Globalna analiza ekspresji genów przy użyciu platformy mikromacierzy oligonukleotydowych danio pręgowanego

Summary

Mikromacierze genów są potężnymi narzędziami do profilowania ekspresji genów na poziomie całego genomu. Technologia ta ma zastosowanie w różnych dyscyplinach biologicznych, w tym w biologii rozwojowej i toksykologii. W tym filmie szczegółowo opisujemy protokół globalnej analizy ekspresji genów przy użyciu kompleksowej platformy mikromacierzy oligonukleotydowej dla danio pręgowanego.

Abstract

Technologia mikromacierzy genowych umożliwia pomiary ilościowe i profilowanie ekspresji genów poziomów transkryptów w całym genomie. Technologia mikromacierzy genowych jest wykorzystywana w wielu dyscyplinach biologicznych w różnych zastosowaniach, w tym w globalnej analizie ekspresji genów w odniesieniu do etapu rozwojowego, stanu chorobowego i odpowiedzi toksycznych. W niniejszym artykule zamieszczamy demonstrację globalnej analizy ekspresji genów przy użyciu kompleksowej platformy mikromacierzy oligonukleotydowych specyficznej dla danio pręgowanego. Platforma mikromacierzy do ekspresji danio pręgowanego zawiera 385 000 sond o długości 60 par zasad, które badają 37 157 celów z maksymalnie 12 sondami na cel. W przypadku tej platformy wszystkie informacje cDNA i genomiczne dostępne dla danio pręgowanego zostały zebrane z różnych genomowych baz danych, w tym Ensembl (http://www.ensembl.org), VEGA (http://vega.sanger.ac.uk), UCSC (http://genome.ucsc.edu) i ZFIN (http://www.zfin.org). W rezultacie ta tablica wyrażeń zapewnia pełne pokrycie bieżącego transkryptomu danio pręgowanego. Mikromacierz ekspresji danio pręgowanego została wydrukowana przez Roche NimbleGen (Madison, WI). Ta demonstracja techniczna obejmuje znakowanie fluorescencyjne produktu cDNA, hybrydyzację znakowanego produktu cDNA z platformą mikromacierzy oraz skanowanie macierzy w celu uzyskania sygnału przy użyciu strategii analizy jednego koloru.

Protocol

Część 1: Fluorescencyjne znakowanie cDNA

Barwnik Cy3 użyty w eksperymencie z mikromatrycą jest wrażliwy na fotodegradację. Zabieg powinien odbywać się w minimalnej ilości światła. Protokół znakowania został zaadaptowany z Podręcznika¹ BioPrime Array CGH Genomic Labeling System.

1. Odczynniki do reakcji znakowania są przechowywane w temperaturze -20°C. Z BioPrime Array CGH Genomic Labeling System rozmrozić 2,5-krotny bufor starterów, 10-krotną mieszankę dCTP i wodę wolną od nukleaz. Rozmrozić również barwnik Cy3-dCTP. Po rozmrożeniu krótko odwiruj wszystkie odczynniki przed użyciem.
2. Dla każdej próbki cDNA, która ma być analizowana, należy przeprowadzić oddzielną reakcję znakowania. Do grubościennej probówki o pojemności 0,6 ml dodaj 500 ng cDNA, 40 μl 2,5X Random Primer Buffer i wodę wolną od nukleaz, aby uzyskać całkowitą objętość 86 μl.
3. Dobrze wymieszaj i krótko odwiruj. Inkubować reakcję przez 5 minut w temperaturze 100°C na termocyklerze.
4. Natychmiast przenieść reakcję do zawiesiny łaźni lodowej na 10 minut.
5. Do każdej probówki dodaj 10 μl mieszanki 10X dCTP, 2 μl 1 mM Cy3-dCTP i 2 μl polimerazy DNA Exo Klenowa. Polimerazę DNA Exo Klenow należy pozostawić w zamrażarce do czasu jej użycia i zawsze przechowywać na lodzie.
6. Dobrze wymieszaj reakcję i krótko odwiruj.
7. Inkubować reakcję w temperaturze 37°C przez 16 godzin w termocyklerze.

Część 2: Wytrącanie znakowanego cDNA

1. Przed kontynuowaniem w protokole włącz system hybrydyzacji NimbleGen i pozwól systemowi zrównoważyć się do 42°C.
2. Dla każdej reakcji umieść kolumnę Microcon w probówce o pojemności 1,5 ml. Dodać 300 μl 0,1X SSC do każdej kolumny, a następnie zawartość reakcji znakowania (100 μl).
3. Odwirować probówkę zawierającą kolumnę o stężeniu 16,100 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
4. Odrzuć przepływ, który może mieć lekko różowy kolor, i dodaj kolejne 300 μl 0,1X SSC do kolumny.
5. Powtarzać wirowanie przy 16 100 x g przez 10 minut w temperaturze 4°C.
6. Odrzuć przepływ i dodaj dodatkowe 300 μl 0,1X SSC do kolumny.
7. Wirować przy 16 100 x g przez 12 minut w temperaturze 4°C.
8. Odrzuć przepływ. Przepływ powinien być czysty po tym ostatnim myciu i powinieneś być w stanie zobaczyć różowo oznaczone cDNA na kolumnie.
9. Nanieść 100 μl wody wolnej od nukleaz do kolumny. Wyjąć kolumnę z probówki o pojemności 1,5 ml i odwrócić kolumnę do nowej probówki o pojemności 1,5 ml.
10. Wirować przy 2 300 x g przez 2 minuty w temperaturze 4°C. Znakowane cDNA należy ponownie uwodnić w wodzie, która zbiera się na dnie probówki.
11. Użyj spektrofotometru NanoDrop ND-1000 zgodnie z instrukcjami producenta, aby obliczyć stężenie DNA i ocenić włączenie barwnika, obliczając stosunek zasady do barwnika, gdzie stosunek nukleotydu do Cy3 jest równy stosunkowi A₂₆₀/A₅₅₀ pomnożonemu przez 23,15. Stosunek bazy do barwnika powinien wynosić od 50 do 80.
12. Jeśli cDNA jest wystarczająco znakowane, podwielokrotność 6 μg znakowanego cDNA do nowej probówki o pojemności 1,5 ml.
13. Wymieszać z 0,1X objętością 3 M NaOAc, pH 5,2 i 1X objętością izopropanolu. Pozostaw mieszaninę do inkubacji w ciemności przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
14. Następnie odwirować próbkę o masie 16 100 x g przez 20 minut w temperaturze pokojowej.
15. Ostrożnie wyrzuć supernatant, nie naruszając osadu DNA, który powinien mieć różowy kolor.
16. Przepłucz etanolem, dodając 500 μl 70% EtOH i wymieszaj przez delikatną inwersję.
17. Odwirować próbkę o masie 16 100 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
18. Usuń supernatant, odwróć probówkę i pozostaw granulkę do wyschnięcia na 5 minut. Na tym etapie osad może być przechowywany w temperaturze -20°C, jeśli jest to pożądane, lub protokół może być kontynuowany do etapu hybrydyzacji.

Część 3: Hybrydyzacja

Procedura hybrydyzacji jest zaczerpnięta z Przewodnika Użytkownika Tablic Roche NimbleGen do analizy ekspresji genów².

1. Rozpuść osad w 5 μl wody wolnej od nukleaz.
2. Po rozpuszczeniu osadu dodać składniki hybrydyzacji wymienione w Tabeli 1. Komponenty hybrydyzacji pochodzą z zestawu do hybrydyzacji Roche NimbleGen. Po dodaniu wszystkich składników całkowita objętość powinna teraz wynosić 18 μl. Dobrze wymieszaj i krótko zakręć tubką, aby zebrać zawartość na dnie.
3. Następnym krokiem jest denaturacja znakowanego cDNA poprzez umieszczenie go na bloku grzewczym w temperaturze 95°C na 5 minut.
4. Natychmiast przenieś probówkę do systemu hybrydyzacji NimbleGen, podczas gdy macierze są przygotowywane w kolejnych krokach.
5. Z mikromacierzami należy zawsze obchodzić się ostrożnie i przechowywać je zgodnie z instrukcjami producenta. Roche NimbleGen zaleca przechowywanie ich matryc ekspresji w ciemności ze środkiem osuszającym w temperaturze pokojowej.
6. Załaduj macierz do narzędzia Precision Mixer Alignment Tool (PMAT) dostarczonego w akcesoriach do przetwarzania macierzy NimbleGen.
7. Załaduj mikser X1 na PMAT i usuń pasek samoprzylepny za pomocą kleszczyków. Bezpiecznie zamknij PMAT. Przyłóż nacisk do miksera przez otwór w PMAT i powoli otwórz, aby matryca i mikser odłączyły się od PMAT.
8. Mocno dociśnij za pomocą dyszy na zewnątrz mieszalnika, aby upewnić się, że uszczelnienie do matrycy jest kompletne i usunąć wszelkie pęcherzyki. Umieść kompleks mieszalnika matrycowego w systemie hybrydyzacji do ogrzania.
9. Za pomocą pipety wyporowej powoli dodaj 15 μl oznaczonej próbki do portu napełniania. Jest to otwór znajdujący się w środku miksera. Wywierać powolny i stały nacisk na pipetę, tak aby próbka równomiernie rozprowadziła się w mieszalniku bez pęcherzyków powietrza. Zetrzyj nadmiar próbki z otworów portów i uszczelnij otwory portów paskami samoprzylepnymi.
10. Zamknij zatrzask i rozpocznij mieszanie roztworu hybrydyzacyjnego za pomocą programu B w systemie hybrydyzacji NimbleGen. Pozwól mikromacierzom na hybrydyzację przez 16-20 godzin.

Część 4: Mycie i skanowanie mikromacierzy po hybrydyzacji

Procedura mycia i skanowania jest zaczerpnięta z Przewodnika Użytkownika Tablic Roche NimbleGen do analizy ekspresji genów².

1. Gdy hybrydyzacja jest bliska zakończenia, należy przygotować do płukania, jak opisano w Tabeli 2. Wstępnie podgrzany bufor myjący IA do 42°C w łaźni wodnej.
2. Włącz skaner z matrycą GenePix 4000B i pozwól skanerowi ogrzać się przez około 15 minut przed użyciem.
3. Wlej wstępnie podgrzany bufor do mycia IA do naczynia.
4. Wyjmij kompleks macierz-mikser z systemu hybrydyzacji NimbleGen i wsuń do przyrządu (dostarczanego w akcesoriach do przetwarzania macierzy NimbleGen). Zanurz zespół we wstępnie podgrzanym buforze płuczącym IA i ostrożnie wyjmij mikser, odrywając go od szkiełka.
5. Wyjmij tablicę z przyrządu i mieszaj przez 15 sekund w buforze myjącym IA.
6. Szybko przenieś matrycę do stojaka na szkiełka w temperaturze pokojowej Bufor do mycia IB. Energicznie mieszaj ruszt do szkiełek przez 2 minuty.
7. Przenieś ruszt szkiełkowy do buforu myjącego II i mieszaj przez 1 minutę.
8. Przenieś ruszt szkiełkowy do bufora myjącego III i mieszaj przez 15 sekund.
9. Przenieś matrycę do wirówki do suszenia szkiełek i wiruj przez 2 minuty, aby usunąć całą wilgoć. Przejdź do skanowania.
10. Zaleca się natychmiastowe zeskanowanie matrycy, ponieważ barwnik jest wrażliwy zarówno na światło, jak i ozon.
11. Załaduj macierz kodem kreskowym w dół do skanera macierzy GenePix 4000B.
12. Otwórz oprogramowanie GenePix Pro i przystąp do skanowania macierzy. Macierze ekspresji genów Roche NimbleGen wykorzystują strategię hybrydyzacji w jednym kolorze. W związku z tym do skanowania wymagana jest tylko jedna długość fali. Zeskanuj sygnał fluorescencji Cy3 za pomocą lasera 532 nm. Otwórz okno dialogowe ustawień sprzętowych i ustaw wartość PMT lasera 532 nm na wartość 500.
13. W oknie dialogowym ustawień sprzętowych ustaw moc na 100%, rozmiar piksela na 5 mikronów, linie na średnią na 1 i pozycję ostrości na 0 mikronów.
14. Wykonaj skanowanie podglądu i ustaw obszar skanowania.
15. Wykonaj skanowanie.
16. Po zakończeniu skanowania sprawdź histogram obrazu. Idealnie, znormalizowane liczby 1e-5 powinny znajdować się na poziomie limitu nasycenia 65 000, co oznacza, że ~1-2% funkcji jest nasyconych. Jeśli znormalizowane liczby są mniejsze niż 1e-5, zwiększ wzmocnienie PMT i ponownie zeskanuj slajd. Jeśli znormalizowane liczby są większe niż 1e-5, zmniejsz wzmocnienie PMT i ponownie zeskanuj slajd.
17. Po zakończeniu skanowania zapisz obraz. Zaleca się wybranie standardowej konwencji nazewnictwa obrazów, aby ułatwić odniesienie. Obraz można teraz załadować do preferowanego programu do analizy danych w celu normalizacji danych i obliczenia wartości intensywności.

Reprezentatywne wyniki

Możesz najpierw zacząć oceniać skuteczność reakcji znakowania fluorescencji Cy3 cDNA, rozpoczynając płukanie od 0,1X SSC. Podczas każdego kolejnego prania przepływ powinien stać się mniej różowy, a ostatni przepływ powinien być przezroczysty. Ponadto produkt cDNA znakowany Cy3 powinien być widoczny na kolumnie podczas tych etapów mycia. Jeśli przepływ ma jasnoróżowy kolor lub na kolumnie nie ma różowego produktu, jest to dobra wskazówka, że reakcja etykietowania nie przebiegała prawidłowo. Reakcję znakowania można ocenić ilościowo za pomocą spektrofotometru NanoDrop ND-1000 w celu określenia stężenia znakowanego DNA i stosunku zasady do barwnika (ryc. 1). W wyniku reakcji znakowania rutynowo uzyskuje się co najmniej 10 μg znakowanego DNA w naszym laboratorium. Włączenie barwnika można obliczyć za pomocą prostego stosunku zasady do barwnika, gdzie stosunek nukleotydu do Cy3 jest równy stosunkowi A₂₆₀/A₅₅₀ pomnożonemu przez 23,15. Wartości w zakresie 50-80 wskazują na wystarczające włączenie barwnika w reakcji znakowania. Jeśli reakcja znakowania daje niskie stężenie DNA lub słabe włączenie barwnika, hybrydyzacja próbki na mikromacierzy nie jest zalecana i należy powtórzyć reakcję znakowania.

Ocena jakości hybrydyzacji może być przeprowadzona poprzez ocenę histogramu obrazu i zeskanowanego obrazu mikromacierzy (Rysunek 2). Dopuszczalne hybrydyzacje będą miały nasycone 1-2% cech (tj. Dając znormalizowane liczby 1e-5 przy limicie nasycenia 65 000) z wartością PMT ustawioną w pobliżu 500. Jeśli wartość PMT musi zostać drastycznie skorygowana z 500, aby osiągnąć znormalizowane liczby 1e-5 przy limicie nasycenia 65 000, na ogół wskazuje to na słabą hybrydyzację znakowanego cDNA do mikromacierzy. Jakość danych będzie się zależała, jeśli dane te będą kontynuowane w dalszej analizie. Jakość hybrydyzacji można również ocenić jakościowo, przeglądając obrazy zeskanowanej matrycy (rysunek 3). Zestaw do hybrydyzacji Roche NimbleGen zawiera oligonukleotydów wyrównujących 48-merowe znakowane Cy3 i Cy5, które hybrydyzują z cechami wyrównania na tablicach. Jakościowa ocena intensywności oligonukleotydów wyrównania do innych cech macierzy pozwala na kontrolę jakości skuteczności hybrydyzacji znakowanego fluorescencyjnie cDNA na matrycy. Po dalszej analizie można użyć wykresu punktowego analizowanych danych do określenia względnych poziomów ekspresji genów i zidentyfikowania genów, które są różnie wyrażane między próbkami (Rysunek 4).

Rysunek 1. Widmo NanoDrop z cDNA znakowane Cy3. Znakowaną wydajność cDNA i włączenie barwnika można ocenić za pomocą spektrofotometru NanoDrop ND-1000. Proszę kliknij tutaj aby zobaczyć większą wersję rysunku 1.

Rysunek 2. Histogram GenePix do skanowania mikromacierzy. Jakość hybrydyzacji można ocenić, oceniając histogram obrazu. Dopuszczalne hybrydyzacje będą miały 1-2% cech nasyconych znormalizowanymi liczbami 1e-5 przy limicie nasycenia 65 000 z wartością PMT ustawioną w pobliżu 500. Proszę kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję rysunku 2.

Rysunek 3. Zeskanowany obraz mikromacierzy. Jakość hybrydyzacji można ocenić, przeglądając zeskanowany obraz mikromacierzy. Obraz powinien być zbadany pod kątem obecności kurzu lub innych czynników zakłócających uniemożliwiających wizualizację każdej cechy, a tym samym uniemożliwiających dokładne obliczenie intensywności fluorescencji cechy. Intensywność oligonukleotydów wyrównania można porównać z innymi cechami macierzy w celu oceny wydajności hybrydyzacji.

Rysunek 4. Wykres punktowy analizowanego eksperymentu z mikromacierzą. Celem tej procedury jest identyfikacja genów, które ulegają zróżnicowanej ekspresji w próbkach. Dane z mikromacierzy mogą być dalej analizowane i przeglądane na wykresie punktowym w celu wizualizacji genów, które są wyrażane w różny sposób.

Tabela 1. Składniki z zestawu do hybrydyzacji Roche NimbleGen do dodania do hybrydyzacji krok 2.

składnik głośność Próbka (rozpuszczona w wodzie) 5 μl 2X Bufor hybrydyzacyjny 9 μl Hyb A 3,6 μl Wyrównanie Oligo 0,4 μl Całkowita objętość 18 μl

Tabela 2. Przemywać, które należy przygotować do mycia tablic po hybrydyzacji.

składnik Bufor do płukania IA* Bufor do płukania IB Bufor do płukania II Bufor do płukania III Woda Pojemność 225 ml Pojemność 225 ml Pojemność 225 ml Pojemność 225 ml 10X Bufor do płukania I, II lub III Pojemność 25 ml Pojemność 25 ml Pojemność 25 ml Pojemność 25 ml 1 m naziemna telewizja cyfrowa 25 μl 25 μl 25 μl 25 μl Całkowita objętość Pojemność 250 ml Pojemność 250 ml Pojemność 250 ml Pojemność 250 ml

*Wstępnie podgrzany do 42°C

Discussion

Wiele protokołów mikromacierzy, w tym ten opisany tutaj, wykorzystuje barwniki fluorescencyjne jako sposób pomiaru i ilościowego określania hybrydyzacji. Barwnik fluorescencyjny Cy3 jest wrażliwy na degradację foto i ozonu. Zaleca się, aby zabieg przeprowadzać przy minimalnym oświetleniu. Ponadto małe cząsteczki kurzu mogą zakłócać hybrydyzację i skanowanie. Szczególną uwagę należy zwrócić na to, aby miejsce pracy było czyste i wolne od kurzu.

Istnieje wiele alternatyw dla protokołu etykietow...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Suszarka do mikrowirówek Array	ISC Bioexpress	C-1303-T
BioPrime Array CGH System znakowania genomu	Invitrogen	18095-011
Cyjanina 3-dCTP	PerkinElmer, Inc.	NEL576
GenePix 4000B	Urządzenia molekularne	GENEPIX 4000B
Microcon YM-30	EMD Millipore	42411
Akcesoria do przetwarzania macierzy NimbleGen	Grupa Roche 5223539001
Zestaw do hybrydyzacji NimbleGen	Grupa Roche 5223474001
System hybrydyzacji NimbleGen 4	Grupa Roche
Zestaw myjących NimbleGen	Grupa Roche 5223504001
Mieszalniki X1	Grupa Roche 5223725001