Normalizacja Borna dla fluorescencyjnej optycznej tomografii projekcyjnej do obrazowania całego serca

Summary

Sugerujemy znormalizowane podejście Borna do optycznej tomografii projekcyjnej (BnOPT), które uwzględnia właściwości absorpcyjne obrazowanych próbek w celu uzyskania dokładnych i ilościowych rekonstrukcji tomografii fluorescencyjnej. Wykorzystując zaproponowany algorytm wykorzystujemy do rekonstrukcji rozkładu fluorescencyjnej sondy molekularnej w obrębie małych narządów zwierzęcych.

Abstract

Optyczna tomografia projekcyjna to trójwymiarowa technika obrazowania, która została niedawno wprowadzona jako narzędzie obrazowania głównie w biologii rozwojowej i badaniach ekspresji genów. Technika ta sprawia, że próbka biologiczna jest optycznie przezroczysta, najpierw ją odwadniając, a następnie umieszczając w mieszaninie alkoholu benzylowego i benzoesanu benzylu w stosunku 2:1 (BABB lub klarowny roztwór Murraya). Technika ta sprawia, że próbki biologiczne są optycznie przezroczyste, najpierw odwadniając je w stopniowanych roztworach etanolu, a następnie umieszczając je w mieszaninie alkoholu benzylowego i benzoesanu benzylu w stosunku 2:1 (BABB lub klarowny roztwór Murraya) w celu oczyszczenia. Po procesie oczyszczania wkład rozpraszania w próbce może być znacznie zmniejszony i prawie nieistotny, podczas gdy wkład absorpcji nie może być całkowicie wyeliminowany. Przy próbie zrekonstruowania rozkładu fluorescencji w badanej próbce, wkład ten wpływa na rekonstrukcję i nieuchronnie prowadzi do artefaktów obrazu i błędów kwantyfikacji. Chociaż absorpcja może być jeszcze bardziej zmniejszona przy utrzymywaniu się tygodni lub miesięcy w pożywce klarującej, doprowadzi to do postępującej utraty fluorescencji i nierealistycznie długiego czasu przetwarzania próbki. Dotyczy to zarówno egzogennych środków kontrastowych (molekularnych środków kontrastowych), jak i kontrastów endogennych (np. rekonstrukcje genetycznie wyrażonych białek fluorescencyjnych).

Protocol

Procedura obrazowania

Konfiguracja eksperymentalna jest szczegółowo pokazana na rysunku 1. Źródło światła LS służy zarówno jako oświetlenie do pomiarów absorpcji, jak i jako źródło wzbudzenia do pomiarów fluorescencji i jest filtrowane za pomocą wąskopasmowego filtra interferencyjnego BPF. Zestaw stałych i zmiennych filtrów o neutralnej gęstości ND w połączeniu z obecnością automatycznej migawki S pozwala kontrolować ilość światła na próbce i utrzymywać ją na tyle niską, aby zapobiec fotowybielaniu. Równomierne oświetlenie próbki uzyskuje się dzięki zastosowaniu ekspandera wiązki BE z połączonymi dwiema soczewkami: teleskopem Galileusza i dyfuzorem. Próbkę S zanurza się w roztworze czyszczącym i utrzymuje na miejscu na uchwycie i obraca wzdłuż swojej osi pionowej za pomocą stolika obrotowego o dużej prędkości obrotowej (Newport, PR50) z absolutną dokładnością 0,05 stopnia. Trzy odrębne sterowniki ręczne pozwalają na pochylanie i regulację osi pionowej próbki w jej płaszczyźnie ortogonalnej. Sygnał transoświetlenia jest bezpośrednio wykrywany przez kamerę CCD; sygnał fluorescencyjny jest filtrowany przez wąskopasmowy filtr interferencyjny sprzężony z filtrem długoprzepustowym (Omega. Optyczny, Brattleboro, VT), a następnie zebrane za pomocą soczewki telecentrycznej TL. Soczewki telecentryczne mają tę zaletę, że zapewniają unikalne funkcje, które czynią je idealnymi do optycznej tomografii projekcyjnej. W rzeczywistości obecność ogranicznika przysłony umieszczonego w zespole soczewki w ognisku soczewki zapewnia, że promienie, które sprawiają, że obraz przysłony się zatrzymuje, będą przemieszczać się równolegle do osi optycznej, praktycznie eliminując wszelkie zniekształcenia perspektywy i zapewniając takie samo powiększenie dla wielu płaszczyzn w głębi telecentrycznej.

