Test podrażnienia skóry in vitro (SIT) z wykorzystaniem modelu zrekonstruowanej ludzkiej naskórka (RHE) EpiDerm

Podsumowanie

W tym filmie prezentujemy test podrażnienia skóry EpiDerm (EpiDerm SIT), opracowany i zwalidowany do badań podrażnienia skóry in vitro w przypadku substancji chemicznych, w tym składników kosmetycznych i farmaceutycznych.

Streszczenie

Test drażnienia skóry EpiDerm (EpiDerm SIT) został opracowany^(1,2,3)i zwalidowane^(4,5)dlain vitrotesty drażnienia skóry przez substancje chemiczne, w tym składniki kosmetyczne i farmaceutyczne. EpiDerm SIT wykorzystuje 3Din vitrozrekonstruowany model ludzkiej naskórka (RHE) EpiDerm. Procedura opisana w niniejszym protokole pozwala na rozróżnienie między substancjami drażniącymi kategorii 2 wg GHS a substancjami niedrażniącymi⁽⁶⁾Test przeprowadzany jest w okresie 4 dni i składa się z preinkubacji, 60-minutowej ekspozycji, 42-godzinnej postinkubacji oraz testu żywotności MTT. Po otrzymaniu tkanek i nocnej preinkubacji (Dzień 0), tkanki są poddane miejscowej ekspozycji na badane substancje chemiczne (Dzień 1), które mogą być cieczami, substancjami półstałymi, stałymi lub woskami. Dla każdej substancji chemicznej, jak i dla kontroli pozytywnej (5% roztwór wodny SDS) oraz kontroli negatywnej (DPBS), wykorzystuje się trzy próbki tkanek. Ekspozycja na substancje chemiczne trwa 60 minut, z czego przez 35 min tkanki są przechowywane w inkubatorze w temperaturze 37°C. Następnie substancje testowe są usuwane z powierzchni tkanek za pomocą rozbudowanej procedury płukania. Wkładki z tkankami są osuszane i przenoszone do świeżego medium. Po 24-godzinnym okresie inkubacji (Dzień 2) medium zostaje wymienione. Medium można zachować do dalszej analizy cytokin lub innych interesujących punktów końcowych. Po wymianie medium tkanki inkubuje się przez kolejne 18 godzin. Po zakończeniu całej 42-godzinnej postinkubacji (dzień 3), tkanki przenosi się do żółtego roztworu MTT i inkubuje przez 3 godziny. Powstała fioletowo-niebieska sól formazanu, tworzona głównie w wyniku metabolizmu mitochondrialnego, jest ekstrahowana przez 2 godziny przy użyciu izopropanolu. Gęstość optyczna wyekstrahowanego formazanu jest wyznaczana za pomocą spektrofotometru. Substancję chemiczną klasyfikuje się jako drażniący, jeśli żywotność tkanki w stosunku do tkanek traktowanych kontrolą negatywną spadnie poniżej 50%. Niniejsza procedura może być stosowana jako pełny zamiennik testu drażnienia skóry królika in vivo w celu identyfikacji zagrożeń i etykietowania substancji chemicznych zgodnie z rozporządzeniami UE.⁽⁷⁾Since the user provided no input HTML to translate, I cannot generate a translation. Please provide the source HTML content.

