Obrazowanie in vivo głębokich warstw kory mózgowej z wykorzystaniem mikropryzmatu

Podsumowanie

Wprowadzenie prawokątnych mikropryzmatów do nowokory mózgu myszy umożliwia głębokie obrazowanie wielu warstw kory z perspektywy typowej dla preparatów przekrojowych. Mikropryzmaty o rozmiarze jednego milimetra zapewniają szerokie pole widzenia (~900 μm) oraz rozdzielczość przestrzenną wystarczającą do zobrazowania kolców dendrytycznych. Prezentujemy obrazowanie neuronów warstwy V oraz obrazowanie naczyń krwionośnych nowokory z wykorzystaniem mikropryzmatów.

Streszczenie

Przedstawiamy protokół obrazowania in vivo tkanki korowej z wykorzystaniem sondy do obrazowania głębokich struktur mózgu w kształcie mikropryzmatu. Mikropryzmaty mają rozmiar 1 mm i posiadają powłokę refleksyjną na przeciwprostokątnej, co umożliwia wewnętrzne odbicie światła wzbudzenia i emisji. Sonda z mikropryzmatem pozwala na jednoczesne obrazowanie wielu warstw kory z perspektywy typowej zazwyczaj tylko dla preparatów skrawkowych. Obrazy są zbierane z szerokim polem widzenia (~900 μm). Ponadto przedstawiamy szczegóły dotyczące procedury chirurgicznej w trybie non-survival oraz konfiguracji mikroskopu. Reprezentatywne wyniki obejmują obrazy neuronów piramidowych warstwy V z myszy Thy-1 YFP-H, pokazujące ich dendryty apikalne przechodzące przez powierzchowną warstwę kory i rozgałęziające się w kępki. Rozdzielczość była wystarczająca do obrazowania kolców dendrytycznych w pobliżu somy neuronów warstwy V. Iniekcja barwnika fluorescencyjnego do żyły ogonowej ujawnia złożoną sieć naczyń krwionośnych w korze. Skanowanie liniowe erytrocytów (RBCs) przepływających przez naczynia kapilarne pozwala na wyznaczenie prędkości oraz natężenia przepływu RBC. Ta nowatorska sonda z mikropryzmatem stanowi elegancką, a zarazem potężną nową metodę wizualizacji głębokich struktur komórkowych i funkcji kory in vivo.

Protokół

Część 1: Optyka mikropryzmatów i konfiguracja mikroskopu

1. Stosowane przez nas mikropryzmaty to pryzmaty prostokątne o wymiarach 1 mm, wykonane ze szkła BK7 zakupionego w Optosigma Corporation (Rysunek 1). W miarę możliwości do manipulowania mikropryzmatami należy używać pęsety.
2. Przeciwprostokątna mikropryzmatu jest powlekana wzmocnionym srebrem, aby zapewnić współczynnik odbicia powyżej 97% w zakresie od 400 do 2000 nm. Zapewnia to wewnętrzne odbicie zarówno światła wzbudzenia lasera, jak i emitowanej fluorescencji.
3. Mikropryzmaty należy zawsze przenosić za pomocą pęsety, jeśli jest to możliwe. Przez cały czas należy nosić rękawiczki, aby utrzymać pryzmat w czystości.
4. Używamy zbudowanego na zamówienie mikroskopu dwufotonowego zdolnego do obrazowania małych zwierząt. Zwierzę, przymocowane do urządzenia stereotaktycznego, umieszcza się na zmotoryzowanym stole 3-osiowym.
5. Mikroskop jest połączony z komputerem PC z systemem Windows uruchamiającym oprogramowanie ScanImage. ScanImage to oprogramowanie do akwizycji obrazu napisane w języku Matlab przez Pologruto i wsp. ¹.
6. W przypadku obrazowania za pomocą mikropryzmatów zbieramy obrazy o rozdzielczości 1024 x 1024 lub 512 x 512 pikseli. Dodatkowo zazwyczaj skanujemy z prędkością 2 ms/linię lub 4 ms/linię.
7. W eksperymentach stosuje się dwa rodzaje obiektywów:
   • Obiektyw powietrzny o niższej aperturze numerycznej (NA) do obrazowania w szerokim polu widzenia (patrz Tabela odczynników i sprzętu).
   • Obiektyw powietrzny o wyższej NA z szklaną obrączką korekcyjną, zdolną do minimalizacji aberracji sferycznych wywołanych przez 0 – 2 mm szkła (patrz Tabela odczynników i sprzętu).
8. Gdy zwierzę jest gotowe do obrazowania pod obiektywem o małym powiększeniu, należy dopasować kwadratowy wzór skanowania rastrowego lasera do górnej części mikropryzmatu. Pomoże to zorientować obraz i efektywnie wykorzystać moc lasera.
9. Używając obiektywu o wyższej NA z szklaną obrączką korekcyjną, ustaw obrączkę tak, aby korygowała ok. 1 mm szkła. Gdy podczas eksperymentu pojawi się obraz fluorescencyjny, można ostrożnie sięgnąć do wnętrza mikroskopu, aby zoptymalizować ustawienie obrączki korekcyjnej w celu maksymalizacji rozdzielczości obrazowