Analiza globalnej ekspresji genów z wykorzystaniem platformy mikromacierzy oligonukleotydowych dla ryby danio-ostrobramkowej

Podsumowanie

Mikromacierze genów są potężnymi narzędziami w profilowaniu ekspresji genów na poziomie całego genomu. Technologia ta znajduje zastosowanie w wielu dyscyplinach biologicznych, w tym w biologii rozwoju i toksykologii. W tym filmie szczegółowo opisujemy protokół globalnej analizy ekspresji genów z wykorzystaniem kompleksowej platformy mikromacierzy oligonukleotydowych dla danio pręgowanego.

Streszczenie

Technologia mikromacierzy genowych umożliwia ilościowy pomiar i profilowanie ekspresji genów na poziomie poziomów transkrypcji w skali całego genomu. Technologia mikromacierzy genowych jest wykorzystywana w licznych dyscyplinach biologicznych w różnorodnych zastosowaniach, w tym w globalnej analizie ekspresji genów w odniesieniu do etapu rozwoju, stanu chorobowego oraz odpowiedzi toksycznej. W niniejszym materiale przedstawiamy demonstrację globalnej analizy ekspresji genów z wykorzystaniem kompleksowej platformy mikromacierzy oligonukleotydowych specyficznych dla danio pręgowanego. Platforma mikromacierzy ekspresyjnych dla danio pręgowanego zawiera 385 000 sond o długości 60 par zasad, badających 37 157 celów, z maksymalnie 12 sondami na jeden cel. Dla tej platformy wszystkie dostępne informacje o cDNA i genomie danio pręgowanego zostały zebrane z różnych baz danych genomowych, w tym Ensembl (http://www.ensembl.org), VEGA (http://vega.sanger.ac.uk), UCSC (http://genome.ucsc.edu) oraz ZFIN (http://www.zfin.org). W rezultacie macierz ekspresyjna ta zapewnia pełne pokrycie aktualnego transkryptomu danio pręgowanego. Mikromacierz ekspresyjna dla danio pręgowanego została wydrukowana przez firmę Roche NimbleGen (Madison, WI). Ta demonstracja techniczna obejmuje fluorescencyjne znakowanie produktu cDNA, hybrydyzację znakowanego produktu cDNA z platformą mikromacierzy oraz skanowanie macierzy w celu pozyskania sygnału przy zastosowaniu strategii analizy jednobarwnej.

Protokół

Część 1: Znakowanie fluorescencyjne cDNA

Barwnik Cy3 użyty w eksperymencie z mikromacierzą jest wrażliwy na fotodegradację. Procedurę należy przeprowadzać przy minimalnym oświetleniu. Protokół znakowania został opracowany na podstawie instrukcji BioPrime Array CGH Genomic Labeling System Manual¹.

1. Odczynniki do reakcji znakowania przechowuje się w temperaturze -20°C. Z zestawu BioPrime Array CGH Genomic Labeling System rozmrozić 2,5X Random Primer Buffer, 10X dCTP mix oraz wodę wolną od nukleaz. Rozmrozić również barwnik Cy3-dCTP. Po rozmrożeniu krótko odwirować wszystkie odczynniki przed użyciem.
2. Dla każdej analizowanej próbki cDNA należy przeprowadzić oddzielną reakcję znakowania. Do probówki o grubych ściankach o pojemności 0,6 ml dodać 500 ng cDNA, 40 μl 2,5X Random Primer Buffer oraz wodę wolną od nukleaz, aby uzyskać całkowitą objętość 86 μl.
3. Dokładnie wymieszać i krótko odwirować. Inkubować reakcję przez 5 minut w temperaturze 100°C w termocyklerze.
4. Bezzwłocznie przenieść reakcję do kąpieli lodowej na 10 minut.
5. Do każdej probówki dodać następnie 10 μl 10X dCTP mix, 2 μl 1 mM Cy3-dCTP oraz 2 μl polimerazy DNA Exo Klenow. Polimerazę DNA Exo Klenow należy przechowywać w zamrażarce do momentu użycia i zawsze trzymać w lodzie.
6. Dokładnie wymieszać reakcję i krótko odwirować.
7. Inkubować reakcję w temperaturze 37°C przez 16 godzin w termocyklerze.

