Normalizacja tła w fluorescencyjnej optycznej tomografii projekcyjnej do obrazowania całego serca

Podsumowanie

Proponujemy podejście oparte na normalizacji Borna w optycznej tomografii projekcyjnej (BnOPT), które uwzględnia właściwości absorpcyjne obrazowanych próbek w celu uzyskania dokładnych i ilościowych rekonstrukcji tomograficznych fluorescencji. Przedstawiony algorytm wykorzystujemy do rekonstrukcji rozkładu fluorescencyjnej sondy molekularnej w narządach małych zwierząt.

Streszczenie

Optyczna tomografia projekcyjna jest techniką obrazowania trójwymiarowego, która została niedawno wprowadzona jako narzędzie obrazowania stosowane głównie w badaniach nad biologią rozwoju i ekspresją genów. Technika ta czyni próbkę biologiczną optycznie przezroczystą poprzez uprzednią dehydratację, a następnie umieszczenie jej w mieszaninie alkoholu benzylowego i benzoesanu benzylu w stosunku 2:1 (BABB lub roztwór Murray’s Clear). Technika ta czyni próbki biologiczne optycznie przezroczystymi poprzez ich uprzednią dehydratację w roztworach etanolu o rosnącym stężeniu, a następnie umieszczenie ich w mieszaninie alkoholu benzylowego i benzoesanu benzylu w stosunku 2:1 (BABB lub roztwór Murray’s Clear) w celu przejrzystości. Po procesie przejrzystości udział rozpraszania w próbce może zostać znacznie zredukowany i stać się niemal pomijalny, podczas gdy udział absorpcji nie może zostać całkowicie wyeliminowany. Podczas próby rekonstrukcji rozkładu fluorescencji w badanej próbce wpływ ten oddziałuje na rekonstrukcje i nieuchronnie prowadzi do artefaktów obrazowania oraz błędów w kwantyfikacji. Chociaż absorpcję można by zredukować w jeszcze większym stopniu poprzez pozostawienie próbki w mediach do przejrzystości na wiele tygodni lub miesięcy, prowadziłoby to do postępującej utraty fluorescencji oraz nierealistycznie długiego czasu przetwarzania próbki. Dotyczy to rekonstrukcji zarówno egzogennych środków kontrastowych (molekularnych środków kontrastowych), jak i kontrastu endogennego (np. rekonstrukcji genetycznie eksprymowanych białek fluorescencyjnych).

Protokół

Procedura obrazowania

Układ doświadczalny przedstawiono szczegółowo na Rysunku 1. Źródło światła LS służy zarówno do oświetlenia w pomiarach absorbancji, jak i jako źródło wzbudzenia w pomiarach fluorescencji; jest ono filtrowane za pomocą wąskopasmowego filtra interferencyjnego BPF. Zestaw stałych i zmiennych filtrów neutralnych ND w połączeniu z automatyczną migawką S pozwala na kontrolę ilości światła padającego na próbkę i utrzymanie go na poziomie wystarczająco niskim, aby zapobiec fotoblaknięciu. Jednorodne oświetlenie próbki uzyskuje się za pomocą ekspandera wiązki BE z dwusoczewkowym teleskopem Galileusza oraz dyfuzora. Próbka S jest zanurzona w roztworze do przejaśniania, zamocowana na uchwycie i obracana wokół swojej osi pionowej za pomocą wysokoobrotowego stołu obrotowego (Newport, PR50) z dokładnością bezwzględną 0,05 stopnia. Trzy oddzielne kontrolery manualne umożliwiają pochylenie osi pionowej próbki oraz jej regulację w płaszczyźnie ortogonalnej. Sygnał transiluminacji jest wykrywany bezpośrednio przez kamerę CCD; sygnał fluorescencji jest filtrowany przez wąskopasmowy filtr interferencyjny połączony z filtrem długoprzepustowym (Omega Optical, Brattleboro, VT), a następnie zbierany za pomocą soczewki telecentrycznej TL. Soczewki telecentryczne oferują unikalne właściwości, które czynią je idealnymi do optycznej tomografii projekcyjnej. W rzeczywistości obecność przysłony otworu znajdującej się wewnątrz zestawu soczewek w punkcie ogniskowym zapewnia, że promienie tworzące obraz przysłony będą biegnąć równolegle do osi optycznej, co praktycznie eliminuje jakiekolwiek zniekształcenia perspektywiczne i zapewnia takie samo powiększenie dla wielu płaszczyzn w obrębie głębokości telecentrycznej.

