Opisujemy proces wykorzystujący laserową mikrodysekcję do izolacji i ekstrakcji RNA z homogenicznej populacji komórek — neuronów piramidowych — w warstwie III zakrętu skroniowego górnego w pośmiertnych ludzkich mózgach. Następnie przeprowadzamy linearną amplifikację (opartą na T7) mRNA i hybrydyzujemy próbkę z macierzą Affymetrix human X3P.
Artykuł metodologiczny
Uzyskiwanie wysokiej jakości RNA z populacji pojedynczych komórek w pośmiertnej tkance mózgu człowieka
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Zaproponowaliśmy zbadanie redukcji istoty szarej w górnym zakręcie skroniowym u pacjentów z schizofrenią poprzez analizę profili ekspresji genów neuronów piramidalnych w warstwie III. Powszechnie wiadomo, że kora mózgowa jest strukturą wyjątkowo heterogenną, składającą się z różnorodnych obszarów, warstw i typów komórek, z których każdy charakteryzuje się odmiennym składem komórkowym i molekularnym, a tym samym różnicującymi się profilami ekspresji genów. Aby uniknąć wpływu heterogeniczności tkanki, zastosowaliśmy mikrodysekcję wspomaganą laserem (LCM) w celu izolacji konkretnego typu komórek, mianowicie neuronów piramidalnych.
Za pomocą systemu Arcturus XT LCM pobrano około 500 neuronów piramidowych zabarwionych roztworem barwiącym Histogene. Następnie z pobranych komórek wyizolowano RNA, które poddano dwóm cyklom liniowej amplifikacji opartej na T7 z wykorzystaniem zestawów Arcturus/Molecular Devices. Analiza żelu i elektroferogram z systemu Experion LabChip (Bio-Rad) wykazały dobrą jakość a(m)RNA, z długością transkryptu przekraczającą 600nt, co jest wymagane dla mikromacierzy. Średnia ilość uzyskanego mRNA wyniosła 51μg, a średnia czystość próbek, określona przez stosunek A260/280, była na akceptowalnym poziomie 2,5. Profil ekspresji genów opracowano z wykorzystaniem macierzy sond Human X3P GeneChip firmy Affymetrix.
Protokół
1) Krojenie tkanek:
Niezbędny materiał tkankowy (grupa kontrolna n=9, schizofrenia n=9) pozyskano z Harvard Brain Tissue Resource Center, dopasowując próbki pod kątem wieku, płci oraz czasu przeżycia po śmierci (PMI) (Tabela 1). Bloki utrwalone w oparach ciekłego azotu o grubości około 3mm pobrano z pola 42 według Brodmanna (zakręt skroniowy górny).
Przed rozpoczęciem barwienia neuronów piramidowych należy zoptymalizować warunki w celu uzyskania optymalnego „odrywania” tkanki (tissue lift) oraz wysokiej jakości RNA. „Odrywanie” tkanki opisuje proces podczas laserowej mikrodysekcji przechwytującej, w którym neurony zaznaczone do przechwycenia przylegają do nakładki i zostają oddzielone, podczas gdy pozostała tkanka zostaje w miejscu.
Optymalizacja:
- Aby zredukować aktywność RNaz, która pogarsza jakość RNA, należy potraktować wszystkie powierzchnie, w tym obszar roboczy, nóż do skrawania i szkiełka, roztworem do dekontaminacji RNaz, takim jak RNase Zap, a następnie przetrzeć je 100% etanolem.
- Przecięcia tkanki należy wykonywać przy użyciu kriotoma ustawionego na -17°C. Pozwala to zmniejszyć gradient temperatury między temperaturą pokojową (szkiełka), kriotomem a suchym lodem (patrz cały proces poniżej). Jeśli temperatura spadnie poniżej -20°C, sekcje tkanki mają tendencję do rozrywania się, co czyni je nieprzydatnymi. Wyższa temperatura zwiększa gradient temperatury, co może naruszyć integralność RNA.
- Grubość sekcji powinna wynosić 8μm, ponieważ grubsze sekcje ostatecznie utrudnią „odrywanie” (lift) tkanki. Taka grubość umożliwia również prawidłową identyfikację neuronów piramidalnych do wychwytu.
- Należy stosować zwykłe, nieładunkowe szkiełka szklane (np. szkiełka LCM Histogene), ponieważ nie zakłócają one procesu „odrywania” tkanki podczas laserowej mikrodysekcji. Można również stosować szkiełka membranowe, jednak nadają się one bardziej do izolowania dużych struktur tkankowych, ponieważ membrana ma tendencję do lekkiego odrywania się podczas procesu laserowego, co zwiększa rozmiar plamki lasera podczerwonego (IR) i zmniejsza specyficzność komórkową.
- Na każdym szkiełku należy umieścić dwie sekcje, ponieważ większa liczba sekcji na jednym szkiełku mogłaby pogorszyć jakość RNA ze względu na ciągłe zmiany temperatury podczas procesu skrawania.
- Po wykonaniu sekcji szkiełka należy niezwłocznie umieścić w kasecie do mikroprzesuwników na suchym lodzie, aby zachować integralność RNA. Kasety zawierające sekcje mózgu są następnie przechowywane w temperaturze -80°C do czasu przetworzenia.
Wcześniej ustaliliśmy, że w przypadku neuronów piramidowych wystarczająca jest liczba 500 komórek na przypadek, aby pozyskać odpowiednią ilość RNA do hybrydyzacji mikromacierzy. Na jeden przypadek wymagane są około cztery skrawki, co wynika głównie z występowania artefaktów podczas krojenia i barwienia.
