Zbieranie i przygotowywanie embrionów Drosophila do rejestracji elektrofizjologicznej i innych procedur

Podsumowanie

Technika ta umożliwia odsłonięcie układu nerwowo-mięśniowego embrionów Drosophila do przeprowadzenia immunohistochemii lub rejestracji elektrofizjologicznej. Jest ona przydatna do badania wczesnych etapów rozwoju nerwowo-mięśniowego lub wykonywania badań elektrofizjologicznych u mutantów, które nie są w stanie wykluć się z jaj.

Streszczenie

Drosophilajest wiodącym modelem genetycznym do badania zarówno rozwoju zarodkowego, jak i funkcjonalnej neuronauki. Tradycyjnie dziedziny te są od siebie dość odizolowane, z w dużej mierze niezależnymi historiami i społecznościami naukowymi. Jednakże interfejsem między tymi zazwyczaj rozbieżnymi dziedzinami są programy rozwojowe leżące u podstaw nabywania funkcjonalnych właściwości przesyłania sygnałów elektrycznych oraz różnicowania funkcjonalnych synaps chemicznych podczas końcowych faz formowania obwodów neuronalnych. Ten interfejs jest krytycznie ważnym obszarem badań. WDrosophilate fazy rozwoju funkcjonalnego następują w okresie <8 godzin (w 25°C) podczas ostatniej trzeciej części embriogenezy. Ten późny okres rozwoju był długo uważany za niepodatny na badania ze względu na odkładanie się twardej, nieprzepuszczalnej kutykuli epidermalnej. Przełomem okazało się zastosowanie wodopolimeryzującego kleju chirurgicznego, który można nakładać miejscowo na kutykulę, aby umożliwić kontrolowaną dyssekcję embrionów w późnym stadium. Dzięki cięciu wzdłużnemu na grzbiecie embrion może zostać rozłożony na płasko, co odsłania brzuszny sznur nerwowy oraz muskulaturę ściany ciała do badań eksperymentalnych. System ten był szeroko wykorzystywany do izolacji i charakterystyki mutantów genetycznych upośledzających tworzenie się synaps embrionalnych, a tym samym do odkrywania molekularnych mechanizmów sterujących specyfikacją i różnicowaniem połączeń synaptycznych oraz funkcjonalnych właściwości sygnalizacji synaptycznej.

Protokół

Część 1: Sprzęt i materiały

1. Do wypreparowania embrionów wymagany jest dobry mikroskop stereoskopowy; sugeruje się powiększenie 40X, z okularami 25X w celu maksymalnego zwiększenia powiększenia.
2. Precyzyjne pęsety (numer 5) są niezbędne do ręcznej selekcji embrionów oraz ich dewitellinizacji.
3. Wymagany jest sprzęt do wytwarzania i modyfikowania cienkich szklanych igieł. Do preparowania niezbędne są igły z wyciągniętego szkła. W przypadku preparowania preferujemy szkło lite (jest trwalsze), lecz standardowe grubościenne rurki szklane (średnica zewnętrzna 1-1,5 mm) również sprawdzają się dobrze. Niektórzy stosują cienkie igły wolframowe, poddawane elektrolizie w kąpieli 1M NaOH przy użyciu autotransformatora o natężeniu 10+ A, aby uzyskać pożądaną ostrość. Zaostrzone igły wolframowe mają tę zaletę, że są stosunkowo odporne i trwałe. Szklane igły drążone (formowane podobnie jak elektrody do patch-clamp) są mocowane do plastikowych rurek i używane podczas preparowania do zasysania i wydmuchiwania soli fizjologicznej, a także do kontrolowanego podawania kleju. Do produkcji szklanych igieł dostępnych jest wiele rodzajów wyciągaczy do szkła. Programowalne komputerowo wyciągacze mogą być wstępnie ustawione do formowania różnych kształtów i rozmiarów. Powszechnie preferowane są modele Brown-Flaming (Sutter Instrument Co.). Do inspekcji i modyfikacji elektrod przed użyciem powinien być dostępny mikroskop złożony (obiektyw 20-40X).
4. Do kąpieli tkanek embrionalnych podczas preparowania powszechnie stosuje się dwa rodzaje roztworów: 1) sole „standardowe” (Jan i Jan, 1976a) lub „zmodyfikowane standardowe” (Broadie, 2000), oparte na roztworach powszechnie używanych do rejestracji w innych systemach bezkręgowców, oraz 2) sole „podobne do hemolimfy” (HL) (Stewart et al 1994), będące kompromisem między solą standardową a stężeniami jonów zmierzonymi w hemolimfie Drosophila. Należy zauważyć, że żadna z tych soli nie odtwarza dokładnie składu chemicznego hemolimfy in vivo (Broadie, 2000). Sól standardowa zawiera (w mM): 135 NaCl, 5 KCl, 4 MgCl₂, 1,8 CaCl₂, 72 sacharozy, 5 TES, pH 7,2. Badacze mogą również rozważyć komercyjnie dostępne sole dla owadów (np. Schneider’s Insect Media), które nie nadają się do rejestracji elektrofizjologicznej, ale najlepiej chronią kondycję odsłoniętych tkanek.

