Metoda pomiaru kinetyki fuzji wirusowej na poziomie pojedynczych cząsteczek

Podsumowanie

Przedstawiamy dwukolorowy test fluorescencyjny in vitro, służący do wizualizacji fuzji pojedynczych cząsteczek wirusa z płynną dwuwarstwą docelową. Poprzez znakowanie cząsteczek wirusowych fluoroforami, które różnicowo barwią błonę wirusa oraz jego wnętrze, jesteśmy w stanie monitorować kinetykę hemifuzji i tworzenia się porów.

Streszczenie

Fuzja błon jest kluczowym etapem podczas wnikania wirusów otoczkowych do komórek. Konwencjonalne testy fuzji zazwyczaj raportują dużą liczbę zdarzeń fuzji, co utrudnia ilościową analizę sekwencji zaangażowanych w ten proces kroków molekularnych. Opracowaliśmy dwukolorowy test fluorescencyjny in vitro do monitorowania kinetyki fuzji pojedynczych cząsteczek wirusa z docelową dwuwarstwą na podłożu o charakterze płynnym.

Cząsteczki wirusa grypy inkubuje się z zielonym lipofilnym fluoroforem w celu zabarwienia błony oraz z czerwonym hydrofilnym fluoroforem w celu zabarwienia wnętrza wirusa. Na funkcjonalizowanem dekstranem szklanym podłożu komory przepływowej osadzamy lipidową dwuwarstwę zawierającą gangliozydy, inkubujemy cząsteczki wirusa na płaskiej dwuwarstwie, a następnie rejestrujemy za pomocą kamery CCD fluorescencję obszaru o wymiarach 100 x 100 μm², zawierającego kilkaset cząsteczek. Dzięki obrazowaniu fluorescencji czerwonej i zielonej możemy jednocześnie monitorować zachowanie barwnika błonowego (zielonego) oraz zawartości wodnej (czerwonej) cząsteczek.

Po obniżeniu pH do wartości poniżej pH fuzji, cząsteczki połączą się z błoną. Hemifuzja, czyli zlewanie się zewnętrznej warstwy błony wirusowej z zewnętrzną warstwą błony docelowej, będzie widoczna jako nagła zmiana zielonej fluorescencji cząsteczki. Następnie, w wyniku fuzji dwóch pozostałych, oddalonych od siebie warstw, utworzy się por, a emitujący czerwone światło fluorofor w cząsteczce wirusa zostanie uwolniony pod błonę docelową. Zjawisko to spowoduje spadek czerwonej fluorescencji poszczególnych cząsteczek. Na koniec, zintegrowana fluorescencja fluoroforu wrażliwego na pH, wbudowanego w błonę docelową, pozwoli określić dokładny moment spadku pH.

Z trzech śladów fluorescencji w funkcji czasu można teraz w prosty sposób wyodrębnić wszystkie istotne zdarzenia (spadek pH, mieszanie lipidów podczas hemifuzji, mieszanie zawartości po utworzeniu poru) dla każdej cząstki z osobna. Poprzez zestawienie czasów trwania poszczególnych przejść dla wielu pojedynczych cząstek w histogramach, możemy określić czasy życia odpowiadających im stanów pośrednich. Nawet ukryte stany pośrednie, które nie posiadają bezpośredniego mierzalnego parametru fluorescencyjnego, mogą zostać bezpośrednio zwizualizowane na podstawie tych histogramów.

Protokół

Funkcjonalizacja szklanych lamellek

Planarna dwuwarstwa użyta w teście fuzji jest wspierana na uwodnionym filmie z dekstranu. Dekstran pełni rolę dystansera między planarną dwuwarstwą a powierzchnią szkła. Zapobiega to przywieraniu komponentów błony do powierzchni szklanej oraz zapewnia przestrzeń, do której zawartość cząstki wirusa może przedostać się w momencie fuzji. Szklane szkiełka podstawowe są funkcjonalizowane poprzez traktowanie silanem epoksydowym, co pozwala na chemiczne związanie dekstranu ze szkłem (Elender, et al. 1996).

