Elektroporacja in utero oraz ex vivo w celu ekspresji genów w komórkach zwojowych siatkówki myszy

Podsumowanie

W niniejszej pracy przedstawiamy dwie techniki manipulowania ekspresją genów w komórkach zwojowych siatkówki (RGCs) myszy za pomocą elektroporacji in utero oraz ex vivo. Techniki te pozwalają badać, w jaki sposób zmiany w ekspresji genów wpływają na rozwój RGCs, prowadzenie aksonów oraz właściwości funkcjonalne.

Streszczenie

Siatkówka oraz jej jedyny neuron wyjściowy, komórka zwojowa siatkówki (RGC), stanowią doskonały model do badania zagadnień biologicznych, takich jak różnicowanie komórek, prowadzenie aksonów, organizacja retinotopowa oraz tworzenie synaps[1]. Jedną z wad jest brak możliwości efektywnej i niezawodnej manipulacji ekspresją genów w komórkach RGC. in vivo, zwłaszcza w inaczej dostępnych szlakach wzrokowych myszy. Myszy transgeniczne mogą być wykorzystywane do manipulowania ekspresją genów, jednak podejście to jest często kosztowne, czasochłonne i może wywoływać niepożądane efekty uboczne. U kurcząt w celu manipulacji ekspresją genów w komórkach zwojowych siatkówki (RGC) w badaniach nad rozwojem siatkówki i RGC stosuje się elektroporację in ovo. Chociaż podobne techniki elektroporacji opracowano dla noworodków myszy[2], dorosłych szczurów[3] oraz embrionalnych siatkówek myszy in vitro[4], żadna z tych strategii nie pozwala na pełną charakterystykę rozwoju RGC i projekcji aksonalnych in vivoW tym celu opracowaliśmy dwa zastosowania elektroporacji, z których jedno wewnątrzmacicznie a pozostały ex vivo, aby precyzyjnie ukierunkować działanie na embrionalne komórki zwoju siatkówki (RGC) myszy[5, 6].

Dzięki elektroporacji siatkówki in utero możemy wprowadzać nadekspresję lub obniżać poziom ekspresji konkretnych genów w RGC, a następnie śledzić projekcje ich aksonów w drogach wzrokowych in vivo, co umożliwia badanie decyzji dotyczących prowadzenia aksonów w punktach pośrednich, takich jak skrzyżowanie wzrokowe, lub w obszarach docelowych, takich jak boczne ciało kolankowate. Zaburzenie ekspresji genów w podzbiorze RGC na tle organizmu typu dzikiego ułatwia zrozumienie funkcji genów w całej drodze siatkówkowej. Ponadto opracowaliśmy towarzyszącą technikę analizy wzrostu aksonów RGC in vitro. Przeprowadzamy elektroporację głów embrionalnych ex vivo, pobieramy i inkubujemy całą siatkówkę, a następnie po kilku dniach przygotowujemy eksplantaty z tych siatkówek. Eksplantaty siatkówki mogą być wykorzystywane w różnych testach in vitro w celu zbadania reakcji elektroporowanych aksonów RGC na sygnały prowadzące lub inne czynniki. Podsumowując, ten zestaw technik zwiększa nasze możliwości wprowadzania nadekspresji lub obniżania poziomu ekspresji genów w RGC i powinien w znacznym stopniu pomóc w badaniach nad rozwojem RGC i projekcjami aksonów.

Protokół

Część 1: Przygotowanie do elektroporacji siatkówki in utero oraz ex vivo

1. W przypadku elektroporacji siatkówki zarówno in utero, jak i ex vivo

• Użyć wyciągacza elektrod do przygotowania cienkich mikropipet, a następnie przełamać końcówkę (lub ją ściąć), aby uzyskać skośny czubek.
• Przygotować roztwory DNA o pożądanych stężeniach i dodać niewielką ilość barwnika Fast Green (0,05%) w celu wizualizacji iniekcji. Zaleca się stosowanie 5 μl roztworu DNA na samicę w przypadku elektroporacji siatkówki in utero oraz 1 μl roztworu DNA na głowę embrionu w przypadku elektroporacji siatkówki ex vivo. Należy dołączyć konstrukt ekspresyjny GFP (lub innego białka fluorescencyjnego), aby umożliwić wizualizację transfektowanych neuronów.
• Zasterylizować narzędzia chirurgiczne w autoklawie.
• Przygotować mieszankę anestetyczną ketaminy i ksylazyny w następującym stosunku (przygotowując ~0,2 ml dla każdej ciężarnej samicy): objętościowy stosunek 1,0:0,2:4,6 dla 100 μg/ml ketaminy : 100 μg/ml ksylazyny : soli fizjologicznej. Można zastosować inne środki anestetyczne.