2) Barwienie neuronów piramidowych:
Identyfikację neuronów piramidowych przeprowadza się przy użyciu zestawu i szybkiego roztworu barwiącego Histogene, ponieważ pozwala on na wizualizację tych neuronów bez długotrwałej ekspozycji na roztwory wodne, co pozwala na zachowanie RNA.
- Przygotuj procedurę barwienia, dodając 1μl inhibitora RNazy na każde 100μl roztworu barwiącego (np. Promega), aby ograniczyć aktywność RNaz. Dla czterech skrawków (2 szkiełka) wymagane jest dodanie 4μl inhibitora RNazy do 400μl roztworu barwiącego Histogene w probówce do mikrocentryfugi o pojemności 1,5ml (przechowywanej w lodzie). Dla każdego skrawka używamy 97μl tego roztworu, co zapewnia odpowiednie zabarwienie pozwalające na identyfikację neuronów piramidowych.
- Przygotuj serię do odwadniania i ksylen: odmierz 25ml odpowiednich stężeń etanolu do słoików do barwienia dostarczonych w zestawie Histogene, tj. 2x75%, 95%, 100% oraz 2 słoików z wodą wolną od RNaz. Umieść wszystkie słoiki w wiaderku z lodem, z wyjątkiem jednego słoika z 75% etanolem, który należy umieścić w zamrażarce w temperaturze -20°C. Pod dygestorium dodaj sita molekularne do słoika z ksylenem, aby usunąć nadmiar wody, który mógłby upośledzić proces „odrywania” (lift) tkanki.
- Włącz łaźnię wodną (lub blok grzejny) z temperaturą ustawioną na 42°C i umieść w niej probówkę Falcon 50ml wspartą na statywie.
- Wyjmij dwa szkiełka z temperatury -80°C i rozmroź je na chusteczce KimWipe przez około 30 sekund, lub do momentu, gdy rogi szkiełek zaczną się rozmrażać.
- Krótko utrwal szkiełka w 75% etanolu przez 30 sekund w zamrażarce -20°C. Przenoś szkiełka między słoikami do barwienia za pomocą pęsety oczyszczonej z RNaz (RNase-zapped), aby zmniejszyć ryzyko kontaminacji.
- Po 30-sekundowym płukaniu w wodzie wolnej od nukleaz, wokół skrawków można obrysować ramkę markerem barierowym PAP, aby skoncentrować roztwór na skrawku, jednak w przypadku zwykłego szkiełka przedmiotowego nie jest to absolutnie konieczne.
- Zabarw cztery skrawki roztworem barwiącym Histogene przez 20 sekund, używając 97μl barwnika z inhibitorem RNazy na skrawek. Następnie odwodnij skrawki w wcześniej przygotowanych etanolach w lodzie, przez 30 sekund na każdym etapie. Ostatni etap w 100% etanolu należy wydłużyć do 3 minut, aby uzyskać wystarczające odwodnienie dla prawidłowego „odrywania” tkanki i jej przechwycenia przez nakładki LCM.
- Zanurz szkiełka w ksylenie na 5 minut i pozostaw do wyschnięcia na powietrzu w dygestorium przez kolejne 5 minut przed przechwytywaniem.
Etapy barwienia należy przeprowadzać tylko w przypadku, gdy bezpośrednio po nich następuje mikrodysekcja laserowa. Wszystkie roztwory powinny być wymieniane co 4-6 preparatów, aby zapobiec kontaminacji i zapewnić prawidłową dehydratację.
3) Laserowa mikrodysekcja pojedynczych komórek:
Po barwieniu neurony piramidowe z warstwy III są usuwane za pomocą mikrodysekcji laserowej z wykorzystaniem systemu i oprogramowania Arcturus XT. W skrócie, system działa poprzez wysyłanie impulsów laserowych IR o regulowanej mocy przez folię termoplastyczną znajdującą się u podstawy nakładki, co powoduje rozciągnięcie/wybrzuszenie folii bezpośrednio na komórkach docelowych. Po podniesieniu nakładki z tkanki komórki pozostają przechwycone/unieruchomione na nakładce. Podsumowanie obrazkowe przedstawiono na Rysunku 1.
Przed rozpoczęciem tej procedury ważne jest rozróżnienie dwóch rodzajów nakładek dostępnych w tym systemie. Podczas gdy nakładka Macro CapSure jest zazwyczaj używana do wychwytywania większych struktur tkankowych, nakładki CapSure HS zostały zaprojektowane do wychwytywania niewielkiej liczby pojedynczych komórek, w związku z czym nakładki te mają mniejszą powierzchnię przeznaczoną do wychwytu. Nakładki HS posiadają również prowadnice, które zapobiegają bezpośredniemu kontaktowi nakładki z skrawkiem tkanki, czego nie posiada nakładka Macro. Prowadnice te ograniczają efekt zwijania się tkanki, który może wpływać na wielkość plamki (impulsu laserowego) lub indukować jej zmienność, podczas gdy nakładka Macro spoczywa bezpośrednio na zwiniętej, nierównej tkance. W naszej procedurze użyliśmy nakładek HS, aby wykorzystać ich zdolność do ograniczania efektu zwijania się tkanki, ale w oprogramowaniu zachowaliśmy ustawienia nakładki Macro, aby maksymalnie zwiększyć obszar wychwytu, ponieważ wychwytywaliśmy dużą liczbę komórek.
- Załaduj slajdy i nakładki do urządzenia Arcturus XT. Użyj nakładek CapSure HS, ale pozostaw ustawienie programu na Macro. Zaznacz pole „Load with overview”, aby uzyskać zdjęcie poglądowe każdego slajdu.
