Szybkie i czułe barwienie białek w żelach poliakrylamidowych koloidalnym barwnikiem Coomassie G-250

Podsumowanie

Niniejszy film ma na celu spopularyzowanie protokołu barwienia koloidalnego Coomassie G-250 według Kanga et al., służącego do wykrywania średnio 4 ng białka w żelach. Barwienie zostaje zakończone w ciągu 2 godzin i nie wymaga dużego nakładu pracy. Rutynowo stosujemy protokół Kanga do celów analitycznych w proteomice opartej na żelach.

Streszczenie

Coomassie Brilliant Blue (CBB) to barwnik powszechnie stosowany do wizualizacji białek rozdzielonych metodą SDS-PAGE, oferujący prostą procedurę barwienia i wysoką możliwość kwantyfikacji. Ponadto jest on w pełni kompatybilny z identyfikacją białek za pomocą spektrometrii mas. Jednak mimo tych zalet, CBB jest uważany za mniej czuły niż barwienia srebrem lub fluorescencyjne, przez co rzadko stosuje się go do wykrywania białek w analitycznych podejściach proteomicznych opartych na żelach.

Wprowadzono kilka ulepszeń oryginalnego protokołu barwienia Coomassie¹, aby zwiększyć czułość CBB. Wprowadzono dwie główne modyfikacje w celu usprawnienia detekcji białek o niskiej obfitości poprzez przekształcenie cząsteczek barwnika w cząsteczki koloidalne: w 1988 roku Neuhoff i współpracownicy zastosowali 20% metanol oraz wyższe stężenia siarczanu amonu w roztworze barwiącym opartym na CBB G-250², a w 2004 roku Candiano et al. opracowali metodę Blue Silver, wykorzystując CBB G-250 z kwasem fosforowym w obecności siarczanu amonu i metanolu³. Niemniej jednak wszystkie te modyfikacje pozwalają na detekcję jedynie około 10 ng białka. Powszechnie znany protokół koloidalnego barwienia Coomassie został opublikowany przez Kang et al. w 2002 roku, w którym zmodyfikowano protokół koloidalnego barwienia CBB Neuhoffa w zakresie substancji kompleksujących. Zamiast siarczanu amonu zastosowano siarczan glinu, a metanol zastąpiono mniej toksycznym etanolem⁴. Nowa metoda barwienia oparta na glinie w badaniu Kang wykazała wyższą czułość, pozwalającą na detekcję ilości tak niskich jak 1 ng/prążek (fosforylaza b), przy niewielkich różnicach w czułości zależnie od rodzaju białek.

W niniejszym materiale demonstrujemy zastosowanie protokołu Kanga do szybkiego i czułego barwienia białek metodą koloidalnego Coomassie w celach analitycznych. Przedstawimy ten szybki i łatwy protokół na przykładzie żeli dwuwymiarowych, rutynowo stosowanych w naszej grupie badawczej.

Protokół

Część 1: Dwuwymiarowa (2-D) elektroforeza żelowa z wykorzystaniem nakładania do zagłębień (cup-loading)

1. Rehydratacja pasków IPG i ogniskowanie izoelektryczne (IEF)
   • Rehydratować żele Immobiline DryStrip, pH 6-11 (7 cm) w 125 μl roztworu rehydratacyjnego [7 M mocznika, 2 M tiomocznika, 4% CHAPS, 50 mM hydroksyetylodisiarczku i 2% buforu IPG pH 6-11], używając kuwety do rehydratacji Immobiline DryStrip Reswelling Tray przez co najmniej 10 godzin.
   • Rozpuścić wytrąconą próbkę białka w buforze do próbek IEF [7 M mocznika, 2 M tiomocznika, 2% CHAPS, 2% ASB-14, 50 mM hydroksyetylodisiarczku i 2% buforu IPG pH 6-11] w stężeniu odpowiadającym 60-100 μg białka na 100 μl.
   • Po solubilizacji (co najmniej 30 minut w temperaturze pokojowej), nanieść próbkę białka poprzez ładowanie do wgłębień anodowych za pomocą uchwytów na próbki. Objętość wgłębienia wynosi 100 μl (uchwyty typu Manifold pozwalają na naniesienie do 150 μl).
     Uwaga: można nanieść większe ilości próbki, jeśli na początku protokołu ogniskowania wprowadzi się etap niskiego napięcia i uzupełni zawartość wgłębień, gdy wciąż znajduje się w nich warstwa cieczy!
   • Przeprowadzić ogniskowanie izoelektryczne przez 11,1 kVh w trybie gradientowym w urządzeniu do elektroforezy Multiphor II.
2. Równoważenie i SDS-PAGE
   • Po IEF paski IPG poddano redukcji i alkilacji, po 15 minut na wytrząsarce w każdym etapie, stosując odpowiednio 1% ditiotreitol i 2,5% jodoacetamid w roztworze równoważącym [50 mM Tris-HCl/pH 8,8, 6 M mocznika, 30% glicerolu i 2% SDS].
   • Przepłukać zrównoważone paski wodą H₂O i osuszyć je na papierze Whatman, aby usunąć nadmiar buforu równoważącego. Następnie zanurzyć paski w buforze do elektroforezy SDS (1X).
   • Drugi wymiar wykonuje się za pomocą SDS-PAGE w pionowym systemie elektroforetycznym przy całkowitym stężeniu akryloamidu 12 %. Zrównoważone paski IPG umieszczono na górze żeli rozdzielających i utrwalono gorącym roztworem agarozy [0,5% agarozy w buforze do elektroforezy zawierającym błękit bromofenolowy].
   • Białka rozdzielano przez 2,5 h, rozpoczynając od 80 V przez 15 minut, a następnie 120 V aż do momentu dotarcia frontu barwnika do dna kasety z żelem.