2. Wyłącznie dla elektroporacji siatkówki in utero

• Włącz podkładkę grzewczą i przykryj ją pieluchomają.
• Przygotuj roztwór antybiotyku i przeciwgrzybiczego środka (1:100) w buforze fosforanowym (PBS) i ogrzej go na podkładce grzewczej. Przygotuj około 2 ml dla każdej matki.
• Umieść sterylnie filtrowany PBS w ciepłej kąpieli wodnej.

3. Wyłącznie dla elektroporacji siatkówki ex vivo

• Przygotuj natlenioną pożywkę bezzużyteczną z surowicą (SFM) do inkubacji siatkówki: Napowietrzaj 25 ml DMEM/F12 mieszanką 95% tlenu/5% dwutlenku węgla przez ≥ 2 godziny. Do 25 ml natlenionej pożywki dodaj 0,25 g albuminy surowicy bydlęcej (BSA), 250 μl suplementu ITS oraz 50 μl roztworu penicyliny i streptomycyny. Wymieszaj roztwór, aby rozpuścić BSA, a następnie przefiltruj roztwór sterylnie. Roztwór ten należy przygotowywać na świeżo dla każdego eksperymentu z elektroporacji.
• Przygotuj pożywkę SFM + 0,4% metylocelulozy do inkubacji eksplantów siatkówki: Autoklawuj 0,20 g metylocelulozy w butelce o pojemności 150 ml z magnesem mieszającym. Przygotuj 50 ml SFM (jak wyżej, bez napowietrzania) i dodaj do autoklawowanej butelki z metylocelulozą. Mieszaj ten roztwór w temperaturze 4°C przez noc. Następnego dnia przefiltruj ten roztwór sterylnie i przechowuj w 4°C; roztwór ten może być przechowywany przez ok. 1 miesiąc.
• W dniu pobierania eksplantów siatkówki (Część 5), przygotuj naczynia do wysiewu eksplantów siatkówki: Pokryj naczynia hodowlane z szklanym dnem 250 μl poly-L-ornityny przez ≥ 2 godziny w 37°C. (Alternatywnie naczynia można pokryć poly-L-ornityną w dniu poprzednim i inkubować przez noc w 4°C). Przemyj naczynia kilkukrotnie PBS, a następnie pokryj naczynia 200 μl lamininy w stężeniu 10 μg/ml w DMEM/F12 przez ≥ 2 godziny w 37°C. Przemyj naczynia kilkukrotnie PBS w 37°C i pozostaw w PBS do momentu, aż eksplanty będą gotowe do wysiewu.
• W przypadku testów granic (border assays), pokryj naczynia poly-ornityną jak opisano wyżej, a następnie pokryj połowę naczynia białkiem zainteresowania wraz z markerem fluorescencyjnym w celu wizualizacji granicy (np. Alexa Fluor 555 sprzężony z BSA, 1:800) przez 2 godziny w 37°C. Przemyj PBS, a następnie dodaj lamininę zgodnie z powyższym opisem.

Część 2A: Elektroporacja siatkówki in utero Wstrzykiwanie i elektroporacja DNA do siatkówek mysich w stadium E14.5 in vivo

1. Wstrzyknij 0,15 ml mieszanki anestetycznej do jamy brzusznej (i.p.) samicy w stadium E13.5-E14.5. Osiągnięcie chirurgicznej płaszczyzny znieczulenia powinno zająć od 3 do 7 minut. W pełni znieczulona mysz nie powinna reagować na uciśnięcie tylnej łapy.
2. W tym czasie odetnij mały kawałek parafilmu i nanieś pipetą ~5 µl roztworu DNA na parafilm. Zegnij tłok (metalowy drut) pod kątem 90° i włóż go do wyciągniętej mikropipety. Za pomocą tłoka zassij roztwór DNA do mikropipety (proces ten można ułatwić, korzystając z mikroskopu stereoskopowego).
3. Gdy samica osiągnie chirurgiczną płaszczyznę znieczulenia, użyj maszynki do golenia, aby ogolić obszar o szerokości ~2 cali na brzuchu samicy, a następnie połóż ją na plecach na podgrzewaczu. Przygotuj ogoloną okolicę, przecierając ją najpierw gazikiem nasączonym alkoholem, a następnie gazikiem z jodyną, powtórz tę czynność co najmniej dwukrotnie. Na każde oko nanieś kroplę okulistej maści weterynaryjnej, aby zapobiec owrzodzeniu rogówki podczas narkozy ogólnej.
   