1. Umieścić szkiełka nakrywkowe o średnicy 25 mm w ceramicznym statywie do barwienia, a następnie włożyć statyw do słoika lub zlewki.
2. Napełnić naczynie 10% roztworem detergentu do szkła laboratoryjnego. Umieścić naczynie w myjce ultradźwiękowej na 30 minut.
3. Przepłukać naczynie i statyw ze szkiełkami wodą dejonizowaną, a następnie napełnić 1M wodorotlenkiem potasu. Ponownie umieścić naczynie w kąpieli ultradźwiękowej na kolejne 30 minut.
4. Powtórzyć tę procedurę czyszczenia, używając acetonu i etanolu.
5. Przepłukać szkiełka nakrywkowe wodą i osuszyć.
6. Na koniec oczyścić szkiełka nakrywkowe w urządzeniu do trawienia plazmą tlenową przez trzy minuty.
7. Ostatni etap czyszczenia utlenia powierzchnię, sprawiając, że szkło staje się jednorodnie hydrofilowe i reaktywne w kolejnych etapach silanizacji.
8. Przygotować 0,2% roztwór 3-glikydoksypropyltrimetoksysilanu w izopropanolu. Zanurzyć szkiełka nakrywkowe w tym roztworze na pięć minut.
9. Wylać roztwór silanu i kilkakrotnie przepłukać szkiełka nakrywkowe izopropanolem.
10. Szkiełka nakrywkowe są teraz pokryte warstwą silanu, jednak muszą zostać utwardzone, aby silan mógł utworzyć wiązania kowalencyjne ze szkłem. Umieścić szkiełka nakrywkowe w piekarniku ustawionym na 80 °C na jedną godzinę.
11. Podczas utwardzania szkiełek odważyć dekstran 500 i przygotować 30% (w/v) roztwór. Podgrzanie wody ułatwi rozpuszczanie. Na każde szkiełko zużyjemy około 1 ml tego roztworu. Po rozpuszczeniu dekstranu odgazować roztwór w eksykatorze próżniowym.
12. Po zakończeniu utwardzania silanizowanych szkiełek wyjąć je z ceramicznego statywu i ułożyć płasko wewnątrz plastikowego pudełka do zamrażarki. Za pomocą pipety 1 ml pokryć górną powierzchnię każdego szkiełka nakrywkowego ok. 1 ml roztworu dekstranu. Zamknąć pudełko i pozostawić w spokojnym miejscu na 24-36 godzin.
13. Trzymając szkiełka nakrywkowe plastikową pęsetą, odlać nadmiar dekstranu i umieścić je z powrotem w ceramicznym statywie. Kilkakrotnie przepłukać szkiełka nakrywkowe wodą, a następnie pozostawić je w wodzie do namoczenia na 48 godzin. Słoik można delikatnie mieszać na rotatorze stołowym.
14. Osuszyć szkiełka nakrywkowe w piekarniku ustawionym na 80 °C i przechowywać w eksykatorze próżniowym.

Przygotowanie liposomów

Wsparte dwuwarstwy lipidowe są tworzone poprzez adsorpcję liposomów do zfunkcjonalizowanego dekstranem szkiełka podstawowego. Zaadsorbowane liposomy łączą się ze sobą, aż do momentu pęknięcia błony i jej rozprzestrzenienia płasko po powierzchni.

