$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1) Przygotowanie do mikrochirurgii
- Stanowisko chirurgiczne musi być czyste i zdezynfekowane rozcieńczonym roztworem wybielacza przed rozłożeniem instrumentów i materiałów pomocniczych. Instrumenty należy poddać autoklawowaniu na 1 dzień przed operacją i przechowywać w sterylnym pojemniku. Włączyć sterylizator koralikowy (Fine Science Tools) używany do usuwania patogenów i zanieczyszczeń mikrobiologicznych z instrumentów pomiędzy zabiegami u różnych zwierząt.
- Podłączyć barierę termiczną służącą do utrzymania temperatury ciała podczas zabiegu chirurgicznego. Przygotować patyczki bawełniane i gaziki do kontroli krwawienia. Przygotować małe (< 2mm3) kawałki gąbki żelowej (Gel Foam) do mikrohemostazy i zanurzyć je w sterylnym roztworze soli fizjologicznej.
- Umieścić szczura w komorze indukcyjnej i znieczulić izofluranem (5% w tlenie, przepływ 2,0 L/min). Przenieść zwierzę z komory na stół preparacyjny i ogolić szeroki obszar futra w miejscu planowanego pola operacyjnego. Przetrzeć 70% alkoholem izopropylowym, zaczynając od środka pola i kierując się na zewnątrz, a następnie w ten sam sposób przemyć roztworem polihydroksydyny (Xenodine). Powtórzyć tę sekwencję przemywania 3 razy.
- Umieścić zwierzę na barierze termicznej, przykryć nos i pysk lejkiem do inhalacji, zmniejszyć stężenie izofluranu do 3% i przepływ do 0,2 L/min. Podać odpowiednią dawkę antybiotyku (ampicylina) w iniekcji podskórnej oraz analgetyku (buprenorfina 0,05 mg/kg) w iniekcji domięśniowej.
- Chirurg musi umyć ręce roztworem Xenodine i opłukać je wodą. Chirurg zakłada sterylną fartuch chirurgiczny; ręce należy osuszyć sterylnym ręcznikiem i założyć sterylne rękawiczki. Procedurę tę stosuje się przy każdym zabiegu chirurgicznym opisanym w tekście.
- Asystent zdejmuje pokrywkę zabezpieczającą sterylne instrumenty, a chirurg rozkłada instrumenty na sterylnym podkładzie.
2) Przecięcie nerwu obwodowego (PN) w celu wywołania degeneracji
- Przy zwierzęciu leżącym na boku wykonaj nacięcie w linii prostej od głowy kości udowej w kierunku kolana, zachowując równoległość i odległość około 3mm od kości udowej. Przetnij powierzchowne mięśnie dwugłowe uda wzdłuż tej samej linii co nacięcie skóry, aby odsłonić znajdujący się pod nimi mięsień obszerny boczny.
- Za pomocą nożyczek wykonaj małe nacięcie w mięśniu obszernym bocznym w pobliżu kolana i przedłuż je w górę w stronę głowy kości udowej. Ponownie, używając nożyczek, delikatnie rozdziel mięsień obszerny boczny, aż do momentu uwidocznienia połączonych gałęzi piszczelowej i strzałkowej nerwu kulszowego (biegnących równolegle do kości udowej).
- Śledź te gałęzie w kierunku głowy kości udowej, aż do zidentyfikowania głównego pnia nerwu kulszowego. Tuż poniżej rozwidlenia nerwu kulszowego użyj precyzyjnej pęsety, aby ostrożnie oddzielić tkankę łączną (epineurium) otaczającą gałąź nerwu piszczelowego (jest to gałąź większa).
- Po wyizolowaniu załóż jedwabną ligaturę 6-0 wokół nerwu piszczelowego i zaciśnij ją. Za pomocą mikronożyczek przetnij nerw rostralnie od ligatury. Przeciągnij nitkę szwy przez mięsień obszerny boczny i zawiąż w węzeł. Zapewni to punkt ułatwiający lokalizację przeciętego końca nerwu piszczelowego podczas pobierania nerwu za 7-10 dni.
- Degeneracja nerwu piszczelowego przed przeszczepieniem stwarza środowisko bardziej odpowiednie dla wzrostu aksonów niż świeża preparacja nerwu.
