Denaturująca elektroforeza żelowa w poliakrylamidzie z dodatkiem mocznika jest stosowana do rozdzielania jednoniciowego DNA lub RNA o długości do 500 nukleotydów. Mocznik w połączeniu z ciepłem denaturuje próbki, a nieustrukturyzowane pojedyncze nici migrują wewnątrz matrycy żelowej zgodnie z ich masą cząsteczkową.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Denaturująca elektroforeza żelowa w poliakrylamidzie z dodatkiem mocznika (Urea PAGE)
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Elektroforeza żelowa w poliakrylamidzie z dodatkiem mocznika (Urea PAGE) lub denaturująca elektroforeza w żelu poliakrylamidowym wykorzystuje 6-8 M mocznika, który denaturuje drugorzędowe struktury DNA lub RNA i służy do ich rozdzielania w macierzy żelu poliakrylamidowego na podstawie masy cząsteczkowej. Metodą tą można rozdzielić fragmenty o długości od 2 do 500 zasad, przy różnicach w długości wynoszących nawet pojedynczy nukleotyd1. Migracja próbki zależy od wybranej koncentracji akrylamidu. Wyższy procent poliakrylamidu pozwala na rozdzielenie fragmentów o niższej masie cząsteczkowej. Połączenie mocznika i temperatury 45-55 °C podczas prowadzenia elektroforezy umożliwia rozdzielenie nieustrukturyzowanych cząsteczek DNA lub RNA.
Ogólnie metoda ta jest wymagana do analizy lub oczyszczania fragmentów jednoniciowego DNA lub RNA, takich jak syntetyzowane lub znakowane oligonukleotydy lub produkty reakcji cięcia enzymatycznego.
W niniejszym artykule wideo pokazujemy, jak przygotować i przeprowadzić elektroforezę w denaturujących żelach poliakryloamidowych z mocznikiem. Oprócz oryginalnego protokołu 1,2 zamieszczono również wskazówki techniczne.
Protokół
Pełny i szczegółowy protokół tekstowy dla tej procedury eksperymentalnej jest dostępny w Current Protocols in Molecular Biology. Szczegółowe instrukcje krok po kroku dotyczące montażu kanapki żelowej oraz urządzenia do elektroforezy można znaleźć na stronie internetowej BioRad 3.
Wymagany sprzęt:
Płytki szklane (wewnętrzna i zewnętrzna)
Kuweta 10 cm: 10,1 x 7,3 cm (płytka wewnętrzna), 10,1 x 8,2 cm (płytka zewnętrzna), BioRad
Kuweta 20 cm: 20 x 20 cm (płytka wewnętrzna), 20 x 22,3 cm (płytka zewnętrzna), BioRad
Grzebień do żelu 0,5-1,5 mm i dystanse
Statyw do odlewania żelu
Aparat ....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
- Ostrość prążków zależy od kilku czynników. Aby uzyskać ostre prążki, objętość naniesionej próbki powinna być jak najmniejsza, idealnie w zakresie 1-5 μl. Można jednak nanieść do 15 μl, co nadal zapewnia akceptowalną rozdzielczość. Mniejsza objętość próbki skutkuje ostrzejszymi prążkami.
- Jakość prążków zależy również od grubości żelu. Cieńsze żele, np. 0,75 mm, dają lepsze wyniki niż żele o grubości 1,5 mm.
- Na kształt prążków może wpływać sposób nakładania próbki, jeśli nie zostanie ona równomiernie wprowadzona do oczk.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie zgłaszają żadnych konfliktów interesów.
Podziękowania
Niniejsza praca była wspierana przez Singapurską Radę Badań Akademickich (ARC) [grant nr 90/07]. Dziękujemy firmie Radiodurans za wsparcie.
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Bibliografia
- Maniatis, T., Jeffrey, A., van deSande, H. Chain length determination of small double- and single-stranded DNA molecules by polyacrylamide gel electrophoresis. Biochemistry. 14, 3787-3794 (1975).
- Albright, L. M., Slatko, B. E. Denaturing polyacrylamide gel electrophoresis. Curr ....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