1. Typowa formulacja liposomów stosowana w tym teście składa się z 1,2-dioleoil- sn- glicero-3-fosfocholin (DOPC), 1-oleoil-2-palmitoil- sn- glicero-3-fosfocholin (POPC), cholesterolu, bydlęcego disialogangliozydy mózgowego (GD_1a) oraz N-((6-(biotynoilo)amino)heksanoilo)-1,2-diheksadekanoil- sn- glicero-3-fosfoetanolaminy w stosunku 4:4:2:0,1:5x10^-5. Wszystkie składniki są przechowywane w roztworach chloroformu lub chloroformu i metanolu.
2. Przygotować mieszaninę zawierającą dwa mikromole lipidów, przenosząc odpowiednie objętości każdego składnika do szklanej probówki. Odparować rozpuszczalnik w strumieniu argonu lub azotu. Usunąć pozostały rozpuszczalnik, pozostawiając probówkę w deskryptorze próżniowym przez dwie godziny.
3. Resuspender wysuszony film lipidowy w 400 µL buforu HNE (5 mM HEPES, 145 mM NaCl, 0,1 mM EDTA).
4. Przenieść zawiesinę do plastikowej probówki do mikrocentryfugi. Zamrozić zawiesinę w kąpieli z ciekłym azotem, a następnie rozmrozić w ciepłej kąpieli wodnej. Powtórzyć ten cykl zamrażania i rozmrażania cztery razy.
5. Złożyć ekstruder lipidowy z filtrem membranowym z poliwęglanu o porach 100 nm i poddać zawiesinę lipidową ekstruzji 25 razy. Po ekstruzji zawiesina powinna stać się bardziej przezroczysta.
6. Liposomy należy wykorzystać w dniu ich przygotowania. Do momentu użycia mogą być przechowywane w temperaturze pokojowej.

Przygotowanie mikrofluidycznej celi przepływowej

Prostą mikrofluidyczną komorę przepływową wykonuje się poprzez umieszczenie dwustronnej taśmy klejącej pomiędzy szkiełkiem kwarcowym a funkcjonalizowanym szkiełkiem nakrywką.

1. Należy przygotować kwarcową płytkę o wymiarach 20x20x3 mm. Za pomocą diamentowego wiertła należy wywiercić dwa otwory o średnicy 1 mm po przeciwnych stronach.
2. Z arkusza dwustronnej taśmy klejącej należy wyciąć kwadrat o boku 20 mm, a następnie za pomocą żyletki wyciąć z jego środka sekcję o wymiarach 15 x 2 mm.
3. Należy odkleić papier zabezpieczający z jednej strony taśmy i przykleić ją do kwarcowej płytki. Drugą stronę należy przykleić do funkcjonalizowanej lamellki.
4. Należy odciąć dwa odcinki rurki polietylenowej o długości 20 cm i wprowadzić je do otworów w kwarcowej płytce.
5. Komorę przepływową należy uszczelnić 5-minutowym klejem epoksydowym.
6. Po utwardzeniu kleju należy napełnić komorę przepływową i rurki buforem.
7. Na tym etapie można utworzyć wspieraną dwuwarstwę lipidową, zaciągając około 80 µL zawiesiny liposomów do kanałów.

Znakowanie cząsteczek wirusa

1. Do testu fuzji zazwyczaj wykorzystuje się wirusa grypy A H3N2 (X-31), jednak pomyślnie stosowano również inne szczepy grypy oraz inne wirusy.
2. Wirus jest znakowany do dwóch różnych barwników fluorescencyjnych, co pozwala na detekcję hemifuzji i tworzenia się porów.
3. Rozpuścić sulforodaminę B (SRB) w buforze HNE w celu przygotowania roztworu 20 mM. Połączyć 20 µL roztworu barwnika z 10 µL zawiesiny wirusowej i pozostawić w temperaturze pokojowej na 20 godzin. W tym czasie barwnik będzie powoli gromadzić się wewnątrz cząsteczek wirusa.
4. Usunąć nadmiar barwnika, przepuszczając zawiesinę wirusową przez kolumnę odsalającą PD-10. Jeśli użyto wystarczającej ilości materiału wirusowego, w kolumnie widoczny będzie kolorowy prążek. Prążek ten zawiera znakowany wirus i może zostać zebrany podczas elucji.
5. W przypadku braku widocznego prążka, zbierać frakcje o objętości 200 µL i określić, które z nich zawierają znakowany wirus, mierząc absorbancję przy 565 nm na spektrofotometrze. Wirus powinien zostać eluowany w całkowitej objętości około 0,8 ml.
6. Zznakować otoczkę wirusa, dodając 13 µL roztworu oktadecylrodaminy 110 (Rh110C18) o stężeniu 2 mM w dimetylformamidzie (DMF) do zawiesiny wirusa znakowanego SRB.
7. Mieszać zawiesinę, mocując probówkę w rotatorze laboratoryjnym, i pozostawić na 3 godziny.
8. Oczyścić wirusa z nadmiaru Rh110C18, używając kolumny odsalającej PD-10 zgodnie z wcześniej opisaną procedurą.

