Uzyskiwanie wysoko oczyszczonych oocyst Toxoplasma gondii za pomocą nieciągłego gradientu chlorku cezu

Podsumowanie

Niniejsze badanie opisuje opracowanie zmodyfikowanej metody z użyciem CsCl, która umożliwia łatwe oczyszczanie oocyst T. gondii z kału zarażonych kotów, tak aby nadawały się one do manipulacji w ramach biologii molekularnej i hodowli tkankowych

Streszczenie

Toxoplasma gondiijest obligatoryjnym wewnątrzkomórkowym pierwotniakiem chorobotwórczym, który powszechnie zakaża ludzi. Jest to dobrze scharakteryzowany przedstawiciel Apicomplexa, wiązany z wywoływaniem ognisk chorób przenoszonych przez żywność i wodę. Gospodarzem ostatecznym są kotowate, u których zachodzi replikacja płciowa, prowadząca do powstania wysoce zakaźnych i odpornych na czynniki środowiskowe oocyst. Zakażenie następuje poprzez spożycie cyst tkankowych z zanieczyszczonego mięsa lub oocyst z gleby lub wody. U zdrowych osobników zakażenie przebiega zazwyczaj bezobjawowo, ale prowadzi do lifelong latentnej infekcji, która może ulec reaktywacji, powodując zapalenie mózgu toksoplazmatyczne i śmierć w przypadku upośledzenia odporności organizmu. Mięso zanieczyszczoneT. gondiicysty były głównym źródłem zakażeń w Europie i Stanach Zjednoczonych, jednak niedawne zmiany w zarządzaniu zwierzętami i praktykach hodowlanych oraz usprawnione procedury obchodzenia się z żywnością i jej przetwarzania znacząco zmniejszyły rozpowszechnienieT. gondiiTorbiele w mięsie^{1, 2}Niemniej jednak seroprewalencja u ludzi pozostaje stosunkowo wysoka, co sugeruje, że ekspozycja na zanieczyszczoną oocystami glebę lub wodę jest prawdopodobna. Rzeczywiście, na całym świecie zgłaszano ogniska toksoplazmozy przenoszonej drogą wodną, co potwierdza teorię, że ekspozycja na środowiskową formę oocyst stanowi istotne ryzyko dla zdrowia^3-5Do chwili obecnej badania nad zrozumieniem rozpowszechnieniaT. gondiiliczba oocyst w wodzie i środowisku jest ograniczona ze względu na brak narzędzi do wykrywania oocyst w środowisku^{5, 6}Wynika to przede wszystkim z braku wydajnych protokołów oczyszczania pozwalających na uzyskanie dużej liczby wysoko oczyszczonychT. gondiioocysty od zakażonych kotów do celów badawczych. Niniejsze badanie opisuje opracowanie zmodyfikowanej metody z użyciem CsCl, która pozwala na łatwe oczyszczenieT. gondiioocysty z kału zakażonych kotów, odpowiednie do manipulacji biologii molekularnej i kultur tkankowych⁷empty