Protokół

I. Kondycjonowanie tkanki – Dzień 0

1. Po otrzymaniu zestawu EpiDerm EPI-200-SIT należy sprawdzić kompletność i stan wszystkich komponentów (szczegóły zestawu znajdują się w tabeli konkretnych odczynników i sprzętu).
2. Na każde trzy tkanki EpiDerm należy przygotować jedną sterylną płytkę 6-dołkową wypełnioną uprzednio 0,9 ml medium analitycznego.
3. W warunkach sterylnych należy otworzyć plastikową torebkę zawierającą płytkę 24-dołkową z tkankami EpiDerm i usunąć sterylną gazę.
4. Za pomocą sterylnej pęsety należy wyjąć każdy insert zawierający tkankę EpiDerm i umieścić go w pustej płytce 24-dołkowej. Na tym etapie należy usunąć pozostały agar transportowy przylegający do zewnętrznych ścian insertu, delikatnie osuszając go sterylnym papierem filtracyjnym.
5. W ciągu następnych 5 minut należy dokonać wizualnej oceny tkanek. Nie należy używać tkanek uszkodzonych lub całkowicie zalanych cieczą.
6. Używając sterylnego patyczka bawełnianego, należy ostrożnie osuszyć powierzchnię tkanek. Należy starać się nie dotykać tkanki bezpośrednio – zjawiska kapilarne są wystarczające do usunięcia wilgoci z powierzchni tkanki.
7. Po osuszeniu powierzchni tkanek należy przenieść trzy tkanki do górnego rzędu płytek 6-dołkowych wypełnionych uprzednio 0,9 mL medium analitycznego. Należy usunąć wszelkie pęcherzyki powietrza uwięzione pod insertami.
8. Płytki 6-dołkowe z insertami należy umieścić w inkubatorze na 60 ± 5 min preinkubacji w temperaturze 37 ± 1° C, przy 5 ± 1% CO₂ i 95 % RH (wilgotności względnej).
9. Po zakończeniu 60 ± 5 min preinkubacji należy przenieść inserty z górnych do dolnych dołków płytki 6-dołkowej. Płytki należy ponownie umieścić w inkubatorze (37 ± 1° C, 5 ± 1% CO₂, 95 % RH) na nocną preinkubację (18 ± 3 hr).
10. Pozostałą część medium analitycznego należy umieścić w lodówce (5 ± 3 °C). Po nocnej preinkubacji można przystąpić do aplikacji badanych substancji chemicznych na tkanki EpiDerm.
    
    Uwaga: Procedurę preinkubacji można skrócić w przypadku późnej dostawy tkanek (np. jeśli tkanki dotrą w środę zamiast we wtorek).

II. Ekspozycja chemiczna – Dzień 1

1. Przygotować jedną płytkę 6-dołkową na każdą substancję testową, wypełniając tylko górny rząd dawką 0,9 ml pożywki analitycznej na każdy dołek.
2. Na około 5 minut przed planowaną ekspozycją na substancje chemiczne wyjąć z inkubatora płytki 6-dołkowe zawierające uprzednio kondycjonowane tkanki.
3. Ocenić powierzchnię tkanek i usunąć nadmiar wilgoci za pomocą sterylnych patyczków bawełnianych.
4. Oznaczyć wszystkie pokrywki płytek 6-dołkowych kodami lub nazwami materiałów testowych.
5. Dawkować substancje testowe na tkanki w odstępach 1-minutowych, aby ułatwić ich późniejsze wypłukiwanie po ekspozycji. Przechowywać płytki z dawką substancji w komorze sterylnej do momentu podania dawki na ostatnią tkankę.