Konfiguracja mikroskopu

Eksperyment jest przeprowadzany na mikroskopie fluorescencyjnym wyposażonym w obiektyw imersyjny olejowy o wysokiej aperturze numerycznej (NA), odpowiednim do mikroskopii fluorescencyjnej z całkowitym wewnętrznym odbiciem. Linie 488 i 568 nm z gazowego lasera argonowo-kryptonowego są wykorzystywane do wzbudzenia wirusa znakowanego Rh110C18 i SRB. Jednoczesne obrazowanie każdego znacznika jest realizowane poprzez rozdzielenie zielonej i czerwonej emisji fluorescencji za pomocą lustra dichroicznego i niezależne ogniskowanie obrazów na oddzielnych połowach kamery CCD z mnożeniem elektronów.

Wykonanie analizy

Przeprowadzenie testu fuzji obejmuje etapową aplikację komponentów biochemicznych wewnątrz celi przepływowej: utworzenie planarnej dwuwarstwy lipidowej, dokowanie znakowanych cząstek wirusa, pokrycie powierzchni fluoresceiną oraz zainicjowanie reakcji za pomocą buforu o niskim pH (Rysunek 1A).

1. Zamocuj celę przepływową na stoliku mikroskopu i podłącz rurkę wylotową do pompy strzykawkowej ustawionej na przepływ z prędkością 40 µL/min.
2. Oczyść kanały przepływowe z nadmiaru liposomów, przepływając 300 µL HNE.
3. Ustaw ostrość mikroskopu i dostosuj moc lasera tak, aby oświetlić powierzchnię natężeniem 350 W/cm² światła o długości fali 488 nm oraz 70 W/cm² światła o długości fali 568 nm. W przypadku użycia obiektywu imersyjnego olejowego 60x o aperturze NA 1,45, ustaw natężenie laserów odpowiednio na 100 µW i 20 µW.
4. Wprowadź za pomocą pompy znakowany wirus (rozcieńczony 1/100) do celi przepływowej. W miarę dyfuzji wirusa do dolnej powierzchni kanału przepływowego, cząsteczki zaczną przylegać do gangliozydu wbudowanego w lipidową dwuwarstwę.
5. Po osiągnięciu odpowiedniej gęstości zakotwiczonych cząsteczek wirusa (do około 1000 cząsteczek na pole widzenia), przełącz rurkę wlotową na roztwór zawierający 2 µg/mL streptawidyny znakowanej fluoresceiną. Znakowana streptawidyna zwiąże się z cząsteczkami lipidów sprzężonymi z biotyną w dwuwarstwie, w wyniku czego widoczne będzie słabe zielone tło.
6. Przemyj kanał przepływowy 300 µL HNE.
7. Wybierz obszar obrazowania, ustaw ostrość mikroskopu i przygotuj kamerę CCD do akwizycji obrazów w odstępach czasu (time-lapse). Ustaw czas ekspozycji na 100 ms i zbieraj klatki z częstotliwością 10 Hz.
8. Inicjuj fuzję, wprowadzając bufor kwaśny zawierający 10 mM cytrynianu sodu i 140 mM NaCl. pH buforu powinno być dostosowane tak, aby znajdowało się poniżej krytycznego pH wirusa poddanego badaniu. Wirus X-31 ulega fuzji przy pH poniżej 5,5.