Protokół

1. Ogólne środki ostrożności podczas pracy z oocystami T. gondii

1. Podczas pracy z oocystami T. gondii ważne jest przestrzeganie wszystkich środków ostrożności. U większości zdrowych osób infekcja T. gondii jest łatwo kontrolowana przez układ odpornościowy, jednak prowadzi do infekcji trwającej całe życie. Osoby z niedoborami odporności są szczególnie podatne na toksoplazmozę i nie powinny pracować z oocystami T. gondii. Kobiety w ciąży również nie powinny mieć kontaktu z oocystami T. gondii, ponieważ infekcja może spowodować ciężkie wady wrodzone⁸.
2. Oocysty T. gondii należy obsługiwać wyłącznie w wyznaczonym obszarze i przez przeszkolony personel. Należy wywiesić oznakowania informujące o prowadzonych pracach z oocystami T. gondii, aby ostrzec inne osoby wchodzące na wyznaczony obszar.
3. Podczas pracy z oocystami T. gondii należy stosować odpowiednie środki ochrony indywidualnej (PPE), takie jak fartuch laboratoryjny, jednorazowy fartuch ochronny, jednorazowe rękawice oraz odpowiednią ochronę oczu lub osłonę twarzy.
4. Zaleca się częstą zmianę rękawic. Nie wolno obsługiwać żadnego sprzętu laboratoryjnego w rękawicach zanieczyszczonych oocystami T. gondii.
5. Podczas pracy z oocystami T. gondii należy zawsze używać metalowych tacek autoklawowalnych wyłożonych jednorazowymi wkładkami chłonnymi. Należy upewnić się, że wszystkie używane statywy, probówki itp. są albo jednorazowe, albo autoklawowalne.
6. Wszystkie odpady zawierające T. gondii muszą zostać poddane podwójnej autoklawacji przez co najmniej jedną godzinę.
7. Wszystkie urządzenia wielorazowe (statywy, tacki itp.) muszą również zostać poddane podwójnej autoklawacji przez co najmniej jedną godzinę.
8. Linie próżniowe używane do aspiracji płynów powinny być podłączone do filtra Vacushield™, aby zapobiec zanieczyszczeniu pompy próżniowej.
9. Wszystkie wykorzystane blaty laboratoryjne muszą zostać zdezynfekowane po zakończeniu pracy z oocystami T. gondii. Świeżo przygotowany 10% roztwór podchlorynu należy obficie nanieść na obszar roboczy i pozostawić do wyschnięcia. Następnie obszar ten należy dokładnie wypłukać wodą.

2. Przygotowanie buforów i roztworów

1. Przygotuj 1 L 2,2 M roztworu sacharozy, rozpuszczając 752,66 g sacharozy w 600 ml ddH₂O. Mieszaj i delikatnie podgrzewaj za pomocą mieszadła magnetycznego z podgrzewaniem, aby rozpuścić sacharozę. Po całkowitym rozpuszczeniu uzupełnij objętość do 1 L za pomocą ddH₂O. Następnie wysterylizuj roztwór w autoklawie przez co najmniej 20 minut.
2. Przygotuj 1 L buforu TE (50 mM Tris-HCl, 10 mM EDTA) o pH 7,2, dodając 6,05 g Tris-HCl i 3,7 g EDTA do 700 ml ddH₂O, dostosuj pH do 7,2, a następnie uzupełnij objętość do 1 L za pomocą ddH₂O.
3. W celu przygotowania gradientu CsCl przygotuj roztwór stokowy CsCl o gęstości względnej 1,15 (1,15-CsCl), dodając 21,75 g CsCl do 103,25 ml buforu TE. Aby otrzymać roztwór A, zmieszaj 30 ml TE z 20 ml 1,15-CsCl. Aby otrzymać roztwór B, zmieszaj 20 ml TE z 30 ml 1,15-CsCl i 12,5 μl roztworu czerwieni fenolowej. Aby otrzymać roztwór C, zmieszaj 10 ml TE z 40 ml 1,15-CsCl (Tabela 1).
4. Przygotuj 1 L 1 N roztworu wodorotlenku sodu (NaOH), rozpuszczając 40 g NaOH w 800 ml ddH₂O. Po rozpuszczeniu uzupełnij objętość do 1 L za pomocą ddH₂O.
5. Przygotuj 1 L 2% (obj.) roztworu H₂SO₄, mieszając 20 ml H₂SO₄ z 980 ml ddH₂O.