Część 2: Koloidalne barwienie Coomassie z użyciem CBB G-250

1. Roztwory barwiące
Uwaga: do przygotowania roztworów barwiących należy używać odczynników o wysokiej czystości, np. klasy czystości analitycznej (p.a.), oraz wody wysokiej czystości uzyskiwanej z systemów Millipore (woda Milli-Q).

Roztwór Coomassie:		do 2000 ml H2O
0,02 % (w/v)	CBB G-250	0,4 g
5 % (w/v)	siarczan glinu-(14-18)-wodny	100 g
10 % (v/v)	etanol (96%)	200 ml
2 % (v/v)	kwas ortofosforowy (85 %)	47 ml

Uwaga: podczas przygotowywania roztworu barwiącego należy zachować sekwencyjną kolejność dodawania składników w następujący sposób:

1. najpierw rozpuścić siarczan glinu w wodzie Milli-Q
2. następnie dodać etanol, zhomogenizować i dodać do roztworu CBB G-250
3. gdy roztwór zostanie całkowicie rozpuszczony, dodać kwas fosforowy (dodanie kwasu do środowiska alkoholowego powoduje agregację cząsteczek Coomassie do stanu koloidalnego)
4. na koniec dopełnić wodą Milli-Q

Uwaga: końcowy roztwór barwiący ma ciemnozielono-niebieski kolor i zawiera liczne pływające w nim cząsteczki:

• Nie filtruj tego roztworu!
• Jeśli zmieniono kolejność przygotowania, otrzymany roztwór będzie miał bardziej fioletowo-niebieski kolor i będzie mniej czuły.

Roztwór do odbarwiania:		do 2000 ml H2O
10 % (v/v)	etanol (96 %)	200 ml
2 % (v/v)	kwas ortofosforowy (85 %)	47 ml

2. Procedura barwienia

• Po rozdzieleniu w drugim wymiarze ostrożnie wyjmij żele z szklanych płytek i przenieś je do kuwety do barwienia wypełnionej wodą Milli-Q.
• Przemyj żele trzykrotnie wodą Milli-Q przez 10 minut na wytrząsarce poziomej (niewystarczające przemywanie powoduje niską czułość, ponieważ pozostały na żelach SDS zakłóca wiązanie barwnika z białkiem).
• Przed użyciem wstrząśnij roztworem Coomassie, aby równomiernie rozproszyć cząsteczki koloidalne.
• Inkubuj żele całkowicie przykryte roztworem Coomassie przy jednoczesnym mieszaniu na wytrząsarce przez 2–12 godzin. Barwienie to generuje minimalne tło, dzięki czemu można obserwować postęp procesu.
  Uwaga: po 10 minutach można zauważyć pierwsze plamki białek; w ciągu 2 godzin inkubacji około 80% barwienia do poziomu maksymalnego zostaje zakończone. W celu uzyskania prawie 100% barwienia zaleca się inkubację przez noc. W niektórych przypadkach, gdy ilość białka do zabarwienia jest bardzo duża i roztwór zmienia barwę na jaskrawoniebieską, konieczna jest wymiana roztworu barwiącego.
• Po zakończeniu procedury barwienia usuń roztwór Coomassie i przepłucz żele dwukrotnie wodą Milli-Q.
  Uwaga: roztwór barwiący można wykorzystać ponownie, dopóki wciąż obecne są w nim cząsteczki; w przeciwnym razie należy go zutylizować (należy pamiętać, że w laboratorium mogą obowiązywać specjalne przepisy dotyczące utylizacji odpadów).
• Usuń przyklejone cząsteczki barwnika z kuwety do barwienia za pomocą ręcznika papierowego niepozostawiającego kłaczków i odbarwiaj przez 10–60 minut.
  Uwaga: żele można przemywać również samą wodą Milli-Q, jednak zaleca się to wyłącznie w przypadku żeli preparatywnych, ponieważ na żelach pozostanie nieregularna, słaba warstwa Coomassie, która ujawni się podczas skanowania.
• Na koniec przepłucz żele dwukrotnie wodą Milli-Q: żele odzyskają swoją pierwotną grubość (środowisko alkoholowo-kwasowe powoduje kurczenie się żeli), a neutralizacja w wodzie dodatkowo wzmocni intensywność koloru Coomassie.