- Dostosuj jasność/ostrość przy powiększeniu 2x, aby określić, który fragment będzie optymalny do mikrodysekcji laserowej. Unikaj przekrojów tkanki z nadmiernymi zagięciami; wybierz fragmenty nienaruszone, gładkie i dobrze zbarwione, szczególnie w pobliżu obszaru zainteresowania, czyli warstwy III.
- Następnie umieść nakładkę nad ogólnym obszarem, z którego będziemy pobierać materiał, upewniając się, że obejmuje ona warstwę III. Nadal przy powiększeniu 2x upewnij się, że prowadnice nakładki nie opierają się na żadnych zagięciach, ponieważ spowodowałoby to przechylenie nakładki.
- Następnie ręcznie potwierdź położenie punktu lasera IR przy powiększeniu 40x. Jeśli punkt (czerwona wiązka) nie pokrywa się z niebieskim krzyżykiem, można to skorygować, klikając prawym przyciskiem myszy na punkt i wybierając „located IR spot”.
- Przy powiększeniu 40x można rozpocząć identyfikację neuronów piramidalnych według następujących kryteriów: (1) komórki o kształcie piramidalnym oraz (2) identyfikowalne proksymalne części dendrytów apikalnych i/lub bazalnych (Ryc. 1A).
Następnie dostosowujemy moc i czas trwania impulsu laserowego, aby uchwycić neuron piramidalny. Jest to szczególnie istotne, ponieważ determinuje to specyficzność uchwyconej komórki, a także liczbę uchwyconych komórek. Jeśli impuls będzie zbyt słaby, nie wszystkie zidentyfikowane neurony zostaną uchwycone, natomiast jeśli będzie zbyt silny, może dojść do uchwycenia otaczającej tkanki lub innych komórek niż tylko neuron. Zazwyczaj, przy zastosowanej tutaj specyfikacji tkanek i komórek, moc lasera (70mW) i czas trwania impulsu (16msec) skutkują rozmiarem plamki wynoszącym 25μm, co jest w przybliżeniu zgodne z rozmiarem neuronu piramidalnego (Ryc. 1B). Niemniej jednak parametry te są precyzyjnie dostrajane dla każdego przekroju, aby uzyskać zbliżony rozmiar plamki w każdym przypadku. Jeśli „lift” jest niewystarczający, można zawsze zwiększyć liczbę uchwyconych komórek, aby utrzymać porównywalną ilość RNA uzyskaną z każdego przypadku. Należy jednak dopilnować, aby całkowity czas pobierania, wliczając barwienie, nie przekroczył 1,5 godziny, ponieważ dłuższy czas może pogorszyć jakość RNA.
- Najpierw zapisz pozycję kapsuły, klikając znak plus przy funkcji pozycji. Dzięki temu, jeśli z jakiegokolwiek powodu konieczne będzie zdjęcie kapsuły, a następnie ponowne umieszczenie jej w tym samym miejscu, kapsuła zawsze powróci dokładnie do punktu, dla którego dostosowano rozmiar plamki.
- Wprowadź następujące wartości do pola sterowania: 70 dla mocy (power) i 16 dla czasu trwania (duration). Odznacz opcję „auto move stage” i upewnij się, że symbol rozmiaru po prawej stronie odpowiada symbolowi na panelu po prawej.
- Wybierz opcję koła (prawy dolny róg), aby zaznaczyć neuron, którego próbne przechwycenie chcesz przeprowadzić, a następnie aktywuj laser, klikając „test IR spot”.
- Plamka wytworzona przez laser powinna początkowo mieć wyraźny ciemny pierścień wokół przechwyconego obiektu. Jeśli pierścień jest zbyt jasny, komórka nie została przechwycona. Jeśli w środku ciemnego pierścienia znajduje się ciemna plamka, oznacza to, że moc/czas trwania lasera jest zbyt duża, co może negatywnie wpłynąć na RNA obecne w przechwyconej komórce. Upewnij się, że pierścień jest wystarczająco duży, aby objąć komórkę, ale na tyle mały, aby nie obejmował niepożądanej tkanki ani innych komórek.
- Powtórz ten proces w różnych częściach tkanki w obrębie warstwy, z której chcesz dokonać przechwycenia, aby sprawdzić, czy rozmiar plamki nie zmienia się w zależności od lokalizacji. W razie potrzeby dokonaj odpowiedniej korekty.
- Po dostrojeniu plamki laserowej przejdź do identyfikacji neuronów piramidowych do przechwycenia. Identyfikujemy około 500 komórek na próbkę, co daje około 500pg całkowitego RNA na próbkę. Zazwyczaj używamy tylko jednego przekroju, aby skrócić czas przechwytywania, ponieważ kapsuła musi być ponownie ustawiana dla każdego przekroju. Po zidentyfikowaniu wszystkich potrzebnych komórek naciśnij przycisk przechwytywania laserowego (laser-capture), a wszystkie komórki zostaną automatycznie przeniesione na kapsułę (Rys. 1C).
- Po przechwyceniu wszystkich komórek przesuń kapsułę w inne miejsce szkiełka, w którym nie znajduje się przekrój. Wróć do miejsca, z którego przechwycono komórki, i upewnij się, że usunięto co najmniej 90% neuronów. Jeśli tak nie jest, nie próbuj ponownie przechwytywać tych samych komórek, lecz zlokalizuj obszar, z którego przechwycono najwięcej komórek, i przechwyć ich więcej w tym samym obszarze. Przesuń kapsułę do stacji kontroli jakości (QC station).
