Ligacja LAD: mysi model zawału mięśnia sercowego

Podsumowanie

W niniejszym materiale wideo zaprezentowano sposób wykorzystania szybkiego i wiarygodnego modelu do badania procesów patobiologicznych i patofizjologicznych niedokrwienia mięśnia sercowego.

Streszczenie

Modele badawcze zawału i niedokrwienia mięśnia sercowego są niezbędne do badania ostrych i przewlekłych procesów patobiologicznych oraz patofizjologicznych w niedokrwieniu mięśnia sercowego, a także do opracowywania i optymalizacji przyszłych metod leczenia.

U gryzoni laboratoryjnych przeprowadza się dwie różne metody wywoływania niedokrwienia mięśnia sercowego. Pierwsza metoda polega na wywołaniu zawału kriogenicznego, co jest techniką szybką, lecz niedokładną, w której do powierzchni serca przykładany jest kriopen (1-3). Stosując tę metodę, naukowiec nie może zagwarantować, że blizna kriogeniczna prowadzi do niedokrwienia; ponadto powstaje rozległy uszczerbek w mięśniu sercowym, który wykazuje efekty patofizjologiczne niezwiązane z zawałem mięśnia sercowego. Drugą metodą jest trwałe podwiązanie lewej tętnicy wieńcowej przedniej zstępującej (LAD). W tym przypadku LAD zostaje podwiązana jednym szwem, co powoduje niedokrwienie widoczne niemal natychmiast. Poprzez zamknięcie LAD uniemożliwia się dalszy przepływ krwi w tym obszarze, podczas gdy otaczająca tkanka mięśnia sercowego pozostaje niemal nienaruszona. Ta procedura chirurgiczna naśladuje aspekty patobiologiczne i patofizjologiczne występujące w niedokrwieniu mięśnia sercowego związanym z zawałem.

Metoda przedstawiona w tym filmie demonstruje procedurę chirurgiczną modelu zawału u myszy poprzez podwiązanie LAD. Model ten jest przydatny w badaniach patobiologicznych, patofizjologicznych oraz immunobiologicznych nad zawałem serca. Przedstawiona technika zapewnia wysoką dokładność i wykazuje dobrą korelację z przekrojami histologicznymi.

Protokół

Myszy Balb/C o wadze minimum 20g w wieku od 8 do 12 tygodni są nabywane z firmy Charles River (Sandhofer Weg 7, D-97633 Sulzfeld).
Myszy są utrzymywane w warunkach konwencjonalnych, karmione standardową paszą w granulkach i pite wodą ad libitum. Myszy należy znieczulić izofluranem (2%) przy użyciu komory indukcyjnej.

1. Ogolić obszar szyi oraz lewą stronę klatki piersiowej w okolicy żeber i zdezynfekować 80% etanolem.
2. Ułóż mysz na grzbiecie i nałóż maskę na nos i pysk, aby podtrzymać znieczulenie.
3. Sprawdzić odruchy, uciskając ogon i tylne łapy, aby upewnić się, że mysz jest w stopniu wystarczającym znieczulona.
4. Pod kontrolą mikroskopu należy wykonać cięcie w linii środkowej szyi, oddzielając skórę, mięśnie i tkankę pokrywającą tchawicę.
5. Po odsłonięciu tchawicy należy wykonać niewielki otwór w tkance między dwoma pierscieniami chrzęstnymi poniżej głośni, aby wprowadzić rurkę endotrachealną (Rysunek 1). Wprowadź rurkę endotrachealną, trzymając głowową część tchawicy za pomocą mikrosurgicalnych kleszczyków. Sprawdź ruchy klatki piersiowej, aby upewnić się, że oba płuca są dobrze wentylowane.
6. Częstość oddechów (RR) powinna wynosić około 110 na minutę, przy ciśnieniu wdechowym od 17 do 18 cm H2O₂O. Ostrożnie obróć mysz, kładąc ją na prawym boku, tak aby lewa strona była skierowana ku górze. Wykonaj lewostronną torakotomię między 3.^rd or 4^th żebro, a następnie ostrożnie wypreparować tkankę i mięśnie, używając kauteryzatora w celu zapobiegania krwawieniu.
7. Ostrożnie otwórz klatkę piersiową. Po otwarciu klatki piersiowej zlokalizuj serce, uważając, aby nie dotknąć płuc żadnym ostrym narzędziem. Następnie usuń część osierdzia zakrywającą serce.
8. LAD znajduje się pomiędzy tętnicą płucną a lewym uszkiem przedsionka. Za pomocą nici Prolene 8-0 (Ethicon, Norderstedt, Niemcy) należy podwiązać LAD proksymalnie, stosując pojedynczy szew (Rysunek 2).
9. Wprowadź dreny klatki piersiowej (28G, cewnik żylny) pomiędzy 4.^th oraz 5^th żebro
10. Zamknąć nacięcie klatki piersiowej warstwowo, stosując szwy ciągłe Prolene 6-0 (Ethicon, Norderstedt, Niemcy) do zbliżenia żeber oraz szwy ciągłe Prolene 4-0 (Ethicon, Norderstedt, Niemcy) do zamknięcia skóry.
11. Ostrożnie opróżnij klatkę piersiową za pomocą strzykawki 2 ml (Rysunek 3). Połóż mysz na plecach. Następnie wyjmij rurkę endotrachealną i zaadaptuj chrząstki pierścieniowate tchawicy za pomocą jednego szwu, używając nici Prolene 7-0 (Ethicon, Norderstedt, Niemcy).
12. Nałożyć maskę na pysk myszy i zamknąć skórę, stosując szwy ciągłe z nici Prolene 4-0 (Ethicon, Norderstedt, Niemcy).