Część 2: Okresowanie embrionów i sekcja

1. Aby zapewnić optymalny zbiór jaj, należy utrzymywać młode (<7 dni), zdrowe muchy samce i samice (20-40 osobników) w świeżych pojemnikach do składania jaj przez 2-3 dni. Pojemniki do składania jaj zazwyczaj składają się z plastikowych zlewków o pojemności 100 ml (Tri-Pour) z perforacją zapewniającą odpowiednią cyrkulację powietrza, nakrywających płytkę agarową 60 mm. Płytki agarowe zawierają sok jabłkowy lub winogronowy utwardzony agarem. Istnieje kilka receptur, ale przykładem jest następująca: 700 ml wody, 25-30 g agaru, 300 ml koncentratu soku (winogronowego lub jabłkowego), 0,5 g metyloparabenu (p-hydroksymetylobenzoesanu) i 30 g cukru. Wodę i agar należy wysterylizować w autoklawie, a p-hydroksymetylobenzoesan zagotować oddzielnie z cukrem i sokiem. Roztwory agaru i soku należy zmieszać i szybko wlać do płytek 60 mm, usuwając pęcherzyki powietrza.
2. Przed zbiorem jaj muchy są karmione pastą drożdżową (7 g drożdży piekarskich w 9 ml wody przechowywanej w 4°C) na świeżych płytkach, wymienianych co najmniej dwa razy dziennie przez minimum dwa dni. Do 3. dnia odpowiednio przygotowany pojemnik powinien produkować 100-200 jaj na godzinę. Lepsze składanie jaj obserwuje się w pojemniku utrzymywanym na boku, gdy agar na płytce jest zarysowany. Wiele embrionów zostaje złożonych w rysach lub obok nich.
3. Aby zebrać dużą liczbę embrionów, należy je delikatnie przenieść z płytki agarowej do koszyczka za pomocą pędzelka. Koszyczek można wykonać z probówki wirówkowej o pojemności 15 lub 50 ml. Należy odciąć dno, pozostawiając wystarczającą powierzchnię, aby zamocować sito (siatka 70 µm) między pokrywką a górną częścią probówki. Embriony należy przepłukać dH₂O i umieścić w czarce Petriego ze świeżym roztworem wybielacza w stężeniu od 50% do 100%, aby usunąć zewnętrzny chorion. Alternatywnie jaja można zbierać pojedynczo za pomocą precyzyjnej pęsety i dechlorionować, umieszczając je ręcznie w kropli wybielacza. Dechlorionacja może trwać od 30 sekund do 2 minut (świeży wybielacz działa znacznie szybciej) i powinna być monitorowana pod mikroskopem stereoskopowym. Usunięcie chorionu odsłania lśniącą, przezroczystą błonę witelinową. Dechlorionowane jaja należy krótko przepłukać lub umieścić w soli fizjologicznej, ponieważ wybielacz szybko niszczy tkanki dewitellinizowane.
4. Kluczowe jest dokładne określenie stadium rozwoju embrionów do pożądanego wieku. Zdefiniowane stadia embrionalne Drosophila (1-17; Campos-Ortega i Hartenstein, 1985) nie są użyteczne, ponieważ cały funkcjonalny rozwój nerwowo-mięśniowy zachodzi w późnym stadium 16 lub stadium 17. W związku z tym stadia embrionów określa się na podstawie godzin rozwoju w temperaturze 25°C w inkubatorze z nawilżaniem, licząc godziny po zapłodnieniu lub, co częstsze, po złożeniu jaja (AEL). W tych warunkach embriogeneza trwa 21 +/- 1 h w 25°C.
5. Jaja z czasowego zbioru (1-2 h), które osiągnęły odpowiedni wiek, są następnie oceniane pod kątem kryteriów morfologicznych. Po dokładnym przemyciu w dH₂O, dechlorionowane jaja umieszcza się w plastikowej szalce hodowlanej (pod dH₂O) do obserwacji. Poprawne określenie stadium można potwierdzić za pomocą kryteriów morfologicznych, wykorzystując światło odbite w mikroskopie stereoskopowym (Campos-Ortega i Hartenstein, 1985). Dojrzałe embriony w późnych stadiach (22-24 h AEL) tuż przed wykluciem są zazwyczaj rozpoznawane po segmentacji kutykuli i napuchniętych tchawicach. Embriony można również genotypować za pomocą balancerów GFP i mikroskopu fluorescencyjnego z odpowiednimi filtrami.
6. Do sekcji dechlorionowane i stadiowane embriony przytwierdza się (stroną grzbietową do góry) do szkiełka podstawowego pod kroplą soli fizjologicznej (patrz krok 1.5). Embriony usuwa się z błony witelinowej poprzez przebicie błony w pobliżu końca przedniego lub tylnego za pomocą szklanej mikropipety lub igły wolframowej, a następnie delikatnie uwalnia się embrion z błony. Przygotowując się do sekcji, embrion powinien być ułożony na szkiełku powierzchnią grzbietową do góry (sekcja grzbietowa odsłoni brzuszny układ nerwowy i układ nerwowo-mięśniowy do przeprowadzania eksperymentów. Embrion można oczywiście ułożyć w inny sposób, aby ułatwić dostęp do innych tkanek).
7. Embriony we wczesnych stadiach (<16 h AEL) przylegają bezpośrednio do czystego szkła lub szkła powleczonego polilizyną (hydrobromek poli-L-lizyny; Broadie i Bate, 1993a, b). Starsze embriony (>16 h AEL), po uformowaniu kutykuli, muszą zostać przyklejone, idealnie do szkiełek pokrywkowych powleczonych Sylgardem (Dow Corning). Używa się do tego chirurgicznego lub weterynaryjnego kleju cyjanoakrylowego polimeryzującego w wodzie (Broadie i Bate, 1993c, d). Klej podaje się przez małą pipetę z elektrody szklanej (końcówka o średnicy wewnętrznej 10-20 mikrometrów) przymocowaną do gumowej rurki, a przepływ kleju kontroluje się ciśnieniem ustnym. Podczas podawania kleju należy zachować ostrożność, ponieważ polimeryzuje on szybko po kontakcie z solą fizjologiczną. Należy również zauważyć, że klejenia nie można przeprowadzać w soli fizjologicznej o zerowym lub niskim stężeniu jonów dwuwartościowych, ponieważ klej wymaga jonów dwuwartościowych do polimeryzacji. Małe ilości kleju stosuje się najpierw do mocnego przymocowania głowy i ogona.
8. Po przyklejeniu końców embrionu do szkiełka, wykonuje się nacięcie wzdłuż linii środkowej grzbietu za pomocą elektrody szklanej lub zaostrzonej igły wolframowej. Ułatwia to delikatne perforowanie linii nacięcia przed wykonaniem ostatecznego cięcia. Brzegi nacięcia zostają następnie przyklejone do szkiełka za pomocą większej ilości kleju, aby delikatnie rozpłaszczyć embrion. Narządy wewnętrzne, w tym jelita, ciała tłuszczowe i opcjonalnie tchawice, są następnie usuwane poprzez odsysanie za pomocą szklanej pipety przymocowanej do gumowej rurki (Broadie i Bate 1993a-c). Embrion powinien być teraz płasko przyklejony do szkiełka, warstwą epidermy do dołu, z odsłoniętym brzusznym centralnym układem nerwowym, nerwami obwodowymi i somatyczną muskulaturą do celów eksperymentalnych.