3. Flotacja w sacharozie

1. Do stożkowej probówki wirówkowej o pojemności 50 ml dodać 10 ml zawiesiny kałowej oocyst T. gondii w 2% H₂SO₄. Należy zaznaczyć, że zawiesina kałowa odnosi się do próbek, które zostały wstępnie przetworzone za pomocą procedury flotacji sacharozowej, zgodnie z wcześniejszym opisem⁸. Po początkowym pobraniu próbek kału od zarażonych kotów są one poddawane flotacji sacharozowej opisanej w odniesieniu 8. Ta dodatkowa flotacja sacharozowa jest niezbędna, aby dodatkowo zminimalizować ilość zanieczyszczeń kałowych przenoszonych do procesu oczyszczania w CsCl i uzyskać możliwie najczystsze oocysty T. gondii.
2. Zneutralizować 2% H₂SO₄, dodając do zawiesiny kałowej 6 ml (3/5 objętości) 1 N NaOH. Wymieszać dokładnie za pomocą wortexa.
3. Do zawiesiny kałowej dodać równą objętość (16 ml) sacharozy 2,2 M, aby uzyskać końcowe stężenie 1,1 M, i wymieszać dokładnie za pomocą wortexa.
4. Ostrożnie nałożyć na zawiesinę sacharozy/kału 10 ml ddH₂O za pomocą pipety 10 ml. Centryfugować zawiesinę przy 1 200 x g przez 20 min w temperaturze pokojowej, bez hamowania.
5. Ostrożnie zebrać górną warstwę wody oraz warstwę miedzyfazową i przenieść do nowej stożkowej probówki wirówkowej 50 ml, pobierając ciecz z granicy powietrze-woda, nieobracając pipetą. Ważne jest, aby zminimalizować przeniesienie sacharozy podczas zbierania warstwy miedzyfazowej.
6. Wymieszać pozostały osad sacharozy/kału, wortexując probówkę.
7. Powtórzyć kroki 3.4 i 3.5.
8. Dopełnić objętość dwóch roztworów miedzyfazowych z oocystami do 50 ml za pomocą ddH₂O i centryfugować probówki przy 2 000 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
9. Odssać nadfiltr z każdej probówki, resuspenderć osady w 5 ml buforu TE i połączyć zawiesiny oocyst. Całkowita połączona objętość powinna wynosić 10 ml.

4. Gradient CsCl

1. Przygotuj nieciągły gradient CsCl w 50 ml poliwęglanowej probówce Oak Ridge, ostrożnie nakładając każdą warstwę za pomocą strzykawki 50 ml z autoklawowalną, stalową igłą tępą o rozmiarze 18 G oraz trójdrożnym kranikiem. Uwaga: Do Roztworu B dodaje się czerwień fenolową, aby łatwo odróżnić warstwy gradientu (Tabela 1).
2. Powoli dodaj do probówki następujące roztwory w podanej poniżej kolejności. Należy pamiętać, że szybkość przepływu nie powinna przekraczać 0,5 ml/sec.
   1. 10 ml próbki zawiesiny TE/oocysty
   2. 8 ml Roztworu A
   3. 8 ml Roztworu B
   4. 8 ml Roztworu C
3. Wiruj probówkę Oak Ridge przy 12 000 x g przez 60 min w temperaturze 4 °C bez hamowania. Dopuszczalne jest użycie rotora kątowego, jednak szybki rotor z ruchomymi gondolami zapewnia lepszą separację oocyst z próbki zawiesiny przy minimalnym powstawaniu smug z resztek fekalnych wzdłuż ścianki probówki. Zakres powstawania smug zależy od składu zawiesiny fekalnej, w związku z czym w przypadku bardzo zanieczyszczonej zawiesiny może być konieczne przeprowadzenie dwóch gradientów CsCl.
4. Po wirowaniu zbierz nieprzezroczysty/biały prążek zawierający oocysty znajdujący się między roztworami A i B. Aby zminimalizować zanieczyszczenie resztkami fekalnymi, przejdź bezpośrednio do prążka oocyst, nie zakłócając gradientu, i zbierz interfazę oocyst za pomocą pipety 10 ml. Przenieś interfazę oocyst do nowej stożkowej probówki wirówkowej o pojemności 50 ml. Staraj się zminimalizować ilość odessanego roztworu CsCl podczas zbierania interfazy oocyst, ponieważ może to utrudnić pelletowanie oocyst podczas etapu płukania.
5. Przepłucz oocysty 30-40 ml ddH₂O. Wiruj probówkę przy 2 000 x g w temperaturze pokojowej przez 10 min bez hamowania. Ostrożnie odessaj nadsącz, nie naruszając pelletu oocyst. Powtórz płukanie jeszcze 2 razy.
6. Po zakończeniu ostatniego płukania ostrożnie odessaj nadsącz i resuspenduj pellet w 10 ml 2% kwasu siarkowego, a następnie przechowuj w temperaturze 4 °C do momentu użycia. Oocysty są teraz gotowe do dalszych manipulacji. Czystość oocyst można sprawdzić mikroskopowo, oceniając brak resztek fekalnych w próbce.