- Zamknij mięsień obszerny boczny szwami jedwabnymi 6-0. Zamknij mięsień dwugłowy uda szwami jedwabnymi 6-0. Zamknij skórę za pomocą klipsów chirurgicznych Michela. Wyłącz dopływ izofluranu, zdejmij maskę inhalacyjną, umieść zwierzę w klatce obserwacyjnej na barierze termicznej, a następnie przenieś do klatki domowej, gdy odzyska czujność i aktywność.
3) Usunięcie segmentu PN
- Zanurzyć zwierzę w narkozie, ogolić i oczyścić zamierzone pole operacyjne zgodnie z powyższym opisem (1.3). Umieścić zwierzę na barierze termicznej.
- Usunąć klamry ranne i rozdzielić poprzednie nacięcie skóry. Przeciąć szew powierzchownego mięśnia, aby odsłonić mięsień obszerny boczny (vastus lateralis), a następnie przeciąć szew w tym mięśniu.
- Podążać wzdłuż linii szwów, aby przeciąć koniec nerwu piszczelowego i usunąć szew z nerwu. Używając precyzyjnych pincetów, oddzielić epineurium od 15 mm odcinka nerwu piszczelowego i przeciąć ten dystalny koniec. Usunąć segment nerwu i zanurzyć go w sterylnym zrównoważonym roztworze soli Hanksa.
- Jeśli jest to eksperyment z przeszczepem heterologicznym, uśmiercić zwierzę poprzez doglebowe wstrzyknięcie Euthasolu do jam brzusznej. Jeśli jest to eksperyment z przeszczepem autologicznym, zamknąć mięśnie nogi i skórę zgodnie z opisem w punkcie 2.6, a następnie przygotować zwierzę do urazu rdzenia kręgowego na poziomie szyjnym, jak opisano poniżej.
4) Przecięcie połowiczne rdzenia kręgowego w odcinku szyjnym i transplantacja
Dzień 1
- Zanurzyć zwierzę w narkozie, ogolić i oczyścić planowane pole operacyjne zgodnie z powyższym opisem (1.3). Umieścić zwierzę na barierze termicznej. Podać antybiotyki i środki przeciwbólowe zgodnie z powyższymi instrukcjami (1.4).
- Zlokalizować wcięcie potyliczne oraz wystający wyrostek grzbietowy kręgu T2 i wykonać nacięcie na całej długości pomiędzy tymi punktami orientacyjnymi. Przeciąć w linii środkowej powierzchowny mięsień czworoboczny i oddzielić leżące pod nim mięśnie równoległobiałe szyjne. Rozsunąć mięśnie za pomocą rozwieracza.
- Głębokie mięśnie nadkolcowe należy odciąć od wyrostków grzbietowych kręgów C4, C5 i C6. Za pomocą kaniulek kuretażowych wykonać częściową laminektomię C5, aby odsłonić całą prawą stronę oraz przyśrodkową część lewej strony rdzenia kręgowego. Wykorzystać wystającą żyłę grzbietową jako punkt orientacyjny dla linii środkowej rdzenia kręgowego.
- Użyć ostrza mikroskalpela lub igły 30 G, aby przebić oponę twardą i rozszerzyć nacięcie nad rdzeniem kręgowym na poziomie C5. Wykonać niewielkie nacięcie w leżącej poniżej przestrzeni podpajęczynówkowej i oponie miękkiej.
- Za pomocą wyciągniętej szklanej mikrokaniuli rozpocząć aspirację grzbietowej, prawej strony rdzenia kręgowego, stosując delikatny nacisk i mikrochwytaki w celu oddzielenia tkanki i ułatwienia jej usunięcia. Kontynuować proces przez części pośrednią i brzuszną rdzenia kręgowego, aby stworzyć jamę o długości 2 mm, przebiegającą całkowicie od strony grzbietowej do brzusznej oraz od linii środkowej do bocznych opon mózgowych.
- Wprowadzić do jamy gąbkę żelową nasączoną solą fizjologiczną w celu uzyskania hemostazy.
- Wyjąć segment nerwu obwodowego z roztworu Hanksa. Delikatnie oddzielić epineurium od proksymalnych 3 mm segmentu nerwu i przyłożyć ten koniec do rostralnej ściany jamy po uszkodzeniu hemisekcyjnym. Przymocować segment szwem 10-0 przez epineurium do opony twardej, a następnie zaszyć oponę twardą nad wszczepionym końcem przeszczepu.
- Umieścić przeszczep pomiędzy 2 kawałkami membrany silastycznej (Biobrane) w celu ochrony i łatwej izolacji w późniejszym czasie. Umieścić go obok wyrostków kręgów C6, C7 i T1. Nie przykładać dystalnego końca nerwu do rdzenia kręgowego ani tkanki mięśniowej.