4. Za pomocą pincety uchwyć skórę i użyj nożyczek, aby wykonać pionowe nacięcie wzdłuż linii środkowej (~1 cal długości) przez skórę i mięśnie brzucha, odsłaniając otrzewną. Unieś otrzewną pincetą i wykonaj podobne pionowe nacięcie przez tę błonę, aby odsłonić jamę brzuszną (Rysunek 1). Następnie obłóż pole operacyjne gazikami, aby zapobiec kontaktowi zawartości jamy brzusznej z sierścią zwierzęcia i jej zanieczyszczeniu.
5. Odciągnij skórę i otrzewną pincetą i za pomocą szpatułki do dyssekcji wyciągnij zarodek przez nacięcie (wybierz zarodek najbardziej dostępny). Umieść szpatułkę między dwoma zarodkami i delikatnie wyciągnij łańcuch zarodków z jamy brzusznej. Łańcuch zarodków można wyciągnąć palcami.
   *Od tego momentu utrzymuj zarodki w nawilżeniu za pomocą sterylnego PBS*
6. Pozostaw samicę na podgrzewaczu, umieść ją pod mikroskopem stereoskopowym i przesuń zarodek tak, aby siatkówka była skierowana ku górze. Zaleca się rozpoczęcie od zarodka najbardziej przyśrodkowego lub bocznego, co ułatwia śledzenie, które zarodki zostały poddane elektroporacji.
7. Trzymaj mikropipetę w dominującej ręce, a zarodek stabilizuj drugą ręką. Za pomocą mikropipety przebij siatkówkę przez ścianę macicy i worek owodniowy. W zależności od ostrości mikropipety może być wymagany spory nacisk, aby przebić ścianę macicy, ale po przejściu przez nią mikropipeta wejdzie do zarodka, a idealnie do siatkówki. Kontrola i ocena głębokości wprowadzenia mikropipety do zarodka może być trudna. Po przebiciu błony zminimalizuj ruchy mikropipety, aby zapobiec powiększeniu otworu wlotowego, co mogłoby doprowadzić do wycieku płynu owodniowego i śmierci zarodka. Unikaj przebijania naczyń krwionośnych w ścianie macicy, ponieważ spowoduje to krwawienie i śmierć zarodka.
8. Gdy będziesz mieć pewność, że mikropipeta wniknęła do siatkówki, możesz wprowadzić roztwór DNA do siatkówki. Powoli wciśnij tłok i jednocześnie wycofuj mikropipetę, upewniając się, że DNA jest wstrzykiwane wzdłuż całej drogi mikropipety, ponieważ ta często wnika głęboko poza siatkówkę. Jeśli znajdujesz się w siatkówce, wstrzyknij 0,5 µl (można to zmierzyć za pomocą znaczników 1 µl na mikropipecie) do przestrzeni pozasiatkówkowej między zewnętrzną warstwą siatkówki a nabłonkiem barwnikowym siatkówki (RPE). Powinieneś zaobserwować zielony barwnik wypełniający siatkówkę i wyciekający do płynu owodniowego (Rysunek 1).
9. Elektrody do elektroporacji powinny być przechowywane w naczyniu Petri z PBS podczas operacji. Delikatnie umieść elektrody po bokach głowy zarodka, tak aby elektroda dodatnia (+) znajdowała się po tej samej stronie co wstrzyknięte oko. Zastosuj umiarkowany nacisk, aby ustabilizować głowę, ale nie naciskaj zbyt mocno, ponieważ spowoduje to pęknięcie worka owodniowego i śmierć zarodka. Gdy elektrody będą na miejscu, podaj 5 prostokątnych impulsów o napięciu 40 V i czasie trwania 50 ms z częstotliwością 60 Hz. Drżenie samicy spowodowane ucieczką prądu do skóry i mięśni nie jest zjawiskiem niezwykłym.
10. Powtórz kroki 7-9 dla każdego zarodka, który ma zostać poddany iniekcji i elektroporacji. Zazwyczaj poddaję elektroporacji 4-8 zarodków od jednej samicy, w zależności od ilości DNA, liczby zarodków, stanu samicy i czasu trwania znieczulenia. Alternatywnie można wstrzyknąć roztwór do wielu zarodków, a następnie przeprowadzić elektroporację wszystkich razem, zamiast iniekcji i elektroporacji każdego zarodka oddzielnie.
11. Po elektroporacji zarodków użyj pincety i szpatułki, aby umieścić łańcuch zarodków z powrotem w jamie brzusznej. Wlej ~2 ml roztworu antybiotykowo-antymikotycznego do jamy brzusznej.
12. Za pomocą hemostatu i pincety zszyj otrzewną, zaczynając od podwójnego węzła w przedniej części nacięcia, a następnie kontynuuj prostym szwem ciągłym do tylnej części nacięcia. Użyj ostatniej pętli do zawiązania szwu i odetnij nadmiar nici.
13. Aby zamknąć nacięcie zszywkami, unieś skórę w przedniej części nacięcia tępą pincetą, uważając, aby oddzielić skórę od otrzewnej. Umieść zęby zszywacza wokół skóry i naciśnij zszywacz. Kontynuuj zapinanie nacięcia do końca tylnego, co zazwyczaj wymaga 5-7 zszywek. Przetrzyj ranę wokół zszywek gazikiem nasączonym alkoholem.
14. Pozostaw samicę do wybudzenia na podgrzewaczu (zazwyczaj zajmuje to od 15 do 90 minut), a gdy zacznie się obracać, przenieś ją do nowej klatki brzuchem do góry.
15. Aby zminimalizować ból i dyskomfort, samice otrzymują buprenorfinę (0,05-0,1 mg/kg, s.c.) po wybudzeniu, a w późniejszych odstępach czasu, jeśli dyskomfort będzie się utrzymywał. Aby zapobiec odwodnieniu, wstrzyknij samicy podskórnie (s.c.) 1,0 ml soli fizjologicznej ~2-4 godziny po operacji, a następnie wieczorem i następnego dnia, jeśli będzie to konieczne. 24 godziny po operacji samica powinna odzyskać normalne zachowanie, pić i jeść regularnie.

