Denaturująca elektroforeza żelowa w poliakrylamidzie z dodatkiem mocznika (Urea PAGE)

Podsumowanie

Denaturująca elektroforeza żelowa w poliakrylamidzie z dodatkiem mocznika jest stosowana do rozdzielania jednoniciowego DNA lub RNA o długości do 500 nukleotydów. Mocznik w połączeniu z ciepłem denaturuje próbki, a nieustrukturyzowane pojedyncze nici migrują wewnątrz matrycy żelowej zgodnie z ich masą cząsteczkową.

Streszczenie

Elektroforeza żelowa w poliakrylamidzie z dodatkiem mocznika (Urea PAGE) lub denaturująca elektroforeza w żelu poliakrylamidowym wykorzystuje 6-8 M mocznika, który denaturuje drugorzędowe struktury DNA lub RNA i służy do ich rozdzielania w macierzy żelu poliakrylamidowego na podstawie masy cząsteczkowej. Metodą tą można rozdzielić fragmenty o długości od 2 do 500 zasad, przy różnicach w długości wynoszących nawet pojedynczy nukleotyd¹. Migracja próbki zależy od wybranej koncentracji akrylamidu. Wyższy procent poliakrylamidu pozwala na rozdzielenie fragmentów o niższej masie cząsteczkowej. Połączenie mocznika i temperatury 45-55 °C podczas prowadzenia elektroforezy umożliwia rozdzielenie nieustrukturyzowanych cząsteczek DNA lub RNA.

Ogólnie metoda ta jest wymagana do analizy lub oczyszczania fragmentów jednoniciowego DNA lub RNA, takich jak syntetyzowane lub znakowane oligonukleotydy lub produkty reakcji cięcia enzymatycznego.

W niniejszym artykule wideo pokazujemy, jak przygotować i przeprowadzić elektroforezę w denaturujących żelach poliakryloamidowych z mocznikiem. Oprócz oryginalnego protokołu ^1,2 zamieszczono również wskazówki techniczne.

Protokół

Pełny i szczegółowy protokół tekstowy dla tej procedury eksperymentalnej jest dostępny w Current Protocols in Molecular Biology. Szczegółowe instrukcje krok po kroku dotyczące montażu kanapki żelowej oraz urządzenia do elektroforezy można znaleźć na stronie internetowej BioRad ³.

Wymagany sprzęt:
Płytki szklane (wewnętrzna i zewnętrzna)
Kuweta 10 cm: 10,1 x 7,3 cm (płytka wewnętrzna), 10,1 x 8,2 cm (płytka zewnętrzna), BioRad
Kuweta 20 cm: 20 x 20 cm (płytka wewnętrzna), 20 x 22,3 cm (płytka zewnętrzna), BioRad
Grzebień do żelu 0,5-1,5 mm i dystanse
Statyw do odlewania żelu
Aparat do elektroforezy z pokrywą i przewodami
Zasilacz wysokiego napięcia
Blok grzejny lub kąpiel wodna
Pipety serologiczne i kontroler pipet (Pipette aid)
Pipety i końcówki do pipet
Suszarka do żeli lub skaner

Odczynniki i roztwory:
Mocznik (ultraczysty)
40% roztwór poliakryloamidu (29:1)
10 x roztwór TBE (bufor Tris-Borate, EDTA)
Woda dejonizowana, destylowana
TEMED
30% (w/v) roztwór persiarczanu amonu
0,5 x roztwór TBE
Formamid
EDTA
Błękit ksylenowy
Błękit bromofenolowy
Metanol
Etanol

Objętość	50 ml			60 ml			10 ml
Stężenie akrylamidu	10%	12,5%	15%	10%	12,5%	15%	10%	12,5%	15%
g mocznika	24	24	24	28,8	28,8	28,8	4,8	4,8	4,8
ml 40% akrylamidu (29:1)	12,5	15,625	18,75	15	18,75	22,5	2,5	3,125	3,75
µL 30% APS	166	166	166	199,2	199,2	199,2	33	33	33
µL TEMED	20	20	20	24	24	24	4	4	4
10 x TBE	5	5	5	6	6	6	1	1	1
Uzupełnić objętość dejonizowaną wodą destylowaną

Tabela 1: Odczynniki i roztwory potrzebne dla różnych stężeń i objętości akrylamidu do rozdziału jednoniciowych oligonukleotydów