- Umieść kapsułę w probówce do mikrowirówki 0,5ml firmy Applied Biosystems (kat. # N8010611) zawierającej 50ml buforu ekstrakcyjnego (zestaw PicoPure RNA Isolation kit). Kapsuła została zaprojektowana tak, aby idealnie pasować do tej konkretnej probówki, co zapobiega wyciekowi buforu.
- Odwróć zestaw do góry nogami, upewniając się, że bufor ekstrakcyjny całkowicie zakrywa kapsułę, i umieść go na dnie probówki Falcon 50ml, która znajduje się już w kąpieli wodnej ustawionej na 42°C. Neurony inkubuje się przez 30 minut, aby usunąć tkankę z kapsuły.
- Następnie wiruj zestaw probówki i kapsuły przez 2 minuty przy 800g. Wyjmij kapsułę i przechowuj pozostały ekstrakt komórkowy w temperaturze -80°C do czasu ekstrakcji RNA. W ramach dodatkowej ostrożności można ponownie zbadać kapsułę w stacji QC na aparacie do przechwytywania laserowego, aby upewnić się, że wszystkie neurony zostały usunięte z samej kapsuły.
4) Pozyskiwanie RNA z określonych populacji neuronów:
Można przejść bezpośrednio od etapu wychwytywania do izolacji lub rozmrozić próbkę przechowywaną w zamrażarce -80°C. W naszym doświadczeniu najpierw zebraliśmy wszystkie potrzebne próbki i przechowywaliśmy je w temperaturze -80°C przed przystąpieniem do izolacji RNA.
Izolację RNA przeprowadza się przy użyciu zestawu PicoPure Isolation Kit, który został zaprojektowany do izolowania niewielkiej liczby komórek z próbek LCM oraz do zatrzymywania niskostężonego mRNA. Zazwyczaj postępujemy zgodnie z protokołem dołączonym do zestawu. Poniżej przedstawiamy podstawowy opis tego procesu.
- Po rozmrożeniu dodać 70% etanol (dołączony do zestawu) i odwirować na uprzednio przygotowanej kolumnie oczyszczającej, aby związać RNA z filtrem kolumny.
- Po przemyciu RNA należy poddać działaniu DNazy, aby zapewnić całkowite usunięcie DNA i wyeliminować ryzyko interferencji DNA. Krok ten jest szczególnie istotny w późniejszych zastosowaniach, takich jak qRT-PCR w czasie rzeczywistym.
- Po trawieniu DNA następuje kolejny etap płukania. Przed przeniesieniem do innej probówki do mikrocentryfugi należy upewnić się, że w kolumnie nie pozostał bufor do płukania, ponieważ obecność buforu w końcowej próbce spowoduje zmniejszenie ilości wyjściowego RNA do amplifikacji. Aby to zapewnić, ostatni etap płukania wirujemy przez 2,5 minuty zamiast 2 minut sugerowanych w dostarczonym protokole.
- Na koniec dodaje się bufor elucyjny i inkubuje go na filtrze w kolumnie przez 1 minutę, a następnie wiruje w celu elucji całkowitego RNA.
- Do osobnych probówek o pojemności 0,5 ml należy napipetować 1,3 µL każdej z próbek w celu przeprowadzenia analizy Experion HighSens LabChip. Resztę próbek należy zamrozić w temperaturze -80°C.
Kontrola jakości jest bardzo ważna podczas izolacji RNA, zwłaszcza gdy ilość uzyskanego materiału jest niewielka, a zapotrzebowanie, np. dla eksperymentów z wykorzystaniem mikromacierzy (15μg), jest duże. Dlatego wyekstrahowane RNA musi zostać poddane kontroli jakości na różnych etapach procesu. Pierwsza z nich odbywa się po ekstrakcji. Ustalamy integralność całkowitego RNA poprzez ogólną analizę pików 18S/28S na elektroferogramach i wirtualnym żelu generowanym przez Experion HighSens LabChip. Metoda ta jest szybka i zapewnia dwa sposoby pomiaru w celu sprawdzenia jakości RNA – elektroferogram oraz wirtualny żel (Ryc. 2). Jeśli jakość całkowitego RNA jest stosunkowo dobra (Ryc. 2A, B vs. C, D), przechodzimy następnie do liniowej amplifikacji mRNA, które stanowi około 2% całkowitego RNA.
5) Amplifikacja liniowa:
Amplifikacja RNA wyekstrahowanego z tkanek wyizolowanych metodą laserowej mikrodisekcji jest niezbędna w celu uzyskania odpowiedniej ilości RNA do późniejszej hybrydyzacji mikroarray oraz eksperymentów qRT-PCR. Aby zminimalizować ryzyko wystąpienia potencjalnych zakłóceń odnotowanych przy liniowej amplifikacji opartej na T7, zredukowaliśmy liczbę niezbędnych rund amplifikacji poprzez maksymalizację ilości wyjściowego materiału tkankowego pobranego za pomocą laserowej mikrodisekcji.
Nasze wstępne dane (nie pokazane) sugerują, że dwie rundy amplifikacji liniowej (zestaw RiboAmp HSPLUS) całkowitego RNA wyekstrahowanego z tkanek zawierających około 500 komórek pozwolą na otrzymanie około 50μg aRNA – co jest ilością wystarczającą do przeprowadzenia zarówno eksperymentów z mikromacierzą, jak i qRT-PCR. Jeśli to możliwe, należy unikać niepotrzebnego przenoszenia próbki między probówkami 0,2ml a 0,5ml, korzystając z bloku 0,5ml w termocyklerze oraz probówek 0,5ml dostarczonych w zestawie.