- Zamknąć mięśnie warstwowo szwem 4-0 i zamknąć nacięcie skóry za pomocą klipsów ranowych.
- Umieścić zwierzę w klatce obserwacyjnej na barierze termicznej i przenieść do klatki domowej, gdy odzyska czujność i aktywność.
Dzień 21
- Zanurzyć zwierzę w narkozie, ogolić i oczyścić planowane pole operacyjne zgodnie z powyższym opisem (1.3). Umieścić zwierzę na barierze termicznej i podać antybiotyki oraz leki przeciwbólowe zgodnie z powyższymi instrukcjami (1.4). Przeciąć powierzchowne szwy, aby odsłonić membranę silastykową otaczającą przeszczep nerwu. Ostrożnie uwolnić odcinek nerwu z membrany silastykowej za pomocą precyzyjnej pęsety i nożyczek sprężynowych, a następnie odsunąć go z pola operacyjnego.
- Wykonać częściową laminektomię po prawej stronie wyrostka kręgu C7). Przebić opony twarde i miękkie zgodnie z powyższym opisem (4.4) i poprzez aspirację przygotować w rdzeniu kręgowym na poziomie C7 jamę uszkodzenia w kwadrancie grzbietowym o objętości 1 mm3. Do hemostazy użyć gąbki żelowej nasączonej solą fizjologiczną, a następnie zastąpić ją gąbką żelową nasączoną chondroitynazą ABC. Prowadzić zabieg w miejscu uszkodzenia przez 15 minut, wymieniając gąbkę żelową nasączoną chondroitynazą co 5 minut.
- Przykryć zewnętrzną długość przeszczepu nerwu membraną silastykową. Zamknąć powierzchowne mięśnie szwami 4-0, a nacięcie skóry za pomocą klipsów chirurgicznych. Umieścić zwierzę w klatce obserwacyjnej na barierze termicznej i zwrócić do klatki domowej, gdy odzyska pełną świadomość i aktywność.
Dzień 23
- Zanurzyć zwierzę w znieczuleniu, ogolić i oczyścić planowane pole operacyjne zgodnie z powyższym opisem (1.3). Umieścić zwierzę na barierze termicznej oraz podać antybiotyki i leki przeciwbólowe jak opisano wyżej (1.4). Przeciąć powierzchowne szwy, aby odsłonić membranę silastykową otaczającą przeszczep nerwu. Nie naruszać przeszczepu, lecz odsłonić miejsce przeszczepu C7 i użyć strzykawki Hamiltona z wyciągniętą szklaną kaniulą, aby mikroiniekować 1μl chondroitynazy ABC w prawą stronę rdzenia kręgowego, około 1 mm dystalnie od miejsca przylegania przeszczepu do rdzenia kręgowego.
- Ostrożnie odwarstwić epineurium z dystalnych 2mm segmentu nerwu i dopasować ten koniec do jamy uszkodzenia C7. Unieruchomić segment za pomocą szwu 10-0, przechodząc przez epineurium do opony twardej.
- Zamknąć powierzchowne mięśnie szwami 4-0, a nacięcie skóry za pomocą klipsów chirurgicznych. Umieścić zwierzę w klatce obserwacyjnej na barierze termicznej i przenieść do klatki macierzystej, gdy tylko stanie się czujne i aktywne.
5) Rejestracja elektrofizjologiczna potencjału czynnościowego w przeszczepie i dystalnej części rdzenia kręgowego
- Aby określić, czy aktywność elektryczna jest przenoszona przez aksony, które zregenerowały się w PNG, należy najpierw odsłonić i wyizolować przeszczep. Podczas tej procedury należy zachować szczególną ostrożność, aby nie uszkodzić mechanicznie przeszczepu; w tym celu kluczowe jest zastosowanie membrany Silastic po umieszczeniu przeszczepu. Zwierzę należy znieczulić, ogolić i oczyścić planowane pole operacyjne zgodnie z powyższym opisem (1.3). Umieścić zwierzę na barierze termicznej.
- Po rozcięciu skóry i rozdzieleniu mięśni powierzchownych należy zidentyfikować paski membrany Silastic i ostrożnie odseparować je od przeszczepu.
- Za pomocą kleszczyków kostnych usunąć wyrostki grzbietowe kręgów bezpośrednio rostralnie i kaudalnie względem miejsc styku PNG z rdzeniem kręgowym. Podczas tego etapu należy uważać, aby nie naruszyć nadmiernie przeszczepu. W obu poziomach należy wykonać nacięcie opony twardej.