Reprezentatywne wyniki

Rysunek 1B przedstawia migawki wirionów zadokowanych do dwuwarstwy przed i w trakcie fuzji. Każda plamka ograniczona dyfrakcyjnie reprezentuje pojedynczą cząstkę wirusa. Fluorescencja czerwona i zielona została oddzielnie odwzorowana na górnej i dolnej połowie kamery CCD, co umożliwia jednoczesną obserwację otoczki wirusowej oraz markerów zawartości. W kanale zielonym zazwyczaj występuje dwa razy więcej plamek niż w czerwonym, co odzwierciedla niższą wydajność znakowania barwnikiem zawartości w porównaniu z markerem otoczki. Zielona fluorescencja tła emitowana przez związaną z powierzchnią fluoresceinę znika po dodaniu buforu cytrynianowego, co pozwala wyznaczyć czas rozpoczęcia reakcji fuzji. Zdarzenia hemifuzji są wykrywane jako rozbłyski fluorescencji zielonej, gdy wygaszony Rh110C18 w otoczce wirusowej dyfunduje przez szyjkę hemifuzji i ulega rozcieńczeniu w membranie planarnej. Wokół cząstek w stanie hemifuzji widoczna jest rozszerzająca się na zewnątrz chmura fluorescencyjna, co świadczy o swobodnej dyfuzji barwnika związanego z grupą acylofattylową w membranie planarnej. Formowanie porów obserwuje się jako zanik fluorescencji czerwonej pochodzącej z SRB uwięzionego wewnątrz cząstek wirusowych. Otwarcie poru fuzyjnego pozwala barwnikowi na ucieczkę do przestrzeni wodnej poniżej planarnej dwuwarstwy i poza obszar obserwacji.

Trajektorie intensywności fluorescencji dla każdej cząsteczki, wykreślone na podstawie zintegrowanych intensywności poszczególnych cząsteczek, ułatwiają wyznaczenie wydajności oraz czasu hemifuzji i tworzenia się porów (Ryc. 1C). Moment zdarzeń hemifuzji i tworzenia się porów określa się jako punkt, w którym występuje maksymalne nachylenie impulsu fluorescencji Rh110C18 lub spadku sygnału SRB. W udanym eksperymencie około 50% cząsteczek znakowanych Rh110C18 generuje sygnały odwygaszania fluorescencji (dequenching), a 30% cząsteczek znakowanych SRB daje sygnał nadający się do analizy. Spośród cząsteczek znakowanych obydwoma barwnikami, około 10% wykazuje sygnały zarówno mieszania lipidów, jak i tworzenia się porów.

Ryc. 2A-C przedstawia rozkład czasów opóźnienia hemifuzji i tworzenia porów w typowym doświadczeniu. Ryc. 2D-F pokazuje rozkłady zdarzeń połączone z pięciu doświadczeń przeprowadzonych w tych samych warunkach. Nawet przy niewielkiej liczbie obserwacji kształt histogramów jest wyraźny. Ponieważ każde doświadczenie jest synchronizowane poprzez detekcję czasu spadku pH, można łączyć wiele doświadczeń i uzyskiwać szczegółowe informacje o etapach pośrednich ograniczających szybkość reakcji.

Rysunek 1. Projekt eksperymentalny. A) Cząsteczki wirusa są znakowane dwoma barwnikami fluorescencyjnymi w celu monitorowania kinetyki hemifuzji i tworzenia porów fuzyjnych. Fluorescencja jest zbierana przez obiektyw mikroskopu o wysokiej aperturze numerycznej (NA) i obrazowana na detektorze CCD. B) Obrazy fluorescencyjne przed (lewo) i w trakcie (prawo) fuzji pojedynczych cząsteczek wirusa. Górna i dolna połowa każdego obrazu odpowiada odpowiednio fluorescencji czerwonej i zielonej tego samego obszaru wspieranej dwuwarstwy o wymiarach ~ 50 x 100 mm². C) Intensywność fluorescencji czerwonego znacznika zawartości wirusa SRB (górna linia), zielonego barwnika błonowego Rh110C18 (środkowa linia) oraz fluoresceinowego czujnika pH (dolna linia) pozwala na precyzyjne określenie czasu, który upłynął między spadkiem pH, hemifuzją a fuzją. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję rysunku 1.