Ponownie zaznaczamy, że zastosowano protokół dołączony do zestawu. Poniżej przedstawiono jego skróconą wersję.
- Do próbki całkowitego RNA (ok. 11μl) dodać 1μl dostarczonego primera i inkubować w temperaturze 65°C przez 5 minut, a następnie schłodzić do 4°C przez 1 minutę.
- Dodać komponenty do syntezy pierwszej nici cDNA wraz z SuperScript III Reverse Transcriptase i inkubować w temperaturze 42°C przez 1 godzinę.
- Po syntezie drugiej nici cDNA oczyścić otrzymane cDNA za pomocą dostarczonej kolumny oczyszczającej. Zaleca się, aby podczas przenoszenia próbki z buforem wiążącym do kolumny oczyszczającej wirować probówki z próbką dwukrotnie – raz po przeniesieniu próbki do kolumny, ponieważ na ściankach probówek może pozostać do 1μl próbki.
- Przemyć cDNA dostarczonymi buforami do przemywania i eluiować oczyszczone cDNA buforem do elucji.
- Dodać komponenty do transkrypcji in vitro i inkubować przez 6 godzin w temperaturze 42°C.
- Po etapie trawienia DNazą oczyścić otrzymane aRNA za pomocą dostarczonych buforów, eluiując je finalnie w łącznie 12μl buforu do elucji.
RNA poddawane jest kolejnej rundzie amplifikacji liniowej (z zastosowaniem osobnych starterów – patrz protokół zestawu), po której wykonuje się kolejne etapy kontroli jakości. 1 µL próbki rozcieńcza się do stężenia około 250 ng/µL, aby określić długość i stężenie transkryptów mRNA za pomocą systemu StdSens LabChip (Experion). Tradycyjna technologia mikromacierzy Affymetrix wymaga, aby mRNA miało długość co najmniej 600 nukleotydów, aby mogło zostać wykryte. Zatem żel i elektroferogram uzyskane z LabChip powinny wykazać tę minimalną długość transkryptu mRNA (Rys. 3).
Dodatkową kontrolę jakości przeprowadza się za pomocą analizy spektrofotometrem NanoDrop, w której stosunek dwóch gęstości optycznych, tj. A260 i A280, określa czystość RNA. Próbki o gęstości optycznej wynoszącej około 2,1 powinny zostać zakwalifikowane do analizy ekspresji genów, choć wykazano, że stosunki do 2,7 zapewniają porównywalną jakość hybrydyzacji. Stężenie powinno wynosić od 800ng/μl do 1μg/μl, ponieważ wartości niższe prowadziły do degradacji RNA podczas przechowywania (nawet w temperaturach poniżej -80°C) oraz do słabych wyników analizy mikromacierzy.
6) Znakowanie biotyną próbek mRNA do analizy mikromacierzy Affymetrix:
Zestaw do znakowania biotyną TURBO Biotin labeling kit (znakowanie końcowe) firmy Molecular Devices jest wykorzystywany do znakowania aRNA otrzymanego z amplifikowanych próbek. Poniżej przedstawiono skróconą wersję protokołu.
- Objętość 20 μg każdej próbki aRNA należy dostosować do całkowitej objętości 13 μl poprzez dodanie wody wolnej od nukleaz lub zagęszczenie próbki w wirówce próżniowej, w zależności od stężenia początkowego. Chociaż do użytego chipa Affymetrix wymagane jest jedynie 15 μg, do reakcji początkowej dodajemy 20 μg, ponieważ część RNA ulega utracie podczas inkubacji i wirowania.
- Reakcję biotynylacji należy inkubować w temperaturze 85°C przez 30 minut, a następnie schłodzić do 4°C.
- Nadmiar znacznika biotyny należy usunąć poprzez wirowanie przy użyciu specjalistycznej kolumny dołączonej do zestawu. W niektórych przypadkach, zwłaszcza przy zdegradowanym mRNA, np. uzyskanym z próbek FFPE (utrwalonych formaliną i zatopionych w parafinie), może się zdarzyć, że nie całe mRNA zostanie wymyte w jednym etapie wirowania. W takim przypadku zalecamy dodanie od 1-5 μl dodatkowej wody wolnej od nukleaz do kolumny, a następnie przeprowadzenie dodatkowego, minutowego etapu wirowania. Zapewnia to wymycie większości znakowanej próbki.
- Objętość końcowa wynosi 20 μl przy stężeniu 1 μg/μl. Jeśli dodano dodatkową wodę wolną od nukleaz, próbki należy zagęścić do właściwej objętości w wirówce próżniowej. Zalecamy utrzymanie stężenia przechowywania powyżej 800 ng/μl przed rozpoczęciem hybrydyzacji, ponieważ stwierdzono, że niższe stężenie prowadzi do degradacji podczas przechowywania i/lub hybrydyzacji, co skutkuje słabymi wynikami mikromacierzy.
Następnie przeprowadzono hybrydyzację aRNA i analizę profilu ekspresji genów z wykorzystaniem macierzy sond Human X3P GeneChip firmy Affymetrix. Ponieważ chip ten został zaprojektowany dla bardziej zdegradowanego aRNA, użyliśmy go w ramach środków ostrożności, gdyż na jakość tkanek pobranych po śmierci może wpływać wiele czynników niezależnych od nas. Ze względu na brak odpowiedniego zaplecza do hybrydyzacji w naszym laboratorium, proces ten został przeprowadzony w placówce Partners Genomic Core.
Reprezentatywne wyniki:
1+2+3) Przygotowanie skrawków tkanek, barwienie neuronów piramidowych i mikrodysekcja sterowana laserem:
Opisany powyżej protokół powinien pozwolić na przygotowanie dwóch szkiełek z czterema sekcjami na każdym z nich. Każda sekcja powinna być gładka, z minimalną ilością rozdarć, pęknięć i zagięć. Przy prawidłowym barwieniu barwnik wykaże ciemno zabarwione neurony piramidowe o wielkości około 20 - 25μm, kształcie piramidowym i widocznych dendrytach apikalnych. Przy zastosowaniu nakładek CapSure HS w ustawieniach Macro oraz prawidłowej regulacji mocy i natężenia lasera dla każdej sekcji, należy uzyskać około 500 - 700 komórek na sekcję/przypadek, co przełoży się na co najmniej 500pg całkowitego RNA. Około 85 - 100% neuronów przylgnie do nakładki (Rys. 1).
4) Pozyskiwanie RNA z konkretnych populacji neuronów:
Zgodnie z opisem, po izolacji całkowitego RNA sprawdzamy jakość RNA za pomocą elektroferogramu i wirtualnego żelu w systemie Bio-Rad Experion. Na elektroferogramie powinny być widoczne dwa wyraźne piki odpowiadające jednostkom rybosomalnego RNA 18S i 28S. W przypadku tkanek pośmiertnych nie zawsze tak jest, ponieważ tkanka może być zdegradowana z powodu czynników występujących przed sekcjonowaniem. Zazwyczaj widoczne jest szerokie wybrzuszenie wskazujące na degradację, z dużym pikiem wokół 18S i mniejszym pikiem 28S (Ryc. 2A, B). Stwierdziliśmy, że o ile profile elektroferogramów są porównywalne pomiędzy próbkami, powyższa wytyczna pozwala na uzyskanie jakości mRNA wystarczającej do przeprowadzenia zarówno badań RT-PCR, jak i mikroarray (Imbeaud et al., 2005).
Jeśli stopień degradacji jest zbyt wysoki – co objawia się dużym polem pod krzywą elektroferogramu – lub jeśli piki nie są widoczne (Ryc. 2C, D) – komórki należy pobrać z tkanki ponownie. Zalecamy również przeprowadzenie testu skrobania tkanki, polegającego na ekstrakcji RNA z całych fragmentów skrawka (nie tylko z komórek), przed ponownym pobraniem komórek, aby ustalić, czy sam blok tkanki uległ degradacji.
5) Amplifikacja liniowa:
Aby przetestować jakość mRNA po dwóch rundach amplifikacji liniowej, wykorzystano zarówno system Bio-Rad Experion StdSens LabChip, jak i spektrofotometr NanoDrop. Tradycyjna technologia mikromacierzy Affymetrix wymaga, aby mRNA miało długość co najmniej 600 nukleotydów, aby mogło zostać wykryte, co osiągnięto za pomocą niniejszego protokołu. W rzeczywistości wykryto długości mRNA sięgające zakresu 1000 nukleotydów. Odzwierciedla to również elektroferogram, na którym widoczne są duże piki powoli opadające w funkcji czasu (Ryc. 3A, B).
Odczyty z NanoDrop wykazały średni stosunek A260/A280 na poziomie 2,5 we wszystkich próbkach, co świadczy o jakości mRNA (Tabela 2).
Nasze wyniki wskazują, że przy zastosowaniu tego protokołu zarówno ilość, jak i jakość uzyskanego RNA są wystarczające do badania różnic w ekspresji genów za pomocą Affymetrix human X3P GeneChip.
6) Znakowanie biotyną próbek mRNA do analizy mikromacierzowej Affymetrix:
Po hybrydyzacji z macierzą Affymetrix human X3P GeneChip uzyskaliśmy średni procent wywołań (percent calls) na poziomie 26,6% (Tabela 2), co wskazuje na odpowiednią hybrydyzację i intensywność sond.
Tabela 1: Podsumowanie kohorty
| Próbki | Grupa | Płeć | Wiek | PMI |
| C1 | KONTROLNA | K | 79 | 15.00 |
| C2 | KONTROLNA | M | 22 | 21.47 |
| C4 | KONTROLNA | M | 75 | 20.25 |
| C5 | KONTROLNA | M | 80 | 15.50 |
| C6 | KONTROLNA | K | 58 | 21.08 |
| C8 | KONTROLNA | M | 61 | 17.00 |
| C10 | KONTROLNA | K | 71 | 20.50 |
| C11 | KONTROLNA | K | 90 | 12.66 |
| C12 | KONTROLNA | K | 86 | 6.92 |
| ŚREDNIA | 4M/5K | 69.11 | 16.71 | |
| S1 | SCHIZOFRENIA | K | 93 | 6.92 |
| S2 | SCHIZOFRENIA | M | 55 | 21.40 |
| S3 | SCHIZOFRENIA | K | 67 | 21.80 |
| S4 | SCHIZOFRENIA | K | 55 | 22.00 |
| S5 | SCHIZOFRENIA | M | 36 | 17.97 |
| S6 | SCHIZOFRENIA | M | 62 | 10.75 |
| S8 | SCHIZOFRENIA | K | 92 | 17.80 |
| S11 | SCHIZOFRENIA | M | 56 | 21.83 |
| S12 | SCHIZOFRENIA | K | 88 | 13.33 |
| ŚREDNIA | 4M/5K | 68.11 | 16.90 |
Skróty: F - kobieta, M - mężczyzna, PMI - odstęp czasu od śmierci, schizoph. - schizofrenia.
