Wykrywanie ubikwitynacji białek

Podsumowanie

Ubikwitynacja jest kluczową modyfikacją potranslacyjną przeprowadzaną przez zestaw trzech enzymów. Mutacje genów zaangażowanych w tę modyfikację są powiązane z wieloma różnymi chorobami ludzi. W niniejszej pracy opisujemy protokoły wykrywania ubikwitynacji białek w hodowlach komórkowych in vivo oraz w probówkach in vitro.

Streszczenie

Ubikwitynacja, czyli kowalencyjne przyłączanie polipeptydu ubikwityny do białek docelowych, jest kluczową modyfikacją potranslacyjną przeprowadzaną przez zestaw trzech enzymów. Są to enzym aktywujący ubikwitynę E1, enzym konjugujący ubikwitynę E2 oraz ligaza ubikwityny E3. W przeciwieństwie do E1 i E2, ligazy ubikwityny E3 wykazują specyficzność względem substratu. Z kolei liczne enzymy deubikwitynujące pełnią role w przetwarzaniu białek poliubikwitynowanych. Ubikwitynacja może prowadzić do zmiany stabilności białek, ich lokalizacji komórkowej oraz aktywności biologicznej. Mutacje genów zaangażowanych w szlak ubikwitynacji/deubikwitynacji lub zaburzone funkcjonowanie systemu ubikwitynowego są powiązane z wieloma różnymi chorobami ludzi, takimi jak różne typy nowotworów, neurodegeneracja i zaburzenia metaboliczne. Wykrycie zmienionej lub prawidłowej ubikwitynacji białek docelowych może zapewnić lepsze zrozumienie patogenezy tych chorób.  W niniejszej pracy opisujemy protokoły wykrywania ubikwitynacji białek w hodowlach komórkowychin vivoi probówkiin vitroProtokoły te są również przydatne do wykrywania innych modyfikacji małymi cząsteczkami podobnymi do ubikwityny, takich jak sumoilacja i nedylacja.

Protokół

Wykrywanie ubikwitynacji białek w hodowlach komórkowych

1. Przeprowadzić transfekcję hodowlanych komórek plazmidami wykazującymi ekspresję białka docelowego oraz (wersją z etykietą epitopową) ubikwityny.
2. Przygotować kompletny bufor do lizy komórek (2% SDS, 150 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl, pH 8.0) z dodatkiem 2mM ortowanadanu sodu, 50 mM fluorku sodu oraz inhibitorów proteaz.
3. Zlizować komórki, używając 100 µl buforu do lizy komórek na płytkę (szalka 6 cm). W przypadku użycia większej szalki odpowiednio dostosować objętość.  Ostrożnie zakręcić szalką, aby bufor do lizy pokrył cały obszar wzrostu komórek.
4. Zebrać komórki za pomocą skrobaka do komórek i przenieść lizaty komórkowe do probówki typu Eppendorf o pojemności 1,5 ml. Natychmiast umieścić probówkę na płycie grzewczej i gotować przez 10 min.
5. Rozbić komórki za pomocą sonikatora.
6. Dodać 900ul buforu do rozcieńczania (10 mM Tris-HCl, pH 8.0, 150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 1% Triton). Inkubować próbki w temperaturze 4°C przez 30-60 min przy jednoczesnym obracaniu.
7. Wirować rozcieńczone próbki przy 20,000 x g przez 30 min. Przenieść otrzymany supernatant do nowej probówki Eppendorfa. Należy uważać, aby nie naruszyć osadu.
8. Zmierzyć stężenie białka.
9. Przygotować przeciwciała przeciwko białku docelowemu sprzężone z kuleczkami agarozy Protein A lub G w odpowiednim buforze (zawiesina 50%). Odciąć wąski koniec końcówki pipety P-200 i przenieść 14-20 μl żywicy do 500-1,500 μg przygotowanych lizatów komórkowych w celu przeprowadzenia immunoprecypitacji. W przypadku komórek o wysokiej wydajności transfekcji wystarczy 500 μg. W przypadku komórek o niskiej wydajności transfekcji może być wymagane więcej białka.
10. Inkubować mieszaninę lizatu komórkowego i kuleczek w temperaturze 4°C przez noc przy jednoczesnym obracaniu.
11. Odwirować kuleczki przy 5000 x g przez 5 min. Odessać supernatant. Przemyć żywicę dwukrotnie buforem do mycia (10 mM Tris-HCl, pH 8.0, 1 M NaCl, 1 mM EDTA, 1% NP-40).
12. Wirować kuleczki ostatni raz przy 20,000 x g przez 30 s. Odessać pozostały bufor do mycia i zagotować żywicę z 2X buforem do ładowania SDS.
13. Nanieść próbki na żel SDS-PAGE do analizy immunoblottingowej.
14. Wykryć ubikwitynę oraz białko docelowe za pomocą odpowiednich przeciwciał. W przypadku immunoblottingu zazwyczaj najpierw wykrywamy ubikwitynę. Membrana zostanie następnie wykorzystana do wykrycia białka wytrąconego.

Wykrywanie ubikwitynacji białka docelowego za pomocą testu ubikwitynacji in vitro

1. Przygotować bufor do ubikwitynacji 5X (100 mM Tris-HCl, pH 7.5, 25 mM MgCl2, 2.5 mM DTT, 10 mM ATP). Przechowywać go w małych alikwotach w temperaturze -20 °C przez maksymalnie 6 miesięcy. Niektóre protokoły zalecają dodanie do buforu fosfoalkoślanu kreatyny i kinazy kreatynowej w celu regeneracji ATP ^1,2.
2. Dla każdej reakcji przygotować mieszaninę zawierającą następujące składniki:
   

   8 μl	bufor do ubikwitynacji 5X
   250 ng	E1 ubikwitynacji
   500 ng	E2 ubikwitynacji
   0.5 μg	ubikwityna
   0.5 μg	białko docelowe
   	woda do uzyskania całkowitej objętości 40 μl

   Jako kontrole przygotować analogiczne reakcje z pominięciem E1, E2 lub ubikwityny.
3. Inkubować mieszaninę w temperaturze 37°C przez 1 godzinę lub dłużej.
4. Zatrzymać reakcję poprzez dodanie buforu do próbek SDS-PAGE i gotować próbkę przez 10 min.
5. Nanieść próbki na żel SDS-PAGE do analizy immunoblottingowej.
6. Wykryć ubikwitynę oraz białko docelowe za pomocą odpowiednich przeciwciał.

Dyskusja

W niniejszej prezentacji opisaliśmy w pierwszej kolejności etapy pozwalające na wykrycie modyfikacji ubikwitynowej białka docelowego w hodowlach komórek ssaków. Aby wykryć ubikwitynowanie specyficznie na białku docelowym, a nie na białkach oddziałujących niekowalencyjnie, zastosowaliśmy rygorystyczne warunki lizy komórek, immunoprecypitacji i przemywania ^1,3.  Ubikwitynowanie, wykryte poprzez immunoprecypitację białka docelowego w tak surowych warunkach, a następnie immunoblotting z użyciem przeciwciał an...