6. W przypadku badania substancji ciekłych nanieść 30 μL roztworu bezpośrednio na tkankę, a następnie nałożyć na jej powierzchnię siatkę nylonową. W razie potrzeby delikatnie ułożyć siatkę za pomocą szklanej pipety Pasteura z gruszką. Nie uciskać powierzchni tkanki.
7. W przypadku badania substancji półstałych użyć pipety z tłokiem przemieszczającym, aby nanieść 30 μL bezpośrednio na tkankę. Jeśli to konieczne, rozprowadzić substancję pipetą Pasteura tak, aby objąć jak największą powierzchnię tkanki.
8. W przypadku materiałów stałych, krótko przed aplikacją substancji testowej, nawilżyć powierzchnię tkanki 25 μL sterylnego DPBS, co poprawi kontakt tkanki z substancją. Napełnić skalibrowaną łyżeczkę aplikacyjną o ostrych krawędziach (lub inne odpowiednie narzędzie) o pojemności 25 mg około 25 mg drobno zmielonego materiału testowego. Nanieść stałą substancję testową na powierzchnię tkanki. W razie potrzeby użyć pipety Pasteura z gruszką, aby całkowicie opróżnić łyżeczkę. Delikatnie potrząsać insertami, aby poprawić rozprowadzenie materiału stałego na powierzchni.
9. W przypadku substancji o konsystencji woskowej przygotować płaski kawałek o średnicy około 8 mm i umieścić go na tkance uprzednio zwilżonej sterylnym DPBS. Aby poprawić kontakt między substancją a tkanką, dociążyć kawałek za pomocą przyrządu ze stali nierdzewnej lub tworzywa sztucznego.
10. Na tkanki kontrolne nanieść DPBS jako kontrolę negatywną oraz 5% SDS jako kontrolę pozytywną.
11. Po dawkowaniu ostatniej tkanki przenieść wszystkie płytki na 35 ± 1 minuty do inkubatora z nawilżeniem (37 ± 1° C, 5 ± 1% CO₂, 95 % RH).
12. Po inkubacji przez 35 ± 1 minut w temperaturze 37°C wyjąć wszystkie płytki z inkubatora. Umieścić płytki w komorze sterylnej i odczekać, aż upłynie 60 minut czasu ekspozycji dla pierwszej dawkowanej tkanki.
13. Następnie rozpocząć procedurę płukania, przetwarzając jeden insert na minutę (aby zapewnić 60-minutowy całkowity czas ekspozycji dla każdego insertu).
14. Użyć butelki z myjką do płukania tkanek sterylnym DPBS. Wypełnić insert z tkanką 15 razy, stosując stały strumień DPBS, a następnie go opróżnić (Uwaga: w przypadku tkanek z siatką nylonową opłukać powierzchnię tkanki 5 razy i ostrożnie usunąć siatkę za pomocą ostrych pęsety; następnie kontynuować pozostałe 10 płukań).
15. Po 15-stym płukaniu z użyciem butelki z myjką, zanurzyć insert całkowicie 3 razy w 150 ml DPBS i potrząsać, aby usunąć pozostałości materiału testowego.
16. Na koniec opłukać insert z tkanką raz od wewnątrz i raz od zewnątrz sterylnym DPBS.
17. Usunąć nadmiar DPBS z tkanki poprzez delikatne potrząśnięcie insertem i osuszenie go sterylnym papierem osuszającym.
18. Przenieść osuszone inserty z tkankami do nowej płytki 6-dołkowej uprzednio wypełnionej pożywką analityczną. Wszystkie te kroki (14-18) muszą zostać wykonane w ciągu 1 minuty dla każdego insertu.
19. Po wypłukaniu ostatniej tkanki ostrożnie osuszyć powierzchnię każdej tkanki sterylnym patyczkiem bawełnianym.
20. Inkubować tkanki w inkubatorze przez kolejne 24 ± 2 godziny (37 ± 1° C, 5 ± 1% CO₂, 95 % RH).
    