Tabela 2: Podsumowanie wyników przedstawiające stężenie, jakość i wydajność hybrydyzacji RNA
| Próbki | [mRNA] ng/ul | A260/A280 | Intensywność sondy | Procent wywołań |
| C1 | 1318.01 | 2.67 | 63 | 19.5 |
| C2 | 2312.93 | 2.37 | 147 | 30.6 |
| C4 | 1811.92 | 2.44 | 69 | 26.6 |
| C5 | 1316.26 | 2.51 | 78 | 34.7 |
| C6 | 1663.24 | 2.39 | 66 | 33.8 |
| C8 | 633.05 | 2.54 | 101 | 15.2 |
| C10 | 1326.4 | 2.47 | 92 | 32.5 |
| C11 | 994.24 | 2.75 | 76 | 22.4 |
| C12 | 817.23 | 2.7 | 56 | 15.2 |
| S1 | 2560.88 | 2.47 | 78 | 25.0 |
| S2 | 2169.61 | 2.43 | 76 | 26.5 |
| S3 | 2067.32 | 2.52 | 87 | 22.1 |
| S4 | 1563.89 | 2.75 | 82 | 28.1 |
| S5 | 2071.44 | 2.44 | 88 | 28.2 |
| S6 | 2532.59 | 2.34 | 72 | 30.7 |
| S8 | 2189.22 | 2.5 | 62 | 31.8 |
| S11 | 1669.89 | 2.47 | 41 | 27.3 |
| S12 | 1739.35 | 2.47 | 42 | 28.0 |
| ŚREDNIA | 1708.75 | 2.51 | 76.44 | 26.57 |
Rysunek 1: Podsumowanie procesu mikrodysekcji laserowej. A) Neurony piramidowe są identyfikowane morfologicznie. B) Po impulsowaniu lasera przez folię termoplastyczną komórki przylegają do nakładki i nie znajdują się już na szkiełku, pozostawiając za sobą otaczającą tkankę. C) Fotomikrografia jednorodnej populacji komórek przylegających do nakładki CapSure Cap po mikrodysekcji laserowej.
Rycina 2: Kontrola jakości całkowitego RNA. A+B) Przedstawiają całkowite RNA dobrej jakości po izolacji, podczas gdy C+D) ilustrują wygląd całkowitego RNA po izolacji, który jest niepożądany. A) Elektroferogram z wyraźnymi pikami 18/28S odpowiadającymi wirtualnemu żelowi w (B). C) Elektroferogram wykazujący duży obszar pod krzywą i brak pików 18S/28S, co wskazuje na degradację RNA. Jest to również widoczne na wirtualnym żelu (D).
Rysunek 3: Kontrola jakości mRNA. A+B) Elektroferogram (A) i wirtualny żel (B) wskazujące długość transkrypcyjną (rozkład) mRNA niezbędną do badań z wykorzystaniem mikromacierzy, tj. przekraczającą 600 nukleotydów (nt). C+D) Elektroferogram (C) i wirtualny żel (D) pokazujące, jak wyglądałby niewystarczający rozkład mRNA, w przypadku gdy długość transkrypcyjna mRNA nie przekracza 200nt.
Dyskusja
W niniejszej pracy podejmujemy próbę dostosowania protokołu ekstrakcji jednorodnych populacji komórek z heterogenicznej pośmiertnej tkanki mózgowej przy użyciu systemu Arcturus XT oraz powiązanych zestawów do ekstrakcji RNA. Zgodnie z powyższym, wprowadziliśmy pewne modyfikacje do oryginalnych protokołów dostarczonych przez producenta, aby zmaksymalizować integralność RNA. Skuteczne wychwytywanie pojedynczych komórek zależy wyłącznie od optymalizacji etapów poprzedzających sam proces wychwytywania, w celu uzyskania maksymalnej liczby komórek z wysoką jakością RNA. Etapy te obejmują różne parametry związane z sekcjonowaniem i barwieniem tkanek. W skrócie, w odniesieniu do przygotowania tkanki, obejmują one: 1) zmniejszenie gradientu temperatury podczas sekcjonowania, 2) umieszczanie tylko 2 skrawków na jednym szkiełku, 3) przeprowadzanie wszystkich etapów odwodnienia w lodzie, 4) dodanie inhibitora RNazy do barwnika, 5) wydłużenie czasu odwodnienia w końcowym 100% etanolu do 3 minut.
W odniesieniu do procesu wychwytywania uważamy, że zastosowanie nakładek CapSure HS wraz z oprogramowaniem ustawionym w trybie Macro powinno zapewnić optymalne wyniki. Środowisko z kontrolowaną wilgotnością jest kluczowe dla wychwytywania pojedynczych komórek, ponieważ wysoka wilgotność drastycznie zmniejsza „odrywanie” tkanki. Wysokie temperatury mogą również negatywnie wpływać na jakość RNA.
Podczas protokołu izolacji RNA z zestawem PicoPure występują dwa etapy płukania. Ważne jest upewnienie się, że cały bufor do płukania został usunięty przed przeniesieniem próbki do kolejnej probówki do mikrocentryfugi w celu elucji RNA, ponieważ obecność buforu w końcowej próbce spowoduje zmniejszenie ilości RNA wyjściowego do amplifikacji. Aby to zapewnić, końcowy etap płukania wirujemy przez 2,5 minuty zamiast 2 minut sugerowanych w dołączonym protokole.