Część 2: Wytrącanie znakowanego cDNA

1. Przed kontynuacją protokołu należy włączyć system hybrydyzacji NimbleGen i pozwolić systemowi ustabilizować temperaturę do 42°C.
2. Dla każdej reakcji należy umieścić kolumnę Microcon w probówce 1,5 ml. Do każdej kolumny należy dodać 300 μl 0,1X SSC, a następnie zawartość reakcji znakowania (100 μl).
3. Probówkę z kolumną należy wirować przy 16 100 x g przez 10 minut w temperaturze 4°C.
4. Należy odlać filtrat, który może mieć lekko różowy kolor, i dodać do kolumny kolejne 300 μl 0,1X SSC.
5. Należy powtórzyć wirowanie przy 16 100 x g przez 10 minut w temperaturze 4°C.
6. Należy odlać filtrat i dodać do kolumny dodatkowe 300 μl 0,1X SSC.
7. Należy wirować przy 16 100 x g przez 12 minut w temperaturze 4°C.
8. Należy odlać filtrat. Po tym ostatnim przemyciu filtrat powinien być przejrzysty, a na kolumnie powinno być widoczne różowe, znakowane cDNA.
9. Na kolumnę należy nanieść 100 μl wody wolnej od nukleaz. Należy wyjąć kolumnę z probówki 1,5 ml i odwrócić ją do nowej probówki 1,5 ml.
10. Należy wirować przy 2 300 x g przez 2 minuty w temperaturze 4°C. Znakowane cDNA powinno zostać rehydratowane w wodzie zbierającej się na dnie probówki.
11. Przy użyciu spektrofotometru NanoDrop ND-1000, zgodnie z instrukcją producenta, należy obliczyć stężenie DNA i ocenić wbudowanie barwnika poprzez obliczenie stosunku zasad do barwnika, gdzie stosunek nukleotydów do Cy3 jest równy stosunkowi A₂₆₀/A₅₅₀ pomnożonemu przez 23,15. Stosunek zasad do barwnika powinien mieścić się w przedziale od 50 do 80.
12. Jeśli cDNA zostało wystarczająco znakowane, należy odmierzyć 6 μg znakowanego cDNA do nowej probówki 1,5 ml.
13. Należy dodać 0,1X objętości 3 M NaOAc, pH 5,2 oraz 1X objętości izopropanolu. Mieszaninę należy inkubować w ciemności przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
14. Następnie próbkę należy wirować przy 16 100 x g przez 20 minut w temperaturze pokojowej.
15. Należy ostrożnie odlać nadsącz, nie naruszając osadu DNA, który powinien mieć różowy kolor.
16. Należy przeprowadzić przemywanie etanolem, dodając 500 μl 70% EtOH i mieszając poprzez delikatne odwracanie probówki.
17. Próbkę należy wirować przy 16 100 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
18. Należy usunąć nadsącz, odwrócić probówkę i pozwolić osadowi wyschnąć przez 5 minut. Na tym etapie osad można przechowywać w temperaturze -20°C, jeśli jest to pożądane, lub kontynuować protokół, przechodząc do etapu hybrydyzacji.

Część 3: Hybrydyzacja

Procedura hybrydyzacji została opracowana na podstawie podręcznika użytkownika Roche NimbleGen Arrays User's Guide for Gene Expression Analysis².

