Obrazowanie żywych komórek w celu analizy dynamiki F-aktyny za pomocą fluorescencyjnej mikroskopii plamistej (FSM)

Podsumowanie

Wybór, mikroiniekcja i obrazowanie znakowanej fluorescencyjnie F-aktyny za pomocą fluorescencyjnej mikroskopii plamkowej (FSM).

Streszczenie

W niniejszym protokole opisujemy zastosowanie fluorescencyjnej mikroskopii plamistej (FSM) do rejestracji wysokorozdzielczych obrazów dynamiki aktyny w komórkach PtK1. Wyjątkową zaletą FSM jest możliwość obrazowania ruchu oraz kinetyki wymiany (montażu/demontażu) sieci F-aktyny w żywych komórkach. Technika ta jest szczególnie użyteczna przy wyznaczaniu pomiarów ilościowych dynamiki F-aktyny w połączeniu z oprogramowaniem do analizy obrazu (qFSM). Opisujemy proces wyboru, mikroiniekcji oraz wizualizacji fluorescencyjnych sond aktyny w żywych komórkach. Co istotne, podobne procedury można zastosować do wizualizacji innych kompleksów makromolekularnych. FSM została wykazana w badaniach mikrotubul, włókien pośrednich oraz kompleksów adhezyjnych.

Protokół

Sekcja 1: Pozyskiwanie aktyny znakowanej fluorescencyjnie do FSM

Wymagane materiały: oczyszczona aktyna, fluorofor (zalecane Alexa, X-rhodamina), bufor G, ultracentryfuga

1. Kluczowym elementem pozwalającym na uzyskanie wysokiej jakości filmów FSM jest prawidłowe znakowanie aktyny (lub innych białek cytoszkieletu) wybranym fluoroforem.
   Zalecamy stosowanie fluoroforów z serii Alexa (o długościach fali 488, 568) oraz pochodnych estru sukkynimidy X-rodaminy, które celują w odsłonięte reszty lizyny na powierzchni aktyny.
2. Przy wyborze fluoroforu i odpowiedniej długości fali należy upewnić się, że konfiguracja mikroskopu posiada odpowiednie filtry (wzbudzenia i emisji) oraz iluminatory (lampę łukową rtęciową i/lub lasery) dostosowane do użytego znacznika fluorescencyjnego. Zalecamy wybór długości fal z zakresu pomarańczowego do czerwonego (560-630 nm), aby zminimalizować efekty autofluorescencji i fotouszkodzeń oraz zapewnić kompatybilność z koniugatami GFP.
3. Czystą aktynę można wyizolować z tkanki mięśniowej szczura lub kurczaka, jednak wymaga to długotrwałej procedury ekstrakcji z acetonowego proszku mięśniowego. Acetonowy proszek mięśniowy można nabyć od firmy Invitrogen. Procedura znakowania nie jest omawiana w niniejszym protokole, ale można ją znaleźć tutaj[1]
4. Alternatywnie można zakupić znakowane białka aktyny od kilku dostawców, w tym Cytoskeleton Inc. oraz Invitrogen. Poprzez firmę Invitrogen dostępne są również usługi znakowania na zamówienie. Oczyszczoną, nieznakowaną aktynę (zarówno aktynę mięśniową, jak i niemięśniową) można nabyć w firmie Cytoskeleton Inc.
5. Niezależnie od tego, czy zdecydują się Państwo na zakup, czy na samodzielne przygotowanie znakowanej aktyny, należy upewnić się, że stosunek znakowania wynosi około 0,3 do 0,7 cząsteczek barwnika na monomer aktyny. Zbyt wysoki stosunek znakowania może wpłynąć na kinetykę wymiany (oraz wiązanie z białkami towarzyszącymi) filamentu aktynowego, natomiast zbyt niski stosunek znakowania doprowadzi do uzyskania słabo widocznych plamek (niski stosunek sygnału do szumu) i może spowodować problemy z mikroiniekcją (patrz poniżej). Jest to krytyczny czynnik dla uzyskania wysokiej jakości obrazów plamek.
6. Przed długotrwałym przechowywaniem roztwór znakowanej aktyny należy sklarować poprzez wirowanie przy 75 000 - 80 000×g przez 20 minut w temperaturze 4 °C. Znakowaną aktynę należy przechowywać w roztworze buforu G w temperaturze -80 °C. Wysoce zalecane jest przygotowanie aliquotów o objętości 2 µL, aby ograniczyć szkodliwe skutki wielokrotnego zamrażania i rozmrażania (prowadzące do powstawania nierozpuszczalnych agregatów). Należy unikać wystawiania roztworu znakowanej aktyny na bezpośrednie działanie światła (powoduje fotobleaching fluoroforów). Do długotrwałego przechowywania zalecamy stosowanie nieprzezroczystych probówek do mikrocentryfugi.

Sekcja 2: Przygotowanie komórek i mikroiniekcja znakowanej aktyny

Wymagane materiały: igły do mikroiniekcji, mikroszyca, mikroladery, podgrzane pożywki komórkowe, bufor do iniekcji, naczynie z lodem, mikroskop (pierścień fazowy, obiektyw fazowo-kontrastowy 40X), transjektor, wyciągacz igieł, mikromanipulator

1. Wiele typów komórek nadaje się do FSM, jednak uzyskanie wysokiej jakości obrazów spekli jest bezpośrednio zależne od powodzenia procedury mikroiniekcji. Przy wyborze komórek do FSM, komórki powinny być duże ( > (50 µm średnicy), powinny rozpłaszczać się po wysianiu i naturalnie przylegać do podłoży (lub plastikowych naczyń do hodowli tkankowej). Pomocne jest również, jeśli cytozol komórki zajmuje obszar większy niż jej jądro. Wyżej wymienione kryteria zapewniają, że komórki nadają się do mikroiniekcji. Do odpowiednich linii komórkowych należą (między innymi) PtK1[2,3], komórki płuca salamandry[4] oraz neurony Aplysia[3].
2. Komórki należy wysiać na kwadratowych szkiełkach nakrywkowych (22 x 22 mm; nr 1-1/2), które zostały poddane myciu kwasowemu. Na szkiełko nakrywkowe można nanieść standardową powłokę substratu, co nie wpłynie na proces mikroiniekcji.
3. Prawidłowy dobór igieł do mikroiniekcji zależy od wielkości otworu w ich wierzchołku. Typowo średnice otworów mogą wahać się od 0,5 $\mu$m do nawet 3 $\mu$m. Zaleca się jednak, aby w przypadku iniekcji aktyny optymalna wielkość otworu mieściła się w przedziale od 0,5 do 1 $\mu$m. Jeśli stale występują problemy z zapychaniem się igieł, zastosowanie większych otworów może umożliwić dostarczenie zarówno aktyny monomerycznej, jak i niepożądanych spolimeryzowanych filamentów aktynowych. Igły do mikroiniekcji można nabyć u kilku dostawców, w tym w firmie Eppendorf systems, która produkuje igły do mikroiniekcji femtotip. Alternatywnie, w przypadku dostępności komercyjnego wyciągacza igieł, szklane kapilary do mikroiniekcji można zakupić w firmie Sutter i wyciągnąć zgodnie z wymaganą specyfikacją. Początkującym zaleca się przygotowanie 10–20 wyciągniętych igieł przed rozpoczęciem procedury iniekcji.
4. Idealne „stężenie do iniekcji” (stężenie końcowe aktyny wprowadzanej do igły) wynosi od 0,5 do 1,0 μg/μl, przy założeniu 40% stosunku barwnika do monomeru aktyny. Niższy stosunek znakowania aktyny można zrekompensować poprzez iniekcję przy wyższych stężeniach (1–3 μg/μl). Zwiększy to jednak częstotliwość zatykania się igły. Można temu częściowo zapobiec, stosując igły o większych światłach. Stężenie zapasowe aktyny można rozcieńczyć, dodając lodowaty bufor do iniekcji. Do szybkich iniekcji do rozcieńczania można również użyć lodowatej wody ddH2O. Na tym etapie wszystkie roztwory robocze powinny być przechowywane w lodzie.
5. Nanieś od 0,5 do 1,0 µL roztworu aktyny, używając mikrosyringi (o wąskiej igle – Hamilton) lub alternatywnie końcówki do pipety typu microloader.
6. Ostrożnie dozuj roztwór aktyny, powoli uwalniając ciecz. Należy unikać powstawania pęcherzyków powietrza, jednak w razie ich pojawienia się można je łatwo usunąć, odsysając nadmiar cieczy otaczającej pęcherzyk.
7. Należy upewnić się, że roztwór aktyny spoczywa całkowicie na końcówce igły. Nadmiar roztworu w jakimkolwiek miejscu kapilary igły może zakłócić przepływ podczas wstrzykiwania.
8. Następnie ostrożnie przymocuj igłę do uchwytu iniektora, unikając kontaktu z jej czubkiem. Ustaw uchwyt tak, aby igła tworzyła kąt od 35 do 50 stopni z podstawą stolika mikroskopu. Preferowane są mniejsze kąty.
9. Obniż końcówkę igły tak, aby ledwo przebiła powierzchnię pożywki, w której znajdują się komórki.
10. Następnie ustaw końcówkę igły (bez jej obniżania) tak, aby znajdowała się bezpośrednio nad środkiem obiektywu. Jeśli końcówka igły jest wyrównana z obiektywem, przez okular powinna być widoczna jasna aureola. Jest to wierzchołek końcówki igły. Powolne przesuwanie igły na boki (za pomocą manipulatora) może pomóc w dokładniejszym zlokalizowaniu aureoli.
11. Dostosuj ostrość w osi Z mikroskopu, aż komórki będą wyraźnie widoczne. Następnie powoli opuszczaj końcówkę, aż halo będzie stopniowo się zwężać, by w końcu zbiec się w czubku igły – w tym czasie należy równocześnie kontrolować ostrość (pozycję Z). Dodatkowym elementem, na który należy zwrócić uwagę, jest trzon igły, który będzie rzucać liniowe cienie. Opuszczanie igły pozwoli stopniowo zdefiniować jej trzon. Po poprawnym wykonaniu tej czynności zarówno koniec igły, jak i komórki powinny być wyraźnie widoczne. W celu poprawy kontrastu może być wymagana niewielka regulacja pierścienia fazowego.
12. Podczas nawigacji należy upewnić się, że końcówka igły znajduje się wystarczająco wysoko nad komórkami, aby zapobiec jej złamaniu.
13. Podczas wyboru komórek do iniekcji należy zadbać o to, aby ich wolne krawędzie były skierowane w stronę końcówki igły. Zapewni to, że obszar o malejącej grubości komórki (od punktu najgrubszego, w którym znajduje się jądro, do najcieńszego punktu, jakim jest krawędź prowadząca) spotka się z końcówką igły, zamiast przebiegać równolegle do niej.
14. Ciśnienie igły powinno zostać ustawione w zakresie od 0,3 do 0,8 psi. Przyłożone stałe ciśnienie zapewni jednostajny przepływ roztworu aktyny.
15. Po wybraniu komórki do iniekcji, ustaw igłę tak, aby jej końcówka znajdowała się obok jądra (region perinuklearny, najgrubsza część komórki, w której jądro nie znajduje się bezpośrednio poniżej).
16. Powoli opuść i skoryguj położenie igły, aż jej czubek zacznie uciskać błonę, a następnie obniżaj ją stopniowo, dopóki czubek igły nie przebije błony. Jeśli igła całkowicie przebije błonę, komórka stanie się jaśniejsza; niezwłocznie po zauważeniu tej różnicy podnieś igłę, aby przestała dotykać komórki. Sam proces przebijania i wstrzykiwania potrwa od 0,5 do 2 sekund.
17. Przy prawidłowym wykonaniu kształt komórki pozostanie niezmieniony, natomiast zbyt duża ilość wstrzykniętego materiału spowoduje szybkie wciągnięcie krawędzi komórki, a w niektórych przypadkach można zaobserwować wręcz eksplozję komórki.
18. Jeśli podczas mikroiniekcji nie obserwuje się zmian w komórce (brak rozjaśnienia), końcówka igły może być zatkana. Można to sprawdzić, naciskając przycisk „clean” (oczyszczanie), jeśli jest on dostępny w transjektorze. W przypadku drożności spowoduje to znaczny wzrost stałego przepływu pod ciśnieniem, co będzie widoczne przez okulary – pojawi się obraz falowania, a okoliczne zanieczyszczenia zostaną rozproszone.
19. Jeśli końcówka igły jest zapchana, można zdecydować o wstawieniu nowej igły do mikroiniekcji lub spróbować odłamać końcówkę igły, delikatnie opuszczając ją, aż zostanie dociśnięta do szkiełka nakrywkowego, co spowoduje odłamanie samego wierzchołka. Obszar odłamania nie powinien przekraczać 1/5^th powierzchni ostrza igły (części igły, która zaczyna zbiegać się w punkt).
20. Kontynuuj wstrzykiwanie, poświęcając nie więcej niż 20–45 minut na każdą sesję mikrowstrzykiwania (czas ten zależy od typu komórek). Co do zasady zaleca się krótsze sesje, aby zminimalizować stres komórek.
21. Po zakończeniu mikroiniekcji należy wymienić pożywkę komórkową w naczyniu, dodając świeżą, uprzednio ogrzaną pożywkę. Następnie należy pozostawić komórki na 30 minut w inkubatorze w celu regeneracji przed przeprowadzeniem obrazowania. Pozwoli to również na wbudowanie aktyny w istniejącą sieć cytoszkieletu.