Walidacja

Istnieje kilka sposobów potwierdzenia powodzenia ligacji LAD.

Badanie poziomu troponiny można przeprowadzić od 6 do 18 godzin po operacji, wykorzystując jedynie 150 µL krwi, bez konieczności uśmiercania zwierzęcia. Krew nanosi się na specjalistyczny zestaw testowy do oznaczania troponiny (TROP T Sensitive, Roche, Mannheim) (Rysunek 4). Troponina jest białkiem regulacyjnym w filamentach aktynowych komórki mięśniowej; w trzech rodzajach mięśni występują różne izotypy. Izotypy cTnI i cTnT występują w sercu i są uwalniane podczas uszkodzenia tkanek. Standaryzowany test na troponinę T (cTnT) opiera się na dwóch przeciwciałach monoklonalnych specyficznych dla serca: pierwsze wychwytuje troponinę w próbce krwi, a drugie służy jako marker.

Obszar zawału można zidentyfikować makroskopowo po 3 dniach (Rysunek 5).

Barwienie TTC (chlorek 2,3,5-trifenylotetrazoliu) pozwala ocenić żywotność tkanki w celu określenia wielkości obszaru zawału. Barwnik Evans blue (1,5%, 1,0mL) w soli fizjologicznej buforowanej fosforanowo (PBS) wstrzykuje się do jamy lewej komory, aby zmierzyć obszar niedokrwienia mięśnia sercowego. Myszy poddaje się eutanazji, a serce jest pobierane i dzielone na plastry. Plastry tkanki inkubuje się w 1% roztworze TTC w PBS o pH 7,4 w temperaturze 37°C przez 20min. Tkanki utrwala się w 10% formalinie buforowanej PBS przez noc w temperaturze 2-8°C. TTC podaje się ex vivo w celu zabarwienia obszarów niepochłaniających barwnika Evans blue (Rycina 6).

Do badań histologicznych mysz musi zostać uśpiona, a serce zatopione w celu dalszej obróbki. Po wykonaniu seryjnych cięć w parafinie, preparaty barwi się H&E (hematoksyliną i eozyną) lub barwieniem trichromowym w celu uwidocznienia tkanki włóknistej (Rysunek 7).

Rycina 1: Rurka intubacyjna.
1A: Odsłonięta tchawica po brzuszny nacięciu szyi.
1B: Tchawica zostaje otwarta dwa pierścienie chrzęstne za krtanią w kierunku ogonowym.
1C: Rurka intubacyjna zostaje wprowadzona do tchawicy.

Rysunek 2: Serce jest odsłonięte poprzez lewostronną torakotomię, LAD zostaje podwiązana.

Rycina 3: Po zamknięciu klatki piersiowej wykonano drenaż opłucnej. Mysz wciąż znajduje się pod wpływem anestezji.

Rysunek 4: Po kilku minutach pojawiają się dwie linie, gdy test na troponinę jest dodatni.

Rysunek 5: Przedstawia wypreparowane serce.
5A: Widok makroskopowy serca z obszarem niedokrwiennym o wyblakłym, białym kolorze.
5B: Przekrój poprzeczny zawałowanego serca, obszar niedokrwienny widoczny w prawym górnym rogu.

Dyskusja

Podsumowując, niniejszy film przedstawia krok po kroku model ligacji LAD i wykazuje, że ligacje LAD u myszy są łatwo wykonalnymi procedurami chirurgicznymi.