Mysz nadnerczy izolacji komórek chromochłonnych

Podsumowanie

Systemy hodowli komórek chromafinowych rdzenia nadnerczy są niezwykle użyteczne do badania sprzężenia pobudzenia z wydzielaniem w warunkach in vitro. Niniejszy protokół przedstawia metodę wykorzystywaną do wycięcia nadnerczy, a następnie izolacji obszaru rdzenia poprzez usunięcie kory nadnerczy. Następnie zaprezentowano proces trawienia rdzenia w celu uzyskania pojedynczych komórek chromafinowych.

Streszczenie

Układy kultur komórek chromafinnych rdzenia nadnerczy są niezwykle użyteczne do badania sprzężenia pobudzenia z sekrecją w warunkach in vitro. Niniejszy protokół przedstawia metodę wypreparowania nadnerczy, a następnie izolacji obszaru rdzenia poprzez usunięcie kory nadnerczy. Następnie zaprezentowano proces trawienia rdzenia w celu uzyskania pojedynczych komórek chromafinnych.

Protokół

Skróty:
ACCs – komórki chromafinne nadnerczy, E.Soln – roztwór enzymatyczny, E.DMEM – wzbogacone podłoże DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium)

1. Przygotowanie
   1. Dodać papainę do pożądanej ilości roztworu E. Soln (40 jednostek papainy / 1ml E. Soln.).
   2. Aktywować papainę karbogenem przez około 15 minut w temperaturze 0°C (na lodzie). W temperaturze 0°C (na lodzie) należy również napowietrzyć bufor Locke'a.
      
2. Disekcja
   1. Użyć myszy w wieku 8-10 tygodni.
   2. Przed trawieniem usunąć napowietrzony bufor Locke'a i umieścić go na lodzie.
   3. Procedurę disekcji przedstawiono w materiale wideo.
   4. Po wycięciu umieścić gruczoły w napowietrzonym buforze Locke'a.
      
3. Przygotowanie gruczołu
   1. Usunąć tłuszcz z gruczołu.
   2. Zdjąć korę z gruczołu.
      
4. Trawienie enzymatyczne
   1. Przefiltrować sterylnie napowietrzoną papainę.
   2. Przygotować cztery porcje napowietrzonej papainy na szalce Petriego.
      1. 3 porcje powinny wynosić około 100µl.
      2. 1 z porcji powinna wynosić około 400µl.
   3. Przemyć rdzenie nadzwyczajne przechodząc przez kolejne porcje
      1. Najpierw przez 3 porcje po 100µl.
      2. Następnie przez porcję 400µl
      3. Przenieść pipetą 300µl E.Soln wraz z fragmentami rdzenia z porcji 400µl do probówki do wirówki.
      4. Owiniąć probówkę parafilmem i umieścić w kąpieli wodnej o temperaturze 37°C na 20 min.
      5. Należy pamiętać o dalszym napowietrzaniu pozostałego roztworu E.Soln zawierającego papainę.
      6. Po 20 minutach przefiltrować sterylnie kolejną porcję E.Soln.
      7. Zastąpić stary roztwór E.Soln kąpiący rdzenie nowo przefiltrowanym roztworem E.Soln.
         
5. Trituracje
   1. Odssać i usunąć E.Soln.
   2. Przemyć rdzenie nadzwyczajne w 1ml E.DMEM.
   3. Odssać i usunąć E.DMEM.
   4. Dodać 300µl E.DMEM i przeprowadzić triturację 20 razy przy użyciu końcówki 1ml.
   5. Odciąć końcówkę 200µl sterylnym ostrzem żyletki.
   6. Przeprowadzić triturację 5-10 razy przy użyciu odciętej końcówki 200µl.
   7. Usunąć E.DMEM kąpiący fragmenty rdzenia. Pożywka będzie zawierać debris.
   8. Dodać 300µl świeżego E.DMEM do fragmentów rdzenia.
   9. Przeprowadzić triturację końcówką 200µl 20 razy
   10. Przenieść pipetą E.DMEM do probówki do wirówki, pozostawiając fragmenty rdzenia. Pożywka będzie zawierać wolne ACC.
   11. Dodać 300µl świeżego E.DMEM do fragmentów rdzenia.
   12. Przeprowadzić triturację rdzeni igłą strzykawki o rozmiarze 23.5 gauge 20 razy.
   13. Połączyć E.DMEM z obu etapów trituracji. Fragmenty rdzenia nie powinny być obecne i powinny mieć teraz wygląd pierzasty.
       
6. Wysiewanie
   1. Wirować E.DMEM z dwóch ostatnich etapów trituracji przez 2,5 minuty przy 3,7g.
   2. Resuspendować osad w 50µl-200µl E.DMEM, w zależności od dalszych eksperymentów.
   3. Nanieść 10-30µl na szklaną lamellkę.
   4. Odczekać 15 minut do czasu przytwierdzenia komórek.
   5. Dodać 750µl E.DMEM.