- W odległości około 1cm rostralnie od miejsca styku przeszczepu z rdzeniem kręgowym na poziomie C5 wprowadzić pojedynczą elektrodę stymulującą (stop platyny i irydu) do rdzenia kręgowego po stronie ipsilateralnej względem uszkodzenia, na głębokość około 1mm. Ostrożnie unieść środkową część przeszczepu na bipolarną elektrodę hakową. Podać pojedyncze impulsy stymulujące o natężeniu 10μA i czasie trwania 100μsec, a następnie ustalić, czy występują potencjały czynnościowe przemieszczające się przez aksony, które zregenerowały się w przeszczepie.
- Zamienić połączenia i pozycje przewodów tak, aby elektroda hakowa stała się elektrodą stymulującą, a pojedynczy przewód został wprowadzony do rdzenia kręgowego dystalnie względem miejsca styku PNG z rdzeniem kręgowym, i spróbować zarejestrować potencjały czynnościowe w rdzeniu kręgowym.
- Na koniec eksperymentu podać serię stymulacji o natężeniu 1mA i czasie trwania 100μsec z częstotliwością 50Hz przez łącznie 1hr. Eutanazować zwierzęta po 1hr, przeprowadzić perfuzję 4% paraformaldehydem i przygotować tkankę rdzenia kręgowego do detekcji immunocytochemicznej cFos w neuronach aktywowanych przez zregenerowane aksony w PNG.
6) Markowanie wsteczne neuronów regenerujących aksony do PNG oraz markowanie w przód aksonów regenerujących się z powrotem do rdzenia kręgowego
- W przypadku zwierząt, które nie zostały poddane pomiarom elektrofizjologicznym, możliwe jest zidentyfikowanie źródła aksonów wrastających w przeszczep oraz przebiegu ich zakończeń w rdzeniu kręgowym. Znieczulić zwierzę, ogolić i oczyścić planowane pole operacyjne zgodnie z powyższym opisem (1.3). Umieścić zwierzę na barierze termicznej i odsłonić PNG zgodnie z opisem w punkcie 6.1 powyżej.
- Za pomocą mikronożyczek przeciąć przeszczep w jego połowie i usunąć epineurium z przeciętych końców przeszczepu. Odchylić przecięte końce od siebie i ułożyć każdy z nich na oddzielnym arkuszu parafilmu.
- Umieścić tampon z gąbki żelowej nasączonej True Blue na proksymalnym przeciętym końcu, aby oznakować neurony, które dostarczyły akson do PNG. Umieścić tampon z gąbki żelowej nasączonej biotynilowaną dekstranoaminą (BDA) na dystalnym przeciętym końcu, aby oznakować aksony, które przechodzą z przeszczepu z powrotem do rdzenia kręgowego.
- Uśmiercić zwierzęta po 3-4 dniach, przeprowadzić perfuzję 4% paraformaldehydem i przygotować przekroje tkanek mózgu i rdzenia kręgowego do mikroskopii fluorescencyjnej w celu wykrycia neuronów oznakowanych True Blue lub do histochemii BDA w celu wykrycia oznakowanych aksonów.
7) Całkowite przerwanie rdzenia kręgowego w odcinku piersiowym i transplantacja
Niniejsza metoda stanowi alternatywne podejście do opisanego powyżej modelu uszkodzenia z jednoczesną hemisekcją szyjną. W tym przypadku wywołuje się cięższe, obustronne uszkodzenie, a następnie do jamy uszkodzenia wprowadza się segmenty nerwu obwodowego, aby połączyć rostralny i kaudalny pień uszkodzonego rdzenia kręgowego.
Dzień 1
- Zanurzyć zwierzę w narkozie, ogolić i oczyścić planowane pole operacyjne zgodnie z powyższym opisem (1.3). Umieścić zwierzę na barierze termicznej. Podać antybiotyki i leki przeciwbólowe zgodnie z powyższym opisem (1.4).
- Zidentyfikować poziom kręgu T12 w miejscu przyczepu ostatniego żebra. Wykonać nacięcie skóry od tego punktu w kierunku rostralnym nad wyrostkami kręgów T11, T10 i T9. Przeciąć powięź powierzchowną oraz mięśnie nadkolczyste przyczepione do tych trzech wyrostków.