    Uwaga: Każdy technik analityczny nie powinien badać więcej niż 6 substancji testowych, wliczając kontrolę negatywną i pozytywną, w jednej serii badawczej (zestawie), aby być w stanie postępować zgodnie z poniższym protokołem

III. Wymiana pożywki – Dzień 2

1. Po 24 ± 2 godzinach poinkubacji przenieść inserty do dolnej części płytki 6-dołkowej, uprzednio wypełnionej 0,9 ml pożywki. Pożywkę z górnych rzędów można zebrać do analizy dodatkowych punktów końcowych (cytokin, chemokin itp.). Analiza wtórnych punktów końcowych jest opcjonalna.
2. Kontynuować poinkubację (37 ± 1° C, 5 ± 1% CO₂, 95 % RH) przez kolejne 18 ± 3 godzin.

IV. Test żywotności MTT - Dzień 3

1. Oznakuj dwie płytki 24-dołkowe nazwami chemicznymi lub kodami. Jedna płytka posłuży do inkubacji tkanki z MTT, a druga do etapu ekstrakcji.
2. Przygotuj roztwór MTT poprzez rozmrożenie koncentratu MTT (5 mg/ml) i rozcieńczenie go rozcieńczalnikiem do MTT. Końcowe stężenie roztworu MTT wynosi 1 mg/ml.
3. Pipetuj 300 μL roztworu MTT do każdego dołka płytki 24-dołkowej.
4. Wyjmij płytki 6-dołkowe z inkubatora, osusz spód insertów na papierze filtracyjnym i przenieś je do płytki 24-dołkowej uprzednio wypełnionej MTT.
5. Umieść płytkę 24-dołkową w inkubatorze (37 ± 1° C, 5 ± 1% CO₂, 95 % RH) i inkubuj przez 3 godziny ± 5 min. Ściśle przestrzegaj czasu inkubacji 3 godziny ± 5 min, aby uniknąć rozbieżności między różnymi odczytami MTT.
6. Po zakończeniu inkubacji z MTT użyj pompy ssącej, aby delikatnie odessać medium MTT ze wszystkich dołków.
7. Wypełnij ponownie dołki DPBS i odessaj ponownie. Powtórz to płukanie jeszcze dwa razy i upewnij się, że tkanki są suche po ostatnim odessaniu.
8. Po płukaniu przenieś inserty do nowej płytki 24-dołkowej. Zanurz inserty, delikatnie pipetując 2 mL roztworu ekstrahującego (izopropanolu) do każdego insertu. Poziom cieczy podniesie się powyżej górnych krawędzi insertu, całkowicie zanurzając tkanki.
9. Uszczelnij płytkę 24-dołkową (np. Parafilmem lub za pomocą worka uszczelniającego), aby zapobiec odparowaniu ekstrahentu. Ekstrahuj MTT z tkanek przez co najmniej 2 godziny w temperaturze pokojowej przy delikatnym wstrząsaniu na wytrząsarce do płytek (~ 120 rpm). Można również zastosować ekstrakcję nocną bez wstrząsania.
10. Po zakończeniu czasu ekstrakcji przebij inserty igłą wstrzykiwalniczą lub pipetą Pasteura z gruszką i pozwól ekstraktowi spłynąć do dołka, z którego wyjęto insert.
11. Usuń przebity insert i pipetuj roztwór w dołku w górę i w dół trzy razy, aż stanie się jednorodny.
12. Dla każdej tkanki przenieś dwie alikwoty po 200 μL fioletowego roztworu formazanu do 96-dołkowej płytki mikrotitracyjnej z płaskim dnem. Przenieś duplikaty zgodnie z ustalonym schematem płytki podanym w arkuszu towarzyszącym temu protokołowi wideo. Jako próbki ślepe wykorzystaj izopropanol.
13. Odczytaj gęstość optyczną (OD) ekstraktów MTT w spektrofotometrze do płytek 96-dołkowych przy użyciu długości fali 570 nm (540-580) bez filtra referencyjnego.
14. Wprowadź wyniki do arkusza w celu automatycznego obliczenia wyników (Rysunek 1).
15. Substancję chemiczną testowaną uznaje się za „drażniącą” (R38 lub kategoria 2 GHS), jeśli procent żywotności tkanki wyznaczony testem MTT wynosi <50% w stosunku do kontroli negatywnej.
    
    
    Uwaga: MTT jest toksyczne, dlatego podczas pracy należy używać rękawic ochronnych. Chronić MTT i jego roztwory przed światłem, ponieważ MTT jest światłoczułe. Roztworu MTT należy użyć w ciągu kilku godzin od przygotowania, ponieważ z czasem ulega on degradacji.

V. Kontrola jakości testu

• 
  
  Kryteria akceptacji zestawu EpiDerm EPI-200-SIT:
  
  Modele RHE in vitro powinny dostarczać spójnych, wysokiej jakości danych w czasie, a nie tylko podczas procesu walidacji ⁽⁸⁾. Zalecane wytyczne mające na celu zapewnienie długoterminowej powtarzalności i wydajności testu obejmują „pełną charakterystykę komórek lub tkanek, próbkowanie każdej partii... pod kątem wydajności oraz regularne stosowanie kontroli i substancji wzorcowych w celu zapewnienia spójności wyników testu” ⁽⁹⁾. Oprócz opisanych poniżej kryteriów akceptacji testu, każda partia produkcyjna EpiDerm jest poddawana kontroli jakości przez producenta przy użyciu dodatkowej substancji wzorcowej (1% Triton X-100). Wyznaczany jest czas ekspozycji niezbędny do redukcji żywotności tkanki do 50% (ET-50) dla Triton X-100. Dla EpiDerm średnie roczne wartości ET-50 mieściły się w zakresie od 5,9 hrs do 7,5 hrs. Współczynnik zmienności (CV) między partiami dla tkanek kontroli negatywnej (tj. zmienność podstawowej żywotności) średnio wynosiła poniżej 7,5% w każdym roku od 1996 roku. Wartość ET-50 każdej partii produkcyjnej musi mieścić się w granicach 2 odchyleń standardowych od historycznej średniej ET-50 dla Triton X-100 ustalonej w 1996 roku (tj. ET-50 = 6,7 hours; dolna granica akceptacji = 4,8h; górna granica akceptacji = 8,7h), aby partia mogła zostać dopuszczona do użytku przez producenta.
• Kryterium akceptacji testu EPI-200-SIT 1: Kontrola negatywna:
  
