego do wzmacniania firmy Perkin Elmer, natomiast nie osiągnęliśmy sukcesu, używając buforu do barwienia dołączonego do zestawów Invitrogen/Molecular Probes. Ponadto zauważyliśmy, że fluorescencja Cy5 zostaje usunięta przez następującą po niej obróbkę Metanol/H₂O₂, podczas gdy fluoresceina i Alexa-647 pozostają niewrażliwe. Cy3 może również ulec negatywnemu wpływowi obróbki Metanol/H₂O₂, ponieważ jest strukturalnie powiązany z Cy5. Z tego powodu reakcje TSA z użyciem Cy3 i Cy5 powinny być stosowane wyłącznie podczas drugiej reakcji barwienia w podwójnym protokole fluorescencyjnym in situ.

8. INKUBACJA PRZECIW CIAŁA ANTI-Digoxygenin

1. Ponownie zablokuj zarodki przez co najmniej 1 godzinę w temperaturze pokojowej (RT) w roztworze 1x buforu kwasu maleinowego z dodatkiem 2% odczynnika blokującego.
2. Dodaj przeciwciało anty-DIG POD dostarczone przez firmę Roche w rozcieńczeniu 1:1000 w powyższym roztworze blokującym.
3. Inkubuj przez noc w temperaturze 4ºC. Podczas inkubacji probówkę do mikrocentryfugi układamy na boku.
4. Przemyj 4 x 20 minut w 1x buforze kwasu maleinowego. Przemyj dwukrotnie po 5 minut w PBS.

9. WYKRYWANIE SONDY ZNAZNACZONEJ Digoxygeniną

1. Inkubować przez 30-60 minut w roztworze TSA Plus Cy5 (przed przygotowaniem roztworu barwiącego należy odwirować substrat TSA. W celu przeprowadzenia reakcji odczyn tyramidowy należy rozcieńczyć 1:50 w buforze rozcieńczającym do amplifikacji). Podczas tej inkubacji probówkę do mikrocentryfugi kładziemy poziomo. Czas reakcji musi zostać dobrany empirycznie dla każdej sondy.
2. Przemyć trzy razy, po 10 minut każdy, w PBST.

10. BARWIENIE JODKIEM PROPIDYNYM

1. Przemyć dwukrotnie przez 5 minut za każdym razem w 2 x SSC.
2. Inkubować zarodki przez 30 minut w temperaturze 37°C w 50 μl 2 x SSCT z dodatkiem 10 μl RNAse (do uzyskania końcowego stężenia 100μg/ml).
3. Przemyć sześciokrotnie przez 3 minuty za każdym razem w 2 x SSC w temperaturze pokojowej (RT).
4. Barwić zarodki przez 8 minut w roztworze jodku propidyny o stężeniu 330µg/ml w 2 x SSC.
5. Przemyć sześciokrotnie przez 3 minuty za każdym razem w 2 x SSC w temperaturze pokojowej (RT).
6. Utrwalić przez 20 minut w 4% PFA w PBS w temperaturze pokojowej (RT).
7. Przemyć dwukrotnie, przez 5 minut za każdym razem, w PBST w temperaturze pokojowej (RT).

11. MONTAŻ

1. Inkubuj zarodki przez 10 minut najpierw w 25%, a następnie w 50% glicerolu w PBST. Prześwietlaj przez noc w 75% glicerolu w temperaturze 4ºC.
2. Przeprowadzamy sekcję i usuwamy żółtko z zarodków, a następnie montujemy je płasko na szkiełku przedmiotowym. Żółtko może generować znaczną fluorescencję tła. Sekcja jest znacznie łatwiejsza po tym, jak zarodki zostały prześwietlone przez noc w glicerolu.