Część 3: Reprezentatywne wyniki

Stosując opisany powyżej protokół, uzyskają Państwo na żelu 2-D wyraźnie rozdzielone i dobrze zabarwione na ciemnoniebiesko plamki białkowe. Nawet w porównaniu z żelem 2-D barwionym srebrem zgodnie z metodą Shevchenko et al.⁵, która charakteryzuje się wysoką czułością i kompatybilnością ze spektrometrią mas, osiągamy porównywalne efekty barwienia.

Rycina 1: Końcowy wynik opisanego powyżej eksperymentu. Protokół Coomassie według Kanga (A) wykazuje wysoką skuteczność, porównywalną z barwieniem srebrem według Shevchenko et al. (B), w wykrywaniu białek po elektroforezie żelowej 2-D.

Część 4: Wskazówki i triki

• Przed przystąpieniem do analizy własnych próbek należy wykonać kilka barwień testowych. Z niewyjaśnionych przyczyn zdarzało nam się odnotować przypadki, w których białko docelowe nie zostało pomyślnie wykryte mimo naniesienia ilości rzędu miligramów. W takim przypadku zalecamy przygotowanie serii rozcieńczeń w celu przetestowania czułości metody.
• Jeśli w ogóle obserwuje się słabą detekcję białek w żelu, przyczyną może być nieudawany transfer z żelu koncentrującego do żelu rozdzielczego podczas SDS-PAGE. Można sprawdzić obecność takich „lepkich” białek, barwiąc cały żel, w tym obszar koncentrujący.
• W celu szybkiej weryfikacji wyników ogniskowania izoelektrycznego można bezpośrednio zabarwić paski IPG bez przeprowadzania dalszej separacji w drugim wymiarze.
• Podczas procedury barwienia należy sporadycznie obracać żele, aby były one równomiernie barwione z obu stron (pozostawienie żeli w bezruchu powoduje wiązanie barwnika tylko do jednej strony żelu).
• Zaobserwowaliśmy, że przechowywanie roztworu barwiącego w ciemnej butelce przedłuża jego trwałość (w butelkach przezroczystych wynosi ona do 4 miesięcy).
• Po zabarwieniu i dokumentacji żele można przechowywać w lodówce przez kilka lat (dodanie roztworu kwasowego pozwala uniknąć zanieczyszczeń grzybami).
• Odbarwianie wycinków żelu do trawienia trypsyną można przyspieszyć poprzez ogrzewanie w bloku grzejnym.

Dyskusja

Innowacyjny czy tylko kolejny protokół barwienia Coomassie?

Obecnie istnieje wiele protokołów procedur barwienia za pomocą Coomassie Brilliant Blue. Większość z nich wynika z niewielkich lub znaczących modyfikacji jednego z najczęściej stosowanych protokołów opracowanych przez Neuhoffa i współpracowników². Protokół Kanga również opiera się na formule Neuhoffa. Czy jest to jednak rzeczywiście alternatywna metoda barwienia Coomassie w badaniach proteomicznych? Przeanalizujemy dwie głó...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
żele Immobiline DryStrip	GE Healthcare	17-6001-94	Mogą być używane nawet 2 lata po dacie ważności.
kuweta do rehydratacji Immobiline DryStrip	GE Healthcare	80-6371-84	Nie czyścić rozpuszczalnikami organicznymi. Przeznaczona dla pasków IPG o długości 7-18 cm.
zestaw Immobiline DryStrip	GE Healthcare	18-1004-30	Zawiera kuwetę, uchwyt elektrod, elektrody anodowe i katodowe, wyrównywacz, listwę na kubeczki do próbek oraz kubeczki do próbek.
zasilacz EPS 3501 XL	GE Healthcare	18-1130-05	Zapewnia napięcie do 3500 V.
układ elektroforetyczny Multiphor II	GE Healthcare	18-1018-06	Ruchome elektrody umożliwiają IEF w paskach IPG o dowolnej długości (paski IPG 7-24 cm)
system żelowy PerfectBlue Twin S	Peqlab	45-1010-C	SDS-PAGE w formacie mini-żelu 10x10 cm. Komora żelowa zawiera system chłodzenia.
kuwety do barwienia z pokrywkami	VWR international	216-3412	Pasują do mini-żeli. Możliwość układania w stosy na wytrząsarce.
siarczan glinu 18-wodny	Merck & Co., Inc.	1.01102.5000	Najlepsze doświadczenia uzyskaliśmy z produktami firmy Merck. Dostępny wyłącznie w opakowaniach 5 kg.
kwas ortofosforowy	Prolabo	20 624.295	Sprzedawany w butelkach szklanych.