1. Rozpuścić osad w 5 μl wody wolnej od nukleaz.
2. Po rozpuszczeniu osadu dodać komponenty do hybrydyzacji wymienione w Tabeli 1. Komponenty do hybrydyzacji pochodzą z zestawu Roche NimbleGen Hybridization Kit. Po dodaniu wszystkich składników całkowita objętość powinna wynosić 18 μl. Dokładnie wymieszać i krótko odwirować probówkę, aby zebrać zawartość na dnie.
3. Kolejnym krokiem jest denaturacja znakowanego cDNA poprzez umieszczenie go w bloku grzewczym w temperaturze 95°C przez 5 minut.
4. Niezwłocznie przenieść probówkę do systemu hybrydyzacyjnego NimbleGen Hybridization System, podczas gdy w kolejnych krokach przygotowywane są macierze.
5. Macierze mikroarray należy zawsze obsługiwać ostrożnie i przechowywać zgodnie z instrukcjami producenta. Firma Roche NimbleGen zaleca przechowywanie macierzy ekspresyjnych w ciemności, z pochłaniaczem wilgoci, w temperaturze pokojowej.
6. Włożyć macierz do narzędzia wyrównawczego Precision Mixer Alignment Tool (PMAT), dostarczonego w akcesoriach do przetwarzania macierzy NimbleGen.
7. Załadować mieszalnik X1 do PMAT i usunąć pasek klejący za pomocą pęsety. Szczelnie zamknąć PMAT. Nacisnąć mieszalnik przez otwór w PMAT i powoli otworzyć, aby macierz i mieszalnik odłączyły się od PMAT.
8. Mocno docisnąć walcem (brayerem) zewnętrzną krawędź mieszalnika, aby zapewnić całkowite uszczelnienie z macierzą i usunąć wszelkie pęcherzyki powietrza. Umieścić kompleks macierz-mieszalnik w systemie hybrydyzacyjnym w celu ogrzania.
9. Używając pipety wyporowej, powoli dodać 15 μl znakowanej próbki do otworu wlewowego. Jest to otwór znajdujący się w centrum mieszalnika. Wywierać powolny i stały nacisk na pipetę, aby próbka rozprzestrzeniła się równomiernie w mieszalniku bez pęcherzyków powietrza. Wytrzeć nadmiar próbki z otworów wlewowych i zakleić je paskami klejącymi.
10. Zamknąć zatrzask i rozpocząć mieszanie roztworu do hybrydyzacji, korzystając z programu B w systemie NimbleGen Hybridization System. Pozostawić macierze do hybrydyzacji na 16-20 godzin.

Część 4: Płukania po hybrydyzacji i skanowanie mikroarray

Procedura płukania i skanowania została dostosowana na podstawie podręcznika użytkownika Roche NimbleGen Arrays w zakresie analizy ekspresji genów².

1. Gdy hybrydyzacja dobiega końca, przygotować bufory do płukania zgodnie z opisem w Tabeli 2. Podgrzać Bufor do Płukania IA do 42°C w łaźni wodnej.
2. Włączyć skaner macierzy GenePix 4000B i pozwolić mu się rozgrzać przez około 15 minut przed użyciem.
3. Nalać podgrzany Bufor do Płukania IA do naczynia.
4. Wyjąć kompleks mieszacz-macierz z systemu hybrydyzacji NimbleGen i wsunąć go do uchwytu (dołączonego do akcesoriów do przetwarzania macierzy NimbleGen). Zanurzyć zespół w podgrzanym Buforze do Płukania IA i ostrożnie usunąć mieszacz, odklejając go od płytki.
5. Wyjąć macierz z uchwytu i mieszać przez 15 sekund w Buforze do Płukania IA.
6. Szybko przenieść macierz do statywu na płytki z Buforem do Płukania IB o temperaturze pokojowej. Energicznie wstrząsać statywem przez 2 minuty.
7. Przenieść statyw do Buforu do Płukania II i mieszać przez 1 minutę.
8. Przenieść statyw do Buforu do Płukania III i mieszać przez 15 sekund.
9. Przenieść macierz do wirówki do suszenia płytek i wirować przez 2 minuty w celu usunięcia całej wilgoci. Przejść do skanowania.
10. Zaleca się natychmiastowe skanowanie macierzy, ponieważ barwnik jest wrażliwy na światło i ozon.
11. Włożyć macierz, kodem kreskowym do dołu, do skanera macierzy GenePix 4000B.
12. Otworzyć oprogramowanie GenePix Pro i przystąpić do skanowania macierzy. Macierze ekspresji genów Roche NimbleGen wykorzystują strategię hybrydyzacji jednobarwnej. W związku z tym do skanowania wymagana jest tylko jedna długość fali. Skanować sygnał fluorescencji Cy3 za pomocą lasera 532 nm. Otworzyć okno dialogowe ustawień sprzętu i ustawić wartość PMT dla lasera 532 nm na 500.
13. W oknie dialogowym ustawień sprzętu ustawić moc na 100%, rozmiar piksela na 5 mikronów, liczbę linii do uśrednienia na 1 oraz pozycję ostrzenia na 0 mikronów.
14. Wykonać skanowanie podglądowe i ustawić obszar skanowania.
15. Wykonać skanowanie.
16. Po zakończeniu skanowania sprawdzić histogram obrazu. Idealnie 1e-5 znormalizowanych zliczeń powinno znajdować się na granicy nasycenia 65 000, co oznacza, że ~1-2% cech jest nasyconych. Jeśli znormalizowane zliczenia są mniejsze niż 1e-5, zwiększyć wzmocnienie PMT i ponownie zeskanować płytkę. Jeśli znormalizowane zliczenia są większe niż 1e-5, zmniejszyć wzmocnienie PMT i ponownie zeskanować płytkę.
17. Po zakończeniu skanowania zapisać obraz. Zaleca się stosowanie standardowej konwencji nazewnictwa obrazów dla łatwiejszego odwołania. Obraz można teraz wczytać do preferowanego programu do analizy danych w celu normalizacji danych i obliczenia wartości intensywności.

