Barwienie białek w żelach Coomassie G-250 bez użycia rozpuszczalników organicznych i kwasu octowego

Podsumowanie

Opisano krótki protokół barwienia białek Coomassie Brilliant Blue (CBB) G-250 w żelach poliakrylamidowych, który nie wymaga użycia rozpuszczalników organicznych ani kwasu octowego, stosowanych w klasycznych procedurach barwienia CBB.

Streszczenie

W klasycznych protokołach barwienia białek z użyciem Coomassie Brilliant Blue (CBB) stosuje się roztwory o wysokiej zawartości toksycznych i łatwopalnych rozpuszczalników organicznych (metanolu, etanolu lub 2-propanolu) oraz kwasu octowego do utrwalania, barwienia i odbarwiania białek w żelu po elektroforezie SDS-PAGE. W celu przyspieszenia procedury często stosuje się krótkotrwałe podgrzewanie roztworu barwiącego w kuchence mikrofalowej. Zazwyczaj prowadzi to do odparowania toksycznego lub niebezpiecznego metanolu, etanolu lub 2-propanolu oraz do powstania w laboratorium intensywnego zapachu kwasu octowego, czego należy unikać ze względów bezpieczeństwa. W protokole pierwotnie opublikowanym w dwóch wnioskach patentowych E.M. Wondraka (US2001046709 (A1), US6319720 (B1)) opisano alternatywny skład roztworu barwiącego, w którym nie użyto rozpuszczalników organicznych ani kwasów. CBB rozpuszczono w wodzie bidestylowanej (60–80 mg CBB G-250 na litr), a jako jedyny dodatkowy składnik roztworu barwiącego dodano 35 mM HCl. Barwienie żelu CBB przeprowadza się po SDS-PAGE i dokładnym przemyciu żelu wodą bidestylowaną. Dzięki podgrzewaniu żelu podczas etapów mycia i barwienia proces może zostać ukończony szybciej, a do otoczenia nie odparowują żadne toksyczne ani niebezpieczne związki. Barwienie białek następuje już w ciągu 1 minuty po podgrzaniu żelu w roztworze barwiącym i jest w pełni rozwinięte po 15–30 minutach, z lekkim niebieskim tłem, które zostaje całkowicie usunięte poprzez przedłużone płukanie zabarwionego żelu w wodzie bidestylowanej, bez wpływu na zabarwione prążki białkowe.

Protokół

Część 1: Przygotowanie roztworu barwiącego CBB

1. Od 60-80 mg CBB G-250 rozpuszcza się w 1 litrze wody bidestylowanej, mieszając przez 2-4 godziny. Następnie do ciemnoniebieskiego roztworu dodaje się 3 ml stężonego HCl, mieszając przez kolejną minutę, a gotowy preparat przechowuje się w ciemności do późniejszego użycia. Roztwór można przechowywać od kilku tygodni do kilku miesięcy bez utraty wydajności barwienia.
2. Ze stężonym HCl należy obchodzić się z zachowaniem zwykłych środków ostrożności i używać go pod dygestorium. Końcowy roztwór będzie miał pH około 2, dlatego należy stosować rękawice i unikać kontaktu z skórą.

Część 2: SDS-PAGE

1. Odpowiednie alikwoty próbek białek miesza się z buforem do prób do uzyskania końcowego stężenia 1x bufor do prób. Stosujemy 2x bufor do prób zawierający 125mM Tris/H3PO4 (pH 7,5 w 25°C), 2mM EDTA, 4% SDS, 200mM DTT, 0,02% błękitu bromofenolowego i 50% glicerolu. Można również stosować inne bufory do prób dla SDS-PAGE.
2. Próbki białek podgrzewa się przez około 5 min przed nałożeniem. W tym czasie przygotowuje się komorę do elektroforezy żelowej. Stosujemy gotowe żele 4-12% NuPAGE© Bis-Tris (Invitrogen) w systemie XCell SureLock® Mini-Cell (Invitrogen) z buforem MES jako buforem do prowadzenia elektroforezy, jednak można wykorzystać każdy inny żel i system elektroforetyczny.
3. Próbki białek nanosi się na żel, a następnie prowadzi elektroforezę przez 50 min przy napięciu 220V.

Część 3: Barwienie żelu

1. Kasetę do żelu rozmontowuje się, a żel umieszcza w pojemniku w celu przeprowadzenia kolejnych etapów płukania.
2. Do żelu dodaje się około 100 ml wody bidestylowanej i podgrzewa w kuchence mikrofalowej przez 30 sekund. Podgrzewanie należy przerwać przed momentem zagotowania. Pojemnik z żelem umieszcza się następnie na wytrząsarce na 3-5 min, a ten etap płukania powtarza się dwukrotnie przy użyciu świeżej wody.
3. Dodaje się wystarczającą ilość roztworu barwiącego CBB, aby przykryć żel w pojemniku, a następnie podgrzewa go w kuchence mikrofalowej przez 10 s bez doprowadzenia do wrzenia. Pojemnik z żelem umieszcza się następnie na wytrząsarce w celu zakończenia barwienia. Prążki białkowe mogą być widoczne już po 1 minucie; w większości przypadków barwienie jest wystarczająco intensywne po 15-30 min.
4. Roztwór barwiący odlewa się i dodaje 50-100 ml wody bidestylowanej, aby na wytrząsarce dodatkowo odbarwić jasnoniebieskie tło żelu. W razie potrzeby wodę można zastąpić świeżą wodą w celu dalszego odbarwiania.
5. Żel można zeskanować, sfotografować lub wysuszyć w celu długotrwałego przechowywania.

Część 4: Reprezentatywne wyniki:

Rys. 1 przedstawia prawidłowo zabarwiony żel po zastosowaniu opisanego protokołu.

Rys. 2 przedstawia żel, który nie został wystarczająco długo przemyty przed barwieniem, przez co pozostały SDS hamuje efektywne barwienie. Należy zauważyć, że ścieżki z markerem (*) zawierają tę samą ilość białek markera.

Ryc. 1: Reprezentatywny żel barwiony po nałożeniu próbek z oczyszczania białka (*: marker masy cząsteczkowej).

Rys. 2: Żel barwiony CBB, który nie był płukany wystarczająco długo przed barwieniem CBB. Prążki białkowe są słabsze (należy zauważyć, że ścieżka z markerem * zawiera taką samą ilość białka jak na Rys. 1).

Dyskusja

• Etapy płukania są kluczowe dla efektywnego barwienia białek. Skrócenie czasu płukania poniżej 2 min lub zmniejszenie objętości wody (<50ml) może prowadzić do powstania blado niebieskich prążków białkowych, co najprawdopodobniej wynika z większej ilości pozostałego w żelu SDS.*
• Jeśli białka mają zostać poddane analizie spektrometrią mas, należy pominąć etapy podgrzewania w kuchence mikrofalowej, wydłużyć czas płukania żelu do około 10 min w każdym kroku oraz przedłużyć czas barwienia, aż intensywność prążków będzie wystarcza...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Coomassie Brilliant Blue G-250	AppliChem	A3480	można również zastosować każdy inny CBB G-250
Stężony HCl