Mysz nadnerczy izolacji komórek chromochłonnych

Podsumowanie

Systemy hodowli komórek chromochłonnych rdzenia nadnerczy są niezwykle przydatne do badania sprzężenia pobudzenie-wydzielanie w warunkach in vitro. Protokół ten ilustruje metodę zastosowaną do wypreparowania nadnerczy, a następnie wyizolowania obszaru rdzeniowego poprzez usunięcie kory nadnerczy. Następnie demonstruje się trawienie rdzenia na pojedyncze komórki chromochłonne.

Streszczenie

Systemy hodowli komórek chromochłonnych rdzenia nadnerczy są niezwykle przydatne do badania sprzężenia wzbudzenie-wydzielanie w warunkach in vitro. Protokół ten ilustruje metodę zastosowaną do wypreparowania nadnerczy, a następnie wyizolowania obszaru rdzeniowego poprzez usunięcie kory nadnerczy. Następnie demonstruje się trawienie rdzenia na pojedyncze komórki chromochłonne.

Protokół

Skróty:
ACC - Komórki Chromochłonne Nadnerczy, E.Soln - Roztwór Enzymu, E.DMEM - Wzbogacone Zmodyfikowane Podłoże Orła Dulbecco

1. Przygotowanie
   1. Dodaj papainę do żądanej ilości E. Soln (40 jednostek papainy / 1 ml E. Soln.).
   2. Aktywuj papainę z karbogenem przez około 15 minut na lodzie. Dotlenij również bufor Locke'a na lodzie.
      
2. Analiza
   1. Użyj myszy 8-10 tygodniowej.
   2. Przed mineralizacją usuń natleniony bufor Locke'a i umieść na lodzie.
   3. Zapoznaj się z filmem, aby zapoznać się z procedurą sekcji.
   4. Po wycięciu umieść gruczoły w natleniznie buforze Locke'a.
      
3. Przygotowanie gruczołu
   1. Usuń tłuszcz z gruczołu.
   2. Usuń korę z gruczołu.
      
4. Trawienie
   enzymatyczne
   1. Sterylny filtr natleniony papaina.
   2. Zrób cztery kałuże natlenionej papainy na szalce Petriego.
      1. 3 baseny powinny mieć około 100uls.
      2. 1 z basenów powinien mieć około 400uls.
   3. Przemyć rdzenie przez kałuże
      1. 1. przez 3 baseny 100ul.
      2. Następnie przez basen 400ul
      3. Pippette 300ul E.Soln i kawałki rdzenia z 400ul łączą się w probówce do mikrofuge.
      4. Qrap parafilm na probówce do mikrofuge i umieścić w łaźni wodnej o temperaturze 37°C na 20 minut.
      5. Należy pamiętać o dalszym natlenianiu pozostałego E.Solnu zawierającego papainę.
      6. Po 20 minutach sterylny filtr więcej E.Soln.
      7. Zamień stare rdzenie kąpielowe E.Soln na nowo przefiltrowane E.Soln.
         
5. Tryturacje
   1. Odessać i wyrzucić E.Soln.
   2. Umyj rdzeń w 1 ml E.DMEM.
   3. Odessać i wyrzucić E.DMEM.
   4. Dodaj 300ul E.DMEM i rozcieraj 20X za pomocą końcówki 1 ml.
   5. Wytnij końcówkę 200ul sterylną żyletką.
   6. Rozcieraj 5-10X z ciętą końcówką 200ul.
   7. Wyrzuć kawałki rdzeni kąpielowych E.DMEM.  Podłoże będzie zawierało zanieczyszczenia.
   8. Dodaj 300uls świeżego E.DMEM do kawałków rdzenia.
   9. Cierć z końcówką 200ul 20x
   10. Pippette E.DMEM do rurki do mikrofuge z kawałkami rdzenia.  Podłoże będzie zawierało wolne ACC.
   11. Dodaj 300uls świeżego E.DMEM do kawałków rdzenia.
   12. Trójciąć rdzeń za pomocą igły strzykawkowej o rozmiarze 23,5 20x.
   13. Połącz E.DMEM z obu trituracji.  Kawałki rdzenia nie powinny być obecne i powinny teraz mieć wygląd przypominający pióra.
       
6. Poszycie
   1. Microfuge E.DMEM z ostatnich dwóch etapów rozcierania przez 2,5 minuty w 3,7 g s.
   2. Ponownie zawiesić pellet w 50uls-200 E.DMEM, w zależności od kolejnych eksperymentów.
   3. Płyta 10-30uls na szklanym szkiełku nakrywkowym.
   4. Odczekaj 15 minut, aż komórki się przylgną.
   5. Dodaj 750uls E.DMEM.