Przygotowanie „kanapki” żelowej i przygotowanie żelu

1. Złóż żel zgodnie z opisem producenta i zamocuj go w komorze do odlewania żelu ³. Użyj dystanserów o grubości 0,5-1,5 mm.
2. Przygotuj odpowiedni roztwór poliakrylamidu zgodnie z aktualnymi protokołami biologii molekularnej lub według danych w Tabeli 1. W przypadku denaturującego żelu akrylamidowego o wymiarach 20 cm x 22 cm x 1,5 mm wystarczy 60 ml roztworu żelu, a dla żelu 10,1 x 8,2 cm x 1 mm wystarczy 5 ml roztworu żelu. Większe żele stosuje się, gdy spodziewane produkty/prążki mieszczą się w zakresie kilku zasad; wtedy dłuższy żel pozwoli rozdzielić prążki różniące się pojedynczym nukleotydem. Jeśli spodziewane prążki różnią się o więcej niż 10 nukleotydów, do rozdzielenia fragmentów odpowiednie będą mniejsze żele. Wybierz procentowe stężenie poliakrylamidu dostosowane do wymagań rozdzielczości; wyższe stężenia poliakrylamidu pozwolą rozdzielić fragmenty o niższej masie cząsteczkowej. Użyj ultrapure urea i wymieszaj z żądaną ilością akrylamidu. Dodaj bufor TBE do mieszaniny żelu, aby uzyskać stężenie końcowe 0,5-1 x TBE, a objętość uzupełnij dejonizowaną wodą destylowaną. Podgrzewaj roztwór przez 20 sekund w mikrofalówce i delikatnie wymieszaj. W przypadku większych objętości żelu powtarzaj ten krok, aż roztwór osiągnie temperaturę letnią.
3. Niezwłocznie wlej żel między dwie szklane płytki, używając pipety serologicznej i automatycznego kontrolera pipet. Unikaj wprowadzania pęcherzyków powietrza. Włóż grzebień i pozostaw żel do polimeryzacji na 30-60 minut.

Przygotuj aparat do elektroforezy i przeprowadź przebieg wstępny żelu

1. Wyjmij żel z komory odlewniczej i zamontuj go w aparaturze do elektroforezy zgodnie z instrukcjami producenta ³.
2. Wypełnij dolną komorę buforową buforem do elektroforezy (0.5-1 x TBE) w taki sposób, aby płyty szklane były zanurzone w buforze na głębokość 2-3 cm. Wypełnij górną komorę buforową buforem do elektroforezy do górnej krawędzi żelu.
3. Ostrożnie wyjmij grzebień i wypłucz dołki buforem do elektroforezy, używając pipety i końcówek do nakładania próbek na żel.
4. Zamknij pokrywę systemu elektroforetycznego i podłącz kable do zasilacza wysokiego napięcia. Przed nałożeniem próbek należy przeprowadzić wstępny rozbieg żelu przez co najmniej 30 minut, aby go podgrzać i usunąć pozostały w żelu mocznik. Optymalna temperatura powinna wynosić od 45-55 °C. Należy unikać temperatur przekraczających 60 °C, ponieważ może to spowodować rozmycie prążków lub pęknięcie płyt szklanych. Dla wstępnego rozbiegu wybierz stałą moc (15-25 W na żel).

Przygotowanie próbek

1. W międzyczasie przygotuj próbki. W tym celu dodaj odpowiednią ilość 2 x mieszaniny do ładowania żelu do swojej próbki. Mieszanina do ładowania zazwyczaj zawiera 90% formamidu, 0,5% EDTA, 0,1% ksylenocyjanolu i 0,1% błękitu bromofenolowego.
2. Przed naniesieniem próbek na żel muszą one zostać poddane denaturacji termicznej poprzez podgrzewanie w temperaturze 70-90 °C przez kilka minut.

Załaduj i przeprowadź elektroforezę żelu

1. Po zakończeniu wstępnego przebiegu (prerun) zdejmij pokrywkę i dokładnie wypłucz kieszenie zgodnie z wcześniejszym opisem, ponieważ mocznik przeniknął do studzienek.
2. Ostrożnie nanieś próbki od dna kieszeni. Unikaj wprowadzania pęcherzyków powietrza. Do pustych kieszeni należy nanieść bufor do ładowania, aby zachować jednakowe warunki podczas elektroforezy.
3. Zamontuj pokrywkę i prowadź elektroforezę przy stałej mocy, aby utrzymać temperaturę żelu na poziomie 55 °C, analogicznie do etapu prerunu. Obserwuj migrację barwników markerowych, aż front barwnika dotrze do dolnej krawędzi żelu. Czas trwania przebiegu zależy od stężenia użytego akrylamidu, siły jonowej buforu oraz grubości żelu. Przebieg może trwać od 2 do 4 godzin.
   Kontroluj temperaturę żelu. W celu monitorowania właściwej temperatury podczas elektroforezy można posłużyć się termometrem do żeli.

Przetwórz żel

1. Gdy czoło barwnika dotrze do końca żelu, wyjmij żel z dolnej komory z buforem. Wyjmij żel z komory i poluzuj zaciski. Usuń dystansery i ostrożnie rozdziel płyty szklane. W razie potrzeby odetnij górną część żelu zawierającą dołki.
2. Ostrożnie przenieś żel do naczynia z roztworem do fiksacji żelu (ten sam stężenie TBE plus 5-10% Methanol i Ethanol). Pozostaw żel w roztworze na 5-10 minut i dwukrotnie wymień bufor.
3. Żel jest gotowy do dalszej obróbki przy użyciu próżniowej suszarki do żeli lub bezpośredniego skanowania żelu.

Dyskusja

1. Ostrość prążków zależy od kilku czynników. Aby uzyskać ostre prążki, objętość naniesionej próbki powinna być jak najmniejsza, idealnie w zakresie 1-5 μl. Można jednak nanieść do 15 μl, co nadal zapewnia akceptowalną rozdzielczość. Mniejsza objętość próbki skutkuje ostrzejszymi prążkami.
2. Jakość prążków zależy również od grubości żelu. Cieńsze żele, np. 0,75 mm, dają lepsze wyniki niż żele o grubości 1,5 mm.
3. Na kształt prążków może wpływać sposób nakładania próbki, jeśli nie zostanie ona równomiernie wprowadzona do oczk...