Reprezentatywne wyniki

Ocena wydajności reakcji znakowania cDNA fluorescencyjnym barwnikiem Cy3 może rozpocząć się podczas pierwszych przemyć roztworem 0,1X SSC. Podczas każdego kolejnego przemycia przelew powinien stawać się mniej różowy, aż do uzyskania całkowicie bezbarwnego przelewu w ostatnim etapie. Ponadto, w trakcie tych kroków przemywania, produkt znakowany Cy3 powinien być widoczny na kolumnie. Jeśli przelew ma intensywny różowy kolor lub na kolumnie nie widać różowego produktu, jest to wyraźny sygnał, że reakcja znakowania nie przebiegła prawidłowo. Reakcję znakowania można ocenić ilościowo za pomocą spektrofotometru NanoDrop ND-1000, aby określić stężenie znakowanego DNA oraz stosunek zasad do barwnika (Rysunek 1). W naszym laboratorium reakcja znakowania rutynowo pozwala uzyskać co najmniej 10 μg znakowanego DNA. Stopień wbudowania barwnika można obliczyć, stosując prosty stosunek bazy/barwnika, gdzie stosunek nukleotydów do Cy3 jest równy stosunkowi A₂₆₀/A₅₅₀ pomnożonemu przez 23,15. Wartości w zakresie 50-80 wskazują na wystarczające wbudowanie barwnika w reakcji znakowania. Jeśli reakcja znakowania daje niskie stężenie DNA lub słabe wbudowanie barwnika, nie zaleca się hybrydyzacji próbki z mikromacierzą i należy powtórzyć reakcję znakowania.

Ocenę jakości hybrydyzacji można przeprowadzić poprzez analizę histogramu obrazu oraz zeskanowanego obrazu mikromacierzy (Rysunek 2). W przypadku akceptowalnych hybrydyzacji 1-2% cech będzie nasyconych (tj. uzyskają 1e-5 znormalizowanych zliczeń przy granicy nasycenia 65 000) przy wartości PMT ustawionej w pobliżu 500. Jeśli wartość PMT musi zostać drastycznie skorygowana z 500, aby uzyskać 1e-5 znormalizowanych zliczeń przy granicy nasycenia 65 000, zazwyczaj wskazuje to na słabą hybrydyzację znakowanego cDNA z mikromacierzą. Dalsza analiza takich danych doprowadzi do pogorszenia jakości wyników. Jakość hybrydyzacji można również ocenić jakościowo, przeglądając obrazy zeskanowanej macierzy (Rysunek 3). Zestaw Roche NimbleGen Hybridization Kit zawiera mieszaninę oligonukleotydów do wyrównania, składającą się z 48-merów znakowanych Cy3 i Cy5, które hybrydyzują z cechami wyrównania na macierzach. Jakościowa ocena intensywności oligonukleotydów do wyrównania w stosunku do innych cech na macierzy pozwala na sprawdzenie efektywności hybrydyzacji fluorescencyjnie znakowanego cDNA na macierzy. Po przeprowadzeniu dalszej analizy można wykorzystać wykres rozrzutu analizowanych danych, aby określić względne poziomy ekspresji genów oraz zidentyfikować geny o różnej ekspresji między badanymi próbkami (Rysunek 4).

Rycina 1. Widmo NanoDrop dla cDNA znakowanego Cy3. Wydajność znakowania cDNA oraz stopień wbudowania barwnika można ocenić za pomocą spektrofotometru NanoDrop ND-1000. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję ryciny 1.

Rycina 2. Histogram GenePix dla skanu mikromacierzy. Jakość hybrydyzacji można ocenić poprzez analizę histogramu obrazu. W przypadku akceptowalnych hybrydyzacji 1-2% cech będzie nasyconych przy 1e-5 znormalizowanych zliczeń dla granicy nasycenia 65 000, przy wartości PMT ustawionej w pobliżu 500. Prosimy kliknąć tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję ryciny 2.

Rysunek 3. Skan obrazu mikromacierzy. Jakość hybrydyzacji można ocenić, analizując zeskanowany obraz mikromacierzy. Obraz należy zbadać pod kątem obecności kurzu lub innych czynników zakłócających, które uniemożliwiają wizualizację każdego punktu, a tym samym zapobiegają dokładnemu obliczeniu intensywności fluorescencji danego punktu. Intensywność oligosów wyrównawczych można porównać z innymi punktami na macierzy w celu oceny wydajności hybrydyzacji.

Rysunek 4. Wykres rozrzutu przeanalizowanego eksperymentu z mikroarrayami.Celem tej procedury jest zidentyfikowanie genów o różnym poziomie ekspresji w próbkach. Dane z mikroarrayów można poddać dalszej analizie i przedstawić na wykresie rozrzutu w celu wizualizacji genów o różnej ekspresji.

Tabela 1. Składniki z zestawu Roche NimbleGen Hybridization Kit do dodania w kroku 2 hybrydyzacji.

Składnik	Objętość
Próbka (rozpuszczona w wodzie)	5 μl
2X Bufor do hybrydyzacji	9 μl
Hyb A	3.6 μl
Oligonukleotyd do wyrównania	0.4 μl
Objętość całkowita	18 μl

Tabela 2. Bufory do płukania, które należy przygotować do mycia macierzy po hybrydyzacji.

Składnik	Bufor płuczący IA*	Bufor płuczący IB	Bufor płuczący II	Bufor płuczący III
Woda	225 ml	225 ml	225 ml	225 ml
10X Bufor płuczący I, II lub III	25 ml	25 ml	25 ml	25 ml
1 M DTT	25 μl	25 μl	25 μl	25 μl
Objętość całkowita	250 ml	250 ml	250 ml	250 ml

*Podgrzać wstępnie do 42°C

Dyskusja

Wiele protokołów mikromacierzy, w tym ten opisany tutaj, wykorzystuje barwniki fluorescencyjne jako sposób pomiaru i kwantyfikacji hybrydyzacji. Barwnik fluorescencyjny Cy3 jest wrażliwy na degradację pod wpływem światła i ozonu. Zaleca się przeprowadzanie procedury przy minimalnym oświetleniu. Ponadto drobne cząsteczki kurzu mogą zakłócać proces hybrydyzacji i skanowania. Należy zwrócić szczególną uwagę na to, aby obszar roboczy był czysty i wolny od kurzu.

Istnieje wiele alternatyw dla prot...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Suszarka do mikrocentryfug do macierzy	ISC Bioexpress	C-1303-T
System znakowania genomowego BioPrime Array CGH	Invitrogen	18095-011
Cyanine 3-dCTP	PerkinElmer, Inc.	NEL576
GenePix 4000B	Molecular Devices	GENEPIX 4000B
Microcon YM-30	EMD Millipore	42411
Akcesoria do przetwarzania macierzy NimbleGen	Roche Group	5223539001
Zestaw do hybrydyzacji NimbleGen	Roche Group	5223474001
System hybrydyzacji NimbleGen Hybridization System 4	Roche Group	5223652001
Zestaw buforów do płukania NimbleGen	Roche Group	5223504001
Mieszalniki X1	Roche Group	5223725001