  Bezwzględna wartość OD tkanek kontroli negatywnej (NC) (traktowanych sterylnym DPBS) w teście MTT jest wskaźnikiem żywotności tkanki uzyskanej w laboratorium badawczym po procedurach wysyłki i przechowywania oraz w określonych warunkach użytkowania. Test spełnia kryterium akceptacji, jeśli średnia wartość OD₅₇₀ tkanek NC wynosi ≥1,0 i ≤2,5.
• Kryterium akceptacji testu EPI-200-SIT 2: Kontrola pozytywna
  
  Jako kontrolę pozytywną (PC) stosuje się 5% roztwór SDS (w H₂O), który jest testowany równolegle z badany chemikaliami. Równolegle oznacza, że PC musi być testowana w każdym badaniu, jednak w ciągu jednego dnia testowego wymagana jest nie więcej niż jedna kontrola PC. Żywotność kontroli pozytywnej powinna mieścić się w 95% przedziale ufności danych historycznych. Test spełnia kryterium akceptacji, jeśli średnia żywotność tkanek PC wyrażona jako % tkanek kontroli negatywnej wynosi 20%.
• Kryterium akceptacji testu EPI-200-SIT 3: Odchylenie standardowe (SD)
  
  Drażniące działanie na skórę jest przewidywane na podstawie średniej żywotności określonej dla 3 pojedynczych tkanek, dlatego zmienność powtórzeń tkankowych powinna być akceptowalnie niska. Test spełnia kryterium akceptacji, jeśli SD obliczone z poszczególnych wartości % żywotności tkanki dla 3 identycznie traktowanych powtórzeń jest <18%.

Reprezentatywne wyniki

Rycina 1. Wyniki uzyskane dla 6 substancji testowych, kontroli NC i PC – część zautomatyzowanego arkusza kalkulacyjnego do obliczania wyników. Chemikalia testowe, które obniżyły żywotność tkanki poniżej 50% w stosunku do NC, są klasyfikowane jako substancje drażniące. Test jest zoptymalizowany tak, aby dostarczać wyniki wystarczająco oddalone od progu klasyfikacji (50% żywotności), co zwiększa powtarzalność analizy.

Dyskusja

W tym filmie zaprezentowaliśmy test podrażnienia skóry EpiDerm (EpiDerm SIT), opracowany i zwalidowany do badania podrażnienia skóry przez substancje chemiczne in vitro, w tym składniki kosmetyczne i farmaceutyczne. Podczas wykonywania tej metody ważne jest zachowanie warunków aseptycznych oraz ścisłe przestrzeganie zwalidowanego protokołu, ponieważ odstępstwa od niego mogą doprowadzić do uzyskania odmiennych wyników. Możliwe są niektóre modyfikacje testu, jednak wszelkie zmiany w protokole powinny być konsultowane bezpośrednio z autorami.

Jedynym ograniczeniem tej metody jest możliwa interferencja substancji testowej z punktem końcowym testu MTT. Substancja testowa o określonym kolorze lub taka, która bezpośrednio redukuje MTT (naśladując tym samym aktywność dehydrogenaz mitochondrialnych komórek), może zakłócać wynik testu MTT. Jednakże substancje te stanowią problem tylko wtedy, gdy w momencie przeprowadzania testu MTT (tzn. 42 godziny po ekspozycji na substancję testową) na tkankach (lub w ich wnętrzu) wciąż obecne są wystarczające ilości substancji testowej. W przypadku tego mało prawdopodobnego zdarzenia, (prawdziwą) metaboliczną redukcję MTT oraz wkład kolorowego materiału testowego lub (fałszywą) bezpośrednią redukcję MTT przez materiał testowy można określić ilościowo za pomocą procedury szczegółowo opisanej w Standardowej Procedurze Operacyjnej (SOP) analizy dostarczonej przez MatTek Corp.