ROZTWORY:

PBST	PBS plus 0,1% Tween
SSCT	SSC plus 0,1% Tween
HYB-	50% formamid 5xSSC 0,1% Tween-20
HYB+	HYB- 5mg/ml RNA z drożdży torula 50μg/ml heparyny	RNA z drożdży torula przygotowuje się poprzez trawienie RNA proteinazą K z następującą ekstrakcją fenolem, fenolem i chloroformem oraz chloroformem. RNA jest wytrącane i rozpuszczane w wodzie traktowanej DEPC.
1 x bufor kwasu maleinowego	150mM kwasu maleinowego, 100mM NaCl (pH 7,5)

Rycina 1. Reprezentatywne wyniki podwójnej fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ w całym preparacie. (A-C). Obrazy przedstawiają pojedynczy przekrój konfokalny przez tylny region zarodka danio pręgowanego w stadium dziesięciu somitów. Widok grzbietowy, góra odpowiada kierunkowi przedniemu. Jądra barwione jodkiem propidyny są koloru niebieskiego. (A) mRNA deltaC wykryto przy użyciu ryboproby znakowanej digoksygeniną i odczynika TSA-Cy5. (B) mRNA transkrybowane z genu her1 wykryto za pomocą ryboproby znakowanej fluoresceiną i odczynika TSA-fluoresceina. (C) Nałożenie kanałów zielonego i czerwonego jednoznacznie identyfikuje obszary odrębnej lub nakładającej się ekspresji tych dwóch genów. (D, E) Detal ekspresji her1 demonstrujący wysoką rozdzielczość tej procedury. Wyraźnie można rozpoznać subkomórkową lokalizację mRNA. Grot strzałki wskazuje komórkę wykazującą aktywną transkrypcję, widoczną jako kropki barwienia w jądrze. Strzałki wskazują komórkę wykazującą cytoplazmatyczną lokalizację mRNA. (F, G) Podwójne barwienie na her1 i deltaC ujawnia komórki transkrybujące oba geny (biały grot strzałki) lub tylko jeden z nich (czerwone i zielone groty strzałek).

Dyskusja

Przedstawiony tutaj protokół sprawdza się w przypadku sond, które dają wyraźny i silny sygnał po 30–45 minutowym barwieniu w typowej reakcji z udziałem fosfatazy alkalicznej. Przed przeprowadzeniem protokołu fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ zawsze testujemy sondy, korzystając ze standardowego protokołu niefluorescencyjnego (dostępnego w materiałach uzupełniających wraz z protokołem syntezy sond). Uzyskano mniejszy sukces w zastosowaniu protokołu fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ przy użyciu słabszych sond, choć ...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Paraformaldehyd, roztwór 16%, stopień EM	Electron Microscopy Sciences	15710	Rozcieńczyć do 4% w 1,33x PBS (stężenie końcowe 1x). Przechowywać w aliquotach 2ml w temp. –20°C
Proteinaza K, rekombinowana, stopień PCR	Roche Group	03115879001	Przygotować roztwór stokowy 20mg/ml w wodzie. Przechowywać w aliquotach 1ml w temp. –20°C
Odczynnik blokujący	Roche Group	11096176001	Przygotować 10% roztwór stokowy w 1x buforze kwasu maleinowego. Przechowywać w aliquotach 50ml w temp. –20°C. Stabilny po wielokrotnym zamrażaniu i rozmrażaniu.
Przeciwciało anty-fluoresceina-POD, fragmenty Fab	Roche Group	11426346910	Podzielić na aliquoty i przechowywać w temp. -20°C. Jedną alikwotę roboczą przechowywać w temp. 4°C.
Przeciwciało anty-digoksygenina-POD, fragmenty Fab	Roche Group	11207739910	Jak wyżej.
System TSA Plus Fluorescein	PerkinElmer, Inc.	NEL741001KT	Przygotowywać każdą fiolkę odczynnika TSA dopiero w razie potrzeby. Rozpuścić w 60μl DMSO. Przechowywać w temp. 4°C.
System TSA Plus Cyanine5	PerkinElmer, Inc.	NEL745001KT	Jak wyżej
System TSA Plus Cyanine3	PerkinElmer, Inc.	NEL744001KT	Jak wyżej
Zestaw TSA #16 tyramida AlexaFluor647 (plus HRP-kozie przeciwciało anty-królicze IgG)	Molecular Probes, Life Technologies	T20926	Rozpuścić odczynnik tyramidowy w 150μl DMSO, podzielić na aliquoty i przechowywać w temp. –20°C.
Woda wolna od RNaz i DNaz	Roche Group	11119915001	Dostarczana jako roztwór 500μg/ml
Jodek propidyny	Molecular Probes, Life Technologies	P-3566	Dostarczany jako roztwór 1mg/ml w wodzie.