- Wykonać całkowitą laminektomię wyrostka kręgu T10 (nad segmentem T12 rdzenia kręgowego). Użyć ostrza mikro-skalpela lub igły 30G, aby przebić oponę twardą i rozszerzyć nacięcie nad odcinkiem T12 rdzenia kręgowego. Wykonać niewielkie nacięcie w znajdującej się poniżej przestrzeni podpajęczynówkowej oraz w oponie miękkiej.
- Za pomocą wyciągniętej szklanej mikrokaniuli rozpocząć obustronną aspirację odcinka T12 rdzenia kręgowego, stosując delikatny nacisk i mikro-pincetę w celu oddzielenia tkanki i ułatwienia jej usunięcia. Kontynuować procedurę przez części pośrednią i brzuszną rdzenia kręgowego, aby utworzyć jamę o długości 3 mm, przebiegającą całkowicie od strony grzbietowej do brzusznej i pomiędzy oponami bocznymi.
- Użyć nasączonej solą fizjologiczną gąbki żelowej w celu uzyskania hemostazy, a następnie zastąpić ją gąbką żelową nasączoną chondroitynazą ABC. Traktować miejsce uszkodzenia przez 15 minut, wymieniając gąbkę żelową nasączoną chondroitynazą co 5 minut.
- Wyjąć segment nerwu obwodowego z roztworu Hanks. Delikatnie odsunąć epineurium z proksymalnych 4mm segmentu nerwu i odciąć odcinek tak, aby ściśle pasował pomiędzy rostralny i kaudalny pień po jednej stronie rdzenia kręgowego. Umieścić drugi segment obok pierwszego przeszczepionego odcinka, przylegając do drugiej strony rdzenia kręgowego. Zaszyć oponę twardą nad wszczepionymi przeszczepami i przykryć oponę twardą małym kawałkiem membrany silastycznej.
- Zamknąć mięśnie warstwowo szwem 4-0 i zamknąć nacięcie skóry za pomocą klipsów do ran.
- Umieścić zwierzę w klatce obserwacyjnej na barierze termicznej i przenieść do klatki macierzystej, gdy będzie ono czujne i aktywne.
Dzień 3
- Zanurzyć zwierzę w znieczuleniu, ogolić i oczyścić planowane pole operacyjne zgodnie z powyższym opisem (1.3). Umieścić zwierzę na barierze termicznej i podać antybiotyki oraz leki przeciwbólowe jak opisano wyżej (1.4). Przeciąć szwy powierzchowne, aby odsłonić membranę silikonową nad miejscem przeszczepu. Nie naruszać przeszczepu, lecz odsłonić rdzeń kręgowy w części ogonowej względem przeszczepu i za pomocą strzykawki Hamiltona z wyciągniętą szklaną kaniulą mikroiniekować 1μl chondroitynazy ABC po każdej stronie rdzenia kręgowego, około 1 mm dystalnie od miejsca przylegania przeszczepu do rdzenia kręgowego.
- Zamknąć powierzchowne mięśnie szwami 4-0, a nacięcie skóry za pomocą klipsów chirurgicznych. Umieścić zwierzę w klatce obserwacyjnej na barierze termicznej i przenieść do klatki domowej, gdy odzyska ono czujność i aktywność. Przeprowadzić stymulację i rejestrację elektrofizjologiczną oraz znakowanie tracerami zgodnie z opisem w punktach 5) i 6) powyżej.
8) Reprezentatywne wyniki
Po zoptymalizowaniu tej procedury segment nerwu obwodowego ściśle zintegruje się z rdzeniem kręgowym gospodarza. Aksony rdzeniowe wstępujące i zstępujące wnikną do przeszczepu, będą rosły w linii względnie prostej, równolegle do długości przeszczepu, i będą rozszerzać się do jego dystalnego końca z prędkością około 1 mm na dobę. Po dotarciu do końca dystalnego aksony przenikną do sąsiedzącego rdzenia kręgowego, pod warunkiem zastosowania chondroitynaz w celu usunięcia inhibicyjnych proteoglikanów z otaczającej tkanki bliznowatej. Łączność funkcjonalna zostanie określona na podstawie elektrofizjologicznego i immunocytochemicznego wykrycia odpowiedzi neuronów rdzenia kręgowego na stymulację aksonów wewnątrz przeszczepu. Korelacja anatomiczna w zakresie regeneracji funkcjonalnej zostanie oceniona poprzez śledzenie liczby i długości aksonów, które wysunęły się poza przeszczep nerwowy z powrotem do rdzenia kręgowego.