Sekcja 3: Montaż komory obrazowania

Wymagane materiały: szkiełko nakrywkowe, taśma dwustronna, patyczki higieniczne, pęseta, Valap, chusteczki Kimwipe, Oxyrase, medium obrazujące, żyletka, pipeta p200, czysty etanol

1. Zacznij od wstępnego ogrzania medium do obrazowania i rozmrożenia 15 µL alikwotu Oxyrase. Pamiętaj o ochronie światłoczułego preparatu oxyrase przed światłem. Dodatek oxyrase znacznie zredukuje efekty fotobielenia.
2. Wstępnie ogrzej valap, ustawiając niską temperaturę płyty grzewczej. Nie przegrzej i nie przypal valapu, ponieważ utraci on skuteczność jako uszczelniacz.
3. Przetrzyj szkiełko przedmiotowe za pomocą chusteczki kimwipe nasączonej czystym etanolem, aby oczyścić je i usunąć drobne zanieczyszczenia.
4. Ułóż dwa równe odcinki (o długości 2,5 cm) taśmy dwustronnej jeden na drugim, wykorzystując czystą, płaską powierzchnię jako podstawę. Wciśnij wszelkie uwięzione pęcherzyki powietrza, aby stworzyć całkowicie płaską powierzchnię.
5. Za pomocą żyletki przetnij dwa proste paski wzdłuż dłuższej osi, tak aby każdy pasek miał szerokość 0,5 cm.
6. Za pomocą pęsety przyłóż każdy pasek do dłuższego brzegu szkiełka przedmiotowego w taki sposób, aby dwa paski taśmy stworzyły szczelinę w centrum szkiełka. Delikatnie dociśnij taśmę, aby uzyskać szczelne połączenie ze szkłem. Paski taśmy będą pełnić funkcję dystansów między szkiełkiem przedmiotowym a nakrywką.
7. Upewnij się, że valap całkowicie się upłynnił przed rozpoczęciem następnego kroku.
8. Pobierz wstępnie ogrzane medium do obrazowania, dodając 15 µL oxyrase na każde 500 µL medium.
9. Złóż chusteczki kimwipe w trójkąty, aby uzyskać 3 ostre krawędzie. Posłużą one do stworzenia suchej powierzchni, do której przylepi się taśma.
10. Wyjmij komórki z inkubatora. Za pomocą pęsety chwyć róg nakrywki. Szybko połóż nakrywkę na chusteczce kimwipe (stroną z komórkami do góry, aby nie dotykały tkanki) i użyj złożonej chusteczki do przetarcia dwóch przeciwległych stron nakrywki, aby stworzyć powierzchnię półsuchą (na stronie, na której spoczywają komórki).
11. Za pomocą pęsety chwyć róg nakrywki i połóż ją na szkiełku przedmiotowym tak, aby suche powierzchnie były wyrównane z dwoma paskami taśmy. Zauważ, że masz teraz dwie strony zamknięte i dwie otwarte szczeliny. Powoli pipetuj 200 µL roztworu medium do obrazowania z oxyrase blisko jednego z otworów. Ważne jest, aby nie wprowadzić pęcherzyków powietrza. Roztwór powinien zostać wciągnięty do nowo zmontowanej komory przez siły kapilarne, całkowicie zanurzając komórki w roztworze.
12. Za pomocą patyczka higienicznego nanieś roztopiony valap na cztery narożniki nakrywki, aby szybko przymocować i ustabilizować nakrywkę. Zauważysz, że valap wysycha natychmiast (w ciągu kilku sekund w temperaturze pokojowej).
13. Zacznij teraz od stron otwartych (tych bez taśmy), nakładając cienki pasek valapu za pomocą patyczka higienicznego, naśladując ruch pędzla. Powtórz czynność dla stron zamkniętych. Powoli nakładaj kolejne warstwy valapu, wzmacniając uszczelnienie poprzez powtarzanie kroków powlekania. Valap powinien być ograniczony do krawędzi, pozostawiając środek nakrywki czystym.
14. Delikatnie oczyść środkową część nakrywki, używając patyczka higienicznego z ddH₂O w celu usunięcia pozostałości medium, uważając, aby nie zmiażdżyć komórek. Powtórz etap oczyszczania z użyciem czystego etanolu.
15. Otrzymasz teraz całkowicie zamkniętą komorę obrazującą, zoptymalizowaną do obrazowania plamek (speckle imaging). Całkowicie szczelna obudowa zapobiegnie szybkiemu fotobieleniu fluoroforów.