Dyskusja

Precyzyjne określanie stadium rozwoju embrionów jest kluczowe ze względu na szybkie dojrzewanie właściwości funkcjonalnych w przeciągu zaledwie kilku godzin. Kilka kwestii komplikuje ten proces. Po pierwsze, większość badaczy określa stadium embrionów na podstawie czasu składania jaj, jednak czas ten może się znacznie różnić w zależności od osobnika i warunków (Broadie et al. 1992). W szczególności samice na ograniczonej diecie mają tendencję do zatrzymywania zapłodnionych jaj przez dłuższy czas przed ich złożeniem. Dlat...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Klatki do zbierania embrionów	Genesee Scientific	59-100 (do szalek 60 mm; dostępne inne rozmiary)	Klatki można również wykonać samodzielnie, używając z dziurkami zlewków z trzema wlewami, jak pokazano w filmie
Sylgard 184	Dow Corning	Dostępny u różnych dostawców	Klej chirurgiczny lepiej przylega do szkiełek podstawkowych pokrytych sylgardem
Cienkie rurki szklane, średnica zewnętrzna 1,0-1,5 mm	Różni		Do wyciągania cienkich igieł szklanych do sekcji oraz rurek do aplikacji kleju
Rurki plastikowe, do przymocowania do pipety szklanej w celu ssania ustnego i aplikacji kleju	Tygon		Średnica wewnętrzna rurki musi odpowiadać średnicy zewnętrznej szkła.