Część 2B: Elektroporacja siatkówki in utero Pobieranie elektroporowanej siatkówki w dniu E18.5

1. Przygotować 4% paraformaldehyd (PFA) w PBS, obliczając ~5 ml na embrion. Perfuzję można przeprowadzić za pomocą grawitacyjnego systemu infuzyjnego lub pompy strzykawkowej. (Alternatywnie głowy w stadium E18.5 można po prostu zanurzyć w 4% PFA na noc).
2. Wstrzyknąć matce 0,2 ml mieszaniny anestetyków d.o. (dojecznie) i upewnić się, że zwierzę jest w pełni znieczulone. Za pomocą nożyczek przeciąć skórę i otrzewną pod zszywkami, aby odsłonić jamę brzuszną i rogi macicy.
3. Wyjąć elektroporowany embrion i przypiąć go stroną brzuszną do góry. Przeciąć skórę brzucha, otrzewną, przeponę oraz boczne części klatki piersiowej, aby odsłonić serce. Przebić lewą komorę igłą motylkową podłączoną do układu perfuzyjnego i przeciąć prawy przedsionek mikronożyczkami. Rozpocząć perfuzję i pozwolić na przepływ PFA przez ~60 sekund; jeśli perfuzja przebiega pomyślnie, krew powinna wypływać z prawego przedsionka, a embrion powinien stać się blady. Odciąć głowę embrionu i umieścić ją w 4% PFA w probówce stożkowej 15-ml. Powtórzyć tę procedurę dla wszystkich elektroporowanych embrionów. Przechowywać głowy w 4% PFA przez noc w temperaturze 4°C, a następnie płukać w PBS przez kilka dni. Poddać matkę eutanazji poprzez zwichnięcie szyi po zebraniu wszystkich embrionów.