Przygotowanie próbki

Następująca procedura jest stosowana w celu naprawienia tkanki/organów

1. Próbki utrwala się w PFA przez 8 godzin w temperaturze 4C.
2. Próbka jest następnie myta w PBS przez 15 minut
3. Próbka jest osadzona w 0,8% bloku agarozy
4. Blok agarozy jest odwadniany za pomocą serii od 20% do 100% roztworów etanolu. Ta procedura serii odwadniania etanolu pomaga uniknąć asymetrycznego skurczu próbki.
5. Na koniec próbkę inkubuje się przez 10 godzin w 100% etanolu w celu usunięcia z próbki wszelkiej zawartości wody.
6. Umieścić próbkę w roztworze alkoholu benzylowego i benzoesanu benzylu w stosunku 1:2 na czas niezbędny do oczyszczenia próbki. Należy pamiętać, że czas ten może się znacznie różnić w zależności od próbki od kilku godzin do kilku dni.
7. Etanol w minimalnych śladach może być obecny na końcu procesu oczyszczania, powodując powstawanie artefaktów w rekonstrukcjach spowodowanych ruchem termicznym alkoholu w samym roztworze klarującym. Aby uniknąć tego problemu, zaleca się drugi cykl czyszczenia.
8. Punkty 4 i 5 należy wykonywać w ciemności, aby uniknąć wybielania fluorescencyjnymi środkami kontrastowymi lub białkami.

Przygotowanie próbki serca

Ważne jest, aby usunąć zawartość krwi z dowolnej tkanki przed obrazowaniem, aby uniknąć artefaktów o wysokiej absorpcji w rekonstrukcjach. Można postępować zgodnie z następującą procedurą.

1. Znieczulić mysz za pomocą dootrzewnowego (IP) wstrzyknięcia mieszanki ketaminy (90 mg/kg) i ksylazyny (10 mg/kg).
   Uwaga: "Od tego momentu należy chronić próbkę przed światłem".
2. Wstrzyknąć 50 j. heparyny (IP), a pięć minut później wykonać laparotomię podłużną.
3. Otworzyć lewą żyłę nerkową (LRV) i wlać 20 ml roztworu soli fizjologicznej do IVC.
4. Blok agarozy należy odwodnić w czterech, jednogodzinnych inkubacjach, w 20%, 40%, 60% i 80% etanolu, a następnie próbki inkubuje się w 100% etanolu przez 10 godzin (przez noc).
5. Serce jest następnie mocowane zgodnie z ogólną procedurą przygotowania próbki
   Uwaga: "Od tego momentu należy chronić próbkę przed światłem".

Rekonstrukcje absorpcyjne

Rekonstrukcja absorpcji optycznej przy braku rozpraszania jest na ogół analogiczna do X-CT i może być uzyskana przy użyciu wspólnego algorytmu filtracji wstecznej Radonu. Obrazy absorpcyjne są następnie wykonywane przez kamerę CCD w transiluminacji przez projekcje 360 stopni pod kątem 1 stopnia wzdłuż osi pionowej. Wygodne jest wyrównanie osi pionowej próbki równolegle do kolumny pikseli CCD.

1. Umieść blok agarozy w komorze wypełnionej roztworem klarującym
2. Oświetlanie próbki wiązką skolimowaną zarówno w celu pomiarów wzbudzenia, jak i transmisji
3. Obracaj próbkę w rzutach 360 pod kątem 1 stopnia.
4. Uzyskuj obrazy w transiluminacji zarówno na długości fali absorpcyjnej (wewnętrznej), jak i fluorescencyjnej.
5. Umieść żaluzję, aby uniknąć ciągłego oświetlenia i zmniejszyć bielenie.
6. Użyj algorytmu odwrotnej projekcji radonu z filtrem, aby tomograficznie zrekonstruować próbkę

Rekonstrukcje fluorescencyjne

Algorytm używany do rekonstrukcji absorpcji nie nadaje się do rekonstrukcji rozkładu fluorescencji, a jeśli nie zostanie uwzględniony, udział absorpcji doprowadzi do poważnych artefaktów.

1. Postępuj zgodnie ze wskazówkami w sekcji "Rekonstrukcje absorpcyjne".
2. Wykonuj jednocześnie pomiary absorpcji i fluorescencji
3. Łączenie danych ze znormalizowanymi obrazami pól Born
4. Zapisz równania przedniego modelu propagacji światła dla długości fal wewnętrznych i fluorescencyjnych.
5. Obliczanie macierzy wag na dyskretnej siatce dla funkcji Greena modelu do przodu
6. Odwróć macierz wag i pomnóż ją przez wykryte znormalizowane obrazy pola Borna, aby uzyskać rekonstrukcję rozkładu fluorescencji w obiekcie