Sekcja 4: Obrazowanie komórek

Wymagane materiały: odwrócony mikroskop szerokopolowy, lampa rtęciowa, odpowiednie filtry, chłodzona kamera CCD z pikselami o rozmiarze 6,7 micron, plan-apochromatyczne obiektywy imersyjne z wysoką aperturą numeryczną (60X do 100X, faza lub DIC). Stół wibroizolacyjny. Oprogramowanie do obrazowania.

1. Podgrzej stołyk mikroskopu do 37 °C. Umieść przygotowaną komorę obrazową i odczekaj 10-15 minut, aż temperatura się ustabilizuje przed rozpoczęciem obrazowania.
2. Zacznij od ustawienia ostrości na komórkach w świetle przechodzącym, a następnie odszukaj komórki poddane mikroiniekcji, przełączając odpowiednie ustawienia fluorescencji. Staraj się minimalizować czas ekspozycji na fluorescencję, aby ograniczyć fotowyblakanie.
3. Szukaj zainiekowanych komórek, które mają zdrowe, zakrzywione krawędzie przednie. Komórki nadmiernie zainiekowane (komórki „rozsadzone”) będą charakteryzować się cofniętymi i poszarpanymi krawędziami przypominającymi liczne filopodia – unikaj obrazowania takich komórek.
4. Ustawienia akwizycji będą zależeć od typu komórek, jakości znakowanej aktyny oraz komponentów mikroskopu. Niemniej jednak czas ekspozycji nie powinien przekraczać 2 sekund, a odstęp czasu między klatkami powinien być ustawiony w przedziale od 5 do 10 sekund. Typowa długość serii czasowej (na jedną obrazowaną komórkę) może wynosić od 10 do 30 minut i jest ograniczona efektami fotowyblakania. Wzmocnienie (gain) w kamerze można zwiększyć, aby poprawić stosunek sygnału do szumu.
5. Idealna charakterystyka plamek (speckles) powinna polegać na tym, że każda plamka jest oddalona od sąsiedniej o około 2 średnice plamki. Zapewni to optymalne próbkowanie przestrzenne i czasowe struktury aktyny. W przypadku komórek nabłonkowych nakrapiana sieć aktynowa będzie wyglądać homogenicznie, z równomiernie rozłożonymi plamkami. Linie komórkowe z gęstymi włóknami stresowymi lub lamelipodiami będą rozróżnialne, ale będą miały wygląd kropkowany/nakrapiany. Ustawienia ekspozycji należy dostosować tak, aby uzyskać najlepsze obrazy nakrapiane.
6. Komórki nadmiernie poddane mikroiniekcji będą miały gęsto upakowane plamki, które nie będą wydawać się rozdzielne. Włókna stresowe i lamelipodia utracą swój kropkowany wygląd.
7. Komórki niedostatecznie poddane mikroiniekcji będą wydawać się bardzo ciemne w okularze, zawierając plamki, które są od siebie oddalone (>10 plamek odstępu) i wydają się rozrzucone losowo. Włókna stresowe i lamelipodia w tych komórkach będą nierozróżnialne.