Usuwanie siatkówki

4. Po przemyciu w PBS przypnij głowę w naczyniu do sekcji siatkówką skierowaną do góry i zanurz w PBS. Usuń skórę z okolic siatkówki, aby odsłonić RPE. Za pomocą igły 26G1/2 wykonaj nakłucie brzusznej części siatkówki na połączeniu soczewka-RPE. Wprowadź jedno ostrze mikronóżek w ten otwór i wykonaj pionowe nacięcie przez brzuszną część siatkówki aż do tarczy nerwu wzrokowego. Pozwoli to na zorientowanie siatkówki podczas jej usuwania.
5. Usuń RPE za pomocą pęsety precyzyjnej. Chwyć RPE w miejscu brzusznego nacięcia jedną pęsetą i użyj drugiej pęsety, aby oddzielić RPE od siatkówki, szczególnie na połączeniu RPE-soczewka, gdzie RPE jest mocno przytwierdzone. Po usunięciu RPE chwyć soczewkę precyzyjną pęsetą i pociągnij do góry i na zewnątrz, aby ją usunąć. Usuń siatkówkę, umieszczając pęsetę wokół głowy nerwu wzrokowego i odcinając siatkówkę. Przenieś siatkówkę do dołka wypełnionego PBS, monitorując, z której głowy pochodzą poszczególne siatkówki.
6. Powtórz kroki 4-5 dla siatkówki przeciwległej oraz dla wszystkich pozostałych elektroporowanych embrionów. Nieiniekcyjna siatkówka służy jako kontrola dla immunobarwienia.
7. Użyj fluorescencyjnego mikroskopu sekcyjnego, aby przeskanować wszystkie siatkówki pod kątem obecności komórek GFP+ (zielone siatkówki). W przypadku wszystkich siatkówek GFP+ elektroporacja w tym embrionie przebiegła pomyślnie; takie siatkówki oraz odpowiadający im mózg (z nienaruszonym systemem wzrokowym) mogą zostać poddane dalszej analizie (np. sekcjonowaniu i immunobarwieniu) (Rysunek 1).

Część 3a: Elektroporacja siatkówki ex vivo Wstrzykiwanie i elektroporacja DNA do siatkówek mysich w stadium E14.5 in vitro

1. Zpodaj 0,2 ml mieszaniny anestetycznej samicy w stadium E13,5-E14,5 i upewnij się, że jest całkowicie znieczulona. Za pomocą nożyczek przetnij skórę i jamę brzuszną, aby odsłonić zarodki. Podnieś łańcuch zarodkowy pęsetą i przetnij tkankę łączną, aby całkowicie usunąć cały łańcuch zarodkowy z organizmu samicy. Umieść łańcuch zarodkowy w szalce Petriego z DMEM/F12 na lodzie. Uśmierć samicę poprzez zwichnięcie kręgów szyjnych.
2. Przetnij całą ścianę macicy mikronożyczkami. Następnie za pomocą pęsety wyjmij każdy zarodek z pęcherzyka owodniowego i odciśnij łożysko. Odetnij głowy każdego zarodka i zbierz je do innej szalki Petriego z DMEM/F12 na lodzie.
3. Używając pipety ustnej lub pipety z tłokiem, napełnij mikropipetę żądaną ilością roztworu DNA (patrz Część 1).
4. W niniejszym protokole DNA zostanie wstrzyknięte do obwodowej części grzbietowej siatkówki. Można celować w inne obszary siatkówki, dostosowując miejsce wstrzyknięcia DNA oraz rozmieszczenie elektrod.
5. Przenieś jedną głowę do naczynia sekcyjnego z PBS i przypnij głowę stroną grzbietową do góry. Używając pęsety, usuń skórę nad siatkówką.
6. Trzymając mikropipetę pod kątem ~10° względem pozycji poziomej (w zasadzie równolegle do krzywizny grzbietowej siatkówki), wprowadź mikropipetę przez RPE tak, aby końcówka znajdowała się pomiędzy RPE a zewnętrzną warstwą siatkówki. Wstrzyknij ~0,1-0,4 μl roztworu DNA w tę przestrzeń; widoczny powinien być zielony płyn wypełniający całą przestrzeń i wyciekający przez otwór w RPE. Powtórz wstrzyknięcie dla przeciwległej siatkówki.
7. Ostrożnie, ale szybko usuń szpilki i (trzymając głowę zanurzoną w PBS) umieść elektrody wokół głowy, z elektrodą dodatnią (+) po stronie brzusznej głowy. Podaj 4 impulsy o napięciu 40 V i czasie trwania 50 ms przy częstotliwości 60 Hz, a następnie umieść głowę z powrotem w naczyniu z DMEM/F12 na lodzie (Rycina 2).
   