W przeważającej mierze protokół amplifikacji liniowej był zgodny z instrukcjami producenta. Należy jednak wziąć pod uwagę dwa kluczowe punkty podczas stosowania tego protokołu: 1) należy starać się ograniczyć straty RNA wynikające z nadmiernego przenoszenia próbek między probówkami, używając wyłącznie dostarczonych probówek 0,5 ml w połączeniu z blokiem 0,5 ml w termocyklerze; oraz 2) podczas przenoszenia próbki do kolumny oczyszczającej w celu puryfikacji cDNA, należy upewnić się, że probówki z próbką zostały odwirowane po pierwszym przeniesieniu. Pozwoli to na dodanie do kolumny oczyszczającej dodatkowych 1-2 µl próbki, co może zwiększyć odzysk cDNA.
Podczas korzystania z zestawu do znakowania końców TURBO w celu znakowania biotyną ograniczonych próbek aRNA, sugerujemy dodanie kilku dodatkowych μl wody przed etapem wirowania, aby zwiększyć wydajność ekstrahowanego z kolumny znakowanego RNA. Dodatkowa minuta wirowania również pomoże w tym zakresie, zwłaszcza w przypadku pracy z tkaniami zdegradowanymi, takimi jak tkanki FFPE.
Jesteśmy przekonani, że niniejszy protokół umożliwi użytkownikowi izolację małych, jednorodnych struktur, takich jak populacje pojedynczych komórek, z heterogennej tkanki mózgu pobranej po śmierci. Pozwala to na ograniczenie efektów rozcieńczenia przez otaczające struktury i inne typy komórek zlokalizowane w różnych warstwach mózgu, co prowadzi do uzyskania wyników ukierunkowanych na konkretne badane typy komórek. Ponieważ jakość uzyskanego RNA jest wystarczająco wysoka do badań z wykorzystaniem mikromacierzy, możemy rozpocząć precyzyjne określanie specyficznych sygnatur molekularnych konkretnych populacji komórek dotkniętych stanami chorobowymi.
Oświadczenia
Produkcja tego artykułu wideo była sponsorowana przez Life Technologies.
Podziękowania
Wyrażamy wdzięczność firmie Molecular Devices Analytical technologies/Arcturus za hojne przekazanie odczynników wykorzystanych w badaniu. Dziękujemy również Harvard Tissue Resource Center za udostępnienie pośmiertnej tkanki ludzkiego mózgu. Finansowanie: RO1MH76060 oraz P50MH080272.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Pinceta 4,5” | VWR international | 82027-392 | |
| System mikrodysekcji laserowej (LCM) Arcturus XT™ | MDS Analytical Technologies | 13821-00 | |
| Nakrętki LCM CapSure™ HS | MDS Analytical Technologies | LCM 0214 | |
| Nakrętki LCM CapSure® Macro | MDS Analytical Technologies | LCM 0211 | |
| Zautomatyzowana stacja elektroforezy Experion™ | Bio-Rad | 700-7001 | |
| Chipsy Experion™ RNA HighSens | Bio-Rad | 700-7155 | 10 chipsów |
| Odczynniki Experion™ RNA HighSens | Bio-Rad | 700-7156 | 10 chipsów |
| Chipsy Experion™ RNA StdSens | Bio-Rad | 700-7153 | 10 chipsów |
| Odczynniki Experion™ RNA StdSens | Bio-Rad | 700-7154 | 10 chipsów |
| Stożkowa probówka polipropylenowa Falcon® | BD Biosciences | 352070 | |
| Cienkościenna probówka reakcyjna z wypukłym korkiem GeneAmp® | Applied Biosystems | N8010611 | |
| Macierz GeneChip® Human X3P | Affymetrix | 900516 | 6 chipsów |
| Zestaw do barwienia mrożonych skrawków LCM Histogene® | MDS Analytical Technologies | KIT0401 | Zawiera roztwór barwiący, słoiki, etanole i ksylen |
| Szkiełka LCM Histogene™ | MDS Analytical Technologies | 12231-00 | |
| Pudełko na mikro-szkiełka | VWR international | 48444-004 | |
| Kriostat Microm HM 505E | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 22-050-350 | Numer katalogowy podobnego produktu, ponieważ obecny produkt nie jest już dostępny |
| Kąpiel wodna serii 280 sterowana mikroprocesorem | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 51221048 | Model 282 |
| Sito molekularne | EMD Millipore | MX1583L-1 | |
| Spektrofotometr NanoDrop 1000 | Thermo Fisher Scientific, Inc. | n/a | NanoDrop 1000 nie jest już dostępny, ale NanoDrop 2000 jest porównywalny. |
| Woda wolna od nukleaz | Ambion | AM9932 | |
| Szkiełka z membraną PEN | MDS Analytical Technologies | LCM 0522 | |
| Zestaw do izolacji RNA PicoPure® | MDS Analytical Technologies | KIT0204 | |
| RiboAmp®HSPLUS z znakowaniem biotyną | MDS Analytical Technologies | KIT0511B | 12 reakcji, zawiera zestaw do znakowania TURBO biotin labeling™ |
| RNase Zap® | Ambion | AM9780/2 | |
| Zestaw DNaza wolna od RNaz | Qiagen | 79254 | |
| RNasin® Plus | Promega Corp. | N261B | |
| Odwrotna transkryptaza SuperScript™ III | Invitrogen | 18080-044 |
Bibliografia
- Imbeaud, S., Graudens, E., Boulanger, V., Barlet, X., Zaborski, P., Eveno, E., Mueleer, O., Schroeder, A., Auffray, C. Towards standardization of RNA quality assessment using user-independent classifiers of microcapillary electrophoresis traces. Nucleic Acids Res. 33, e56-e56 (2005).
Przedruki i uprawnienia
Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE
Poproś o pozwolenie