Przygotowanie próbek

W celu utrwalenia tkanek/organów stosuje się następującą procedurę

1. Próbki utrwala się w PFA przez 8 godzin w temperaturze 4C.
2. Następnie próbkę przemywa się w PBS przez 15 minut.
3. Próbkę zatapia się w bloku 0,8% agarozy.
4. Blok agarozy odwadnia się za pomocą serii roztworów etanolu o stężeniu od 20% do 100%. Ta procedura odwadniania w serii etanolu pomaga uniknąć asymetrycznego kurczenia się próbki.
5. Na koniec próbkę inkubuje się przez 10 godzin w 100% etanolu w celu całkowitego usunięcia wody z próbki.
6. Próbkę umieszcza się w roztworze alkoholu benzylowego i benzoesanu benzylu w stosunku 1:2 na czas niezbędny do przejaśnienia próbki. Należy pamiętać, że czas ten może się znacznie różnić w zależności od próbki — od kilku godzin do kilku dni.
7. Pod koniec procesu przejaśniania mogą pozostać minimalne ślady etanolu, co prowadzi do powstania poważnych artefaktów w rekonstrukcjach z powodu ruchów termicznych alkoholu w samym roztworze przejaśniającym. Aby uniknąć tego problemu, zaleca się przeprowadzenie drugiego cyklu przejaśniania.
8. Kroki 4 i 5 należy wykonywać w ciemności, aby uniknąć wybielania fluorescencyjnych środków kontrastowych lub białek.

Przygotowanie próbek serca

W celu uniknięcia artefaktów wysokiego pochłaniania w rekonstrukcjach, przed obrazowaniem ważne jest usunięcie krwi z każdej tkanki. Można zastosować następującą procedurę.

1. Zanurz mysz w narkozie poprzez domięśniowy (IP) wtrysk mieszaniny ketaminy (90 mg/kg) i ksylazyny (10mg/kg).
   Uwaga: „Od tego momentu należy chronić próbkę przed światłem”.
2. Wstrzyknij 50 U heparyny (IP), a po pięciu minutach wykonaj podłużną laparotomię.
3. Otwórz lewą żyłę nerkową (LRV) i wprowadź 20ml roztworu soli fizjologicznej do żyły głównej dolnej (IVC).
4. Blok agarozowy należy odwadniać w czterech, jednogodzinnych inkubacjach w etanolu o stężeniach 20%, 40%, 60% i 80%, a następnie inkubować próbki w 100% etanolu przez 10 godzin (przez noc).
5. Następnie utrwal serce zgodnie z ogólną procedurą przygotowania próbek
   Uwaga: „Od tego momentu należy chronić próbkę przed światłem”.

Rekonstrukcje absorpcyjne

Rekonstrukcja absorpcji optycznej w przypadku braku rozpraszania jest zazwyczaj analogiczna do X-CT i może zostać przeprowadzona przy użyciu powszechnego algorytmu filtrowanej projekcji wstecznej Radona. Obrazy absorpcyjne są następnie rejestrowane kamerą CCD w trybie transiluminacji, wykonując 360 projekcji w odstępach 1 stopnia wzdłuż osi pionowej. Wskazane jest, aby ustawić oś pionową próbki równolegle do kolumny pikseli kamery CCD.

1. Umieść blok agarozy w komorze wypełnionej roztworem do przejaśniania
2. Oświetl próbkę skolonimowanym wiązką światła w celu przeprowadzenia pomiarów wzbudzenia oraz transmisji
3. Obróć próbkę, wykonując 360 projekcji w odstępach 1 stopnia
4. Nabyj obrazy w transiluminacji, zarówno dla długości fal absorpcji (wewnętrznej), jak i fluorescencji
5. Zastosuj migawkę, aby uniknąć ciągłego oświetlania i ograniczyć fotowyblakanie
6. Użyj algorytmu filtrowanej wstecznej projekcji Radona do tomograficznej rekonstrukcji próbki

Rekonstrukcje fluorescencyjne

Algorytm stosowany do rekonstrukcji absorpcji nie jest odpowiedni do rekonstrukcji rozkładu fluorescencji i, jeśli nie zostanie wzięty pod uwagę, wkład absorpcji doprowadzi do powstania poważnych artefaktów.

1. Postępuj zgodnie z instrukcjami zawartymi w sekcji „Absoprtion Reconstructions”.
2. Wykonaj jednocześnie pomiary absorpcji i fluorescencji.
3. Połącz dane w znormalizowane obrazy pola Borna.
4. Zapisz równania modelu bezpośredniego propagacji światła dla długości fal wewnętrznych i fluorescencyjnych.
5. Oblicz macierz wag na dyskretyzowanej siatce dla funkcji Greena modelu bezpośredniego.
6. Odwróć macierz wag i pomnóż ją przez wykryte znormalizowane obrazy pola Borna, aby uzyskać rekonstrukcję rozkładu fluorescencji w obiekcie.