8. Powtórz kroki 5-7 dla wszystkich głów i dla wszystkich roztworów DNA. Po zakończeniu elektroporacji dodaj ~1,5 ml natlenionego roztworu SFM do naczynia 4-dołkowego i przechowuj na lodzie (jedna dołka dla każdego wstrzykniętego roztworu DNA).
9. Przenieś jedną głowę do naczynia sekcyjnego z DMEM/F12, tak aby jedna siatkówka była skierowana do góry. Na siatkówce brzusznej (lub po stronie przeciwnej do obszaru docelowego) za pomocą cienkiej pęsety uciśnij i wyrwij otwór w RPE. Wprowadź jeden koniec pęsety przez ten otwór, aby oddzielić RPE od siatkówki, konkretnie w miejscu połączenia soczewka-siatkówka. Nie przecinaj i nie uszkadzaj siatkówki, ponieważ spowoduje to jej zapadnięcie się podczas inkubacji. Po usunięciu RPE użyj pęsety, aby wydobyć siatkówkę, ściskając nerw wzrokowy u podstawy siatkówki (pozostawiając soczewkę nienaruszoną). Przenieś siatkówki do natlenionego SFM. Odwróć głowę i powtórz procedurę dla przeciwległego oka.
10. Wykonaj krok 9 dla wszystkich poddanych elektroporacji głów. Inkubuj siatkówkę w natlenionym SFM w temperaturze 37°C przez 40-48 godzin.

Część 3b: Elektroporacja siatkówki ex vivo Pobieranie i wysiew eksplantatów siatkówki GFP+ (2 dni po elektroporacji)

1. Przenieś wszystkie siatkówki z jednej studni z natlenionym SFM do pokrywki płytki Petriego z DMEM/F12. Wybierz jedną siatkówkę i użyj fluorescencyjnego mikroskopu operacyjnego, aby zwizualizować GFP+ (zieloną) część siatkówki.
2. Za pomocą mikroskalpela i pęsety wytnij i odrzuć część siatkówki niebędącą GFP+, tak aby pozostał tylko GFP+ fragment siatkówki. Pomocne jest ciągłe przełączanie się między światłem fluorescencyjnym a zwykłym podczas preparowania, aby precyzyjnie wybrać GFP+ siatkówkę. Przenieś GFP+ siatkówkę do studni z DMEM/F12.
3. Powtórz krok 2 dla wszystkich siatkówek z jednej studni. Dla każdego warunku DNA (każdej innej studni) użyj nowej płytki Petriego i medium DMEM/F12.
4. Tych GFP+ siatkówek należy teraz pociąć na mniejsze eksplanty siatkówki do wysiewu. Pod mikroskopem operacyjnym przetnij duży fragment GFP+ siatkówki na mniejsze eksplanty za pomocą mikroskalpela. Eksplanty powinny być prostokątne, o długości i szerokości ~200-300 μm. Zbierz wszystkie eksplanty w studni z DMEM/F12. Jeden GFP+ fragment siatkówki powinien dać ~4-10 GFP+ eksplantów siatkówki, zależnie od wielkości tkanki. Powtórz ten krok dla wszystkich pobranych GFP+ obszarów siatkówki.
5. Po przygotowaniu wszystkich GFP+ eksplantów siatkówki, dodaj 250 μl SFM + 0,4% metylocelulozy (przechowywanej w 4°C) do naczynek hodowlanych powlekanych lamininą (patrz Część 1). Przenieś 4-8 GFP+ eksplantów do naczynka hodowlanego i za pomocą pęsety delikatnie ułóż eksplanty w kształt wielokąta, tak aby znajdowały się w połowie drogi między środkiem a krawędzią naczynka.
6. Określ, która strona eksplantu jest warstwą RGC. Czasami kryształy RPE pozostają przyczepione do zewnętrznej warstwy siatkówki, co wskazuje, że przeciwległa strona jest warstwą RGC. Dodatkowo strona RGC zazwyczaj zawiera resztki komórkowe, co może pomóc w prawidłowej orientacji eksplantu.
7. Kładąc warstwę RGC do dołu, użyj pęsety, aby mocno docisnąć środek eksplantu, tak aby przylegał do szklanego zakrycia. Może być widoczne wgniecenie w eksplancie po pęsecie; jest to zjawisko normalne.
8. Po wysianiu wszystkich eksplantów w naczyniu hodowlanym przenieś je do inkubatora w temperaturze 37°C. Aksony siatkówki są po raz pierwszy obserwowane 4-6 godzin po wysiewie, a eksplanty pozostają zdrowe przez kilka dni, jednak po 24 godzinach może dojść do znacznego przerostu. Eksplanty mogą być wykorzystane do licznych analiz in vitro, utrwalone w 4% PFA przez 30 minut i poddane immunobarwieniu (Rysunek 2).