8. Kluczem do uzyskania „dobrych” filmów z plamkami jest utrzymanie ostrości. Jest to szczególnie istotne w przypadku analizy potranskrypcyjnej obejmującej pomiary przepływu i wymiany plamek. Zatem jakość analizy ilościowej będzie zależeć od zablokowania ostrości na czas trwania serii czasowej (time-lapse). Może to być szczególnie trudne, jeśli płaszczyzna obrazowania jest bardzo cienka. Inne czynniki będą zależeć od stabilności systemu mikroskopowego, w szczególności od obudowy stołyka i komory obrazowej. Można zastosować ustawianie ostrości w oparciu o kontrast, jeśli odstępy między obrazami są wystarczające, aby obsłużyć tę funkcję. Inne opcje obejmują zakup systemu ustawiania ostrości w bliskiej podczerwieni, który zapewnia niezawodne regulacje ostrości w czasie rzeczywistym. Takie rozwiązania oferują firmy Nikon, Olympus i ASI.

Sekcja 5: Analiza qFSM

Ta sekcja nie jest omawiana szczegółowo, ale informacje na temat oprogramowania analitycznego można znaleźć tutaj [5]. Prośby o pobranie oprogramowania można składać na naszej stronie internetowej (lccb.scripps.edu).

Omówione zagadnienia:

• Kalibracja szumów
• Detekcja plamek (speckles)
• Śledzenie z wykorzystaniem podejścia hybrydowego, łączącego śledzenie grubego ruchu obszarów plamek w oparciu o korelację obrazów oraz śledzenie pojedynczych cząstek w celu analizy szczegółowego ruchu poszczególnych plamek.
• Obliczanie szybkości montażu i demontażu polimerów na podstawie fluktuacji intensywności podczas zdarzeń pojawiania się i znikania plamek.

Dyskusja

Kilka kluczowych czynników ma decydujące znaczenie dla pomyślnego uzyskania obrazów plamek (speckles), jednak wysokiej jakości plamki zależą przede wszystkim od jakości fluorescencyjnie znakowanej aktyny. Wysoki stosunek barwnika do monomeru aktyny, ustalony na poziomie około 0,4 do 0,7, zapewni, że plamki będą jasne i wyraźne, natomiast samo znakowane białko powinno być rozpuszczalne i wolne od agregatów. Równie ważna jest procedura mikroiniekcji. Aby zapewnić prawidłową homeostazę (i przeżycie) komórek, należy wstrzyki...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Bufor do wstrzykiwania (IB) 50 mM glutaminian potasu 0,5 M MgCl2 (DODATEK 2A) Przechowywać do 2 lat w temperaturze −20° C Bufor G 2 mM Tris⋅Cl, pH 8,0 (DODATEK 2A) 0,2 mM CaCl2 (DODATEK 2A) Dodać bezpośrednio przed użyciem: 0,2 mM ATP (patrz przepis dla 100 mM) 0,5 mM 2-merkaptoetanolu–etanol Przechowywać do 1 doby w temperaturze 4°C° C