Rycina 2. Kinetyka fuzji wirusa znakowanego fluorescencyjnie. Rozkłady czasu, który upłynął między spadkiem pH a hemifuzją (A, D) oraz tworzeniem porów (B, E). Wzrost i spadek rozkładów wskazują na obecność wielu etapów pośrednich. Przejście między hemifuzją a otwarciem poru fuzyjnego dla poszczególnych cząsteczek ma rozkład wykładniczy, co sugeruje istnienie jednego etapu ograniczającego szybkość reakcji. Panele A-C przedstawiają wyniki pojedynczego eksperymentu. Panele D-F zostały zestawione z pięciu oddzielnych eksperymentów przeprowadzonych w tych samych warunkach. Prosimy kliknąć tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję ryciny 2.

Dyskusja

Przygotowanie płynnych i ciągłych wspieranych dwuwarstw lipidowych może być trudne. Śladowe ilości zanieczyszczeń lub defekty powierzchni zapobiegają rozprzestrzenianiu się dwuwarstw. Niezbędne jest staranne oczyszczenie oraz naniesienie jednorodnej warstwy dekstranu.

Przedłużające się obrazowanie cząsteczek wirusa może prowadzić do wybielenia znaczników fluorescencyjnych lub ich dezaktywacji. Tego rodzaju fotouszkodzenia są dobrze znane w dziedzinach obrazowania biologicznego i badań pojedyn...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Kwadratowe szkiełka nakrywkowe Corning, 25 mm	Sigma-Aldrich	CLS286525
Kuwety z topionego kwarcytu	Szkło techniczne
Kasetka do barwienia	Thomas Scientific	8542E40
(3-glicydoksypropylo)trimetoksysilan	Gelest Inc.	SIG5840.1
Dekstran T-500	Pharmacosmos	5510 0500 4006
1,2-dioleoil-sn1,2-dioleinoglicero-3-fosfocholina (DOPC)	Avanti Polar Lipid, Inc	850375
1-palmitylo-2-oleoylo-sn1-palmitylo-2-oleo-glicero-3-fosfocholina (POPC)	Avanti Polar Lipid, Inc	850457
Cholesterol	Avanti Polar Lipid, Inc	700000
N-((6-(biotynoilo)amino)heksanoylo)-1,2-diheksadekanoylo-sn-glycero-3-fosfo-–tanolamina, sól trietyloamoniowa (biotyna-X DHPE)	Invitrogen	B1616
Koniugat streptawidyny z fluoresceiną	Invitrogen	S-869
Disialogangliozyd GD1a z mózgu bydlęcego	Sigma-Aldrich	G2392
Miniwytłaczarka	Avanti Polar Lipid, Inc	610000
filtry membranowe z poliwęglanu o porach 0,1 mikrona	Whatman, GE Healthcare	800309
dyski drenażowe 10 mm (podpory membran)	Whatman, GE Healthcare	230300
Sól sodowa sulforodaminy B		S1402
Rodamina 110 oktadecyl (Rh110C18)			Zobacz Floyd i wsp. 2008 dla protokołu syntezy
kolumny odsalające PD-10	GE Healthcare	17-0851-01
mikroskop fluorescencyjny Nikon	Nikon Instruments	TE2000-U
obiektyw Plan Apo TIRF 60x 1,45 NA	Nikon Instruments
laser Ar/Kr Innova 70C Spectrum	Coherent Inc.
Pompa strzykawkowa	Harvard Apparatus	702213