Analiza granicy

8. Alternatywnie przenieść 4 eksplanty GFP+ do szalki przygotowanej do testu granicznego (patrz Część 1). Rozmieścić eksplanty w pionowej linii w centrum szalki, w przybliżeniu w miejscu przebiegu granicy.
9. Pod fluorescencyjnym mikroskopem stereoskopowym ułożyć eksplanty w taki sposób, aby znajdowały się w odległości ~50-150 mm od fluorescencyjnej granicy. Inkubować szalki w temperaturze 37°C przez 24 godziny, zapewniając wystarczająco dużo czasu, aby aksony RGC dotarły do podłoża granicznego. Eksplanty można utrwalić w 4% PFA przez 30 minut, a następnie poddać immunostainingowi (Rysunek 2).

Reprezentatywne wyniki

Dyskusja

W niniejszym filmie zaprezentowano techniki elektroporacji, zarówno in utero, jak i ex vivo, służące do dostarczania genów do embrionalnych komórek zwojowych siatkówki (RGC) myszy. Elektroporacja siatkówki in utero umożliwia manipulację ekspresją genów w RGC oraz wizualizację ich projekcji aksonalnych in vivo. Przeżycie embrionów w okresie ponatalnym pozwala na zbadanie projekcji tych RGC GFP+ do ich celu, czyli ciała kolankowatego bocznego (LGN). Elektroporacja siatkówki ex vivo zapewnia większą kontrolę nad celowaniem w konkretne obszary siatkówki do wykorzystania w testach in vitro. Połączenie analiz in vivo i in vitro uzyskanych dzięki tym technikom pozwala na szczegółową charakterystykę rozwoju RGC i projekcji aksonalnych w podgrupie RGC na normalnym tle genetycznym. Choć nasza demonstracja skupia się na prowadzeniu aksonów RGC w obrębie skrzyżowania wzrokowego, elektroporacja siatkówki zarówno in utero, jak i ex vivo może być przydatna w badaniu wpływu zaburzeń ekspresji genów na różnicowanie RGC, morfologię dendrytów, właściwości elektrofizjologiczne, tworzenie synaps oraz prawidłowe targetowanie w strefach zakończeń, takich jak LGN i wzgórze górne.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Elektroporator kwadratowy BTX Electro Square Porator ECM 830 (z pedałem nożnym)	Harvard Apparatus	450052
Okrągłe elektrody pęsetowe	Nepa Gene	CUY650-5 lub CUY650-7
Szwy jedwabne	Henry Schein	101-2636
Szklane mikropipety z tłokami	Drummond Scientific	5-000-1001-X10
Roztwór antybiotykowo-antymykotyczny	Invitrogen	15240096
Pożywka DMEM/F12	GIBCO, by Life Technologies	11330057
Albuminy surowicy bydlęcej	Sigma-Aldrich	A8806-5G
Suplement ITS	Sigma-Aldrich	I-1884
Penicylina-Streptomycyna	Invitrogen	15140-122
Metyloceluloza	Sigma-Aldrich	M0512
Szalki z mikrowyciiskami o szklanym dnie	MatTek Corp.	P35G-1.5-14-C
Poly-L-ornityna	Sigma-Aldrich	P4957
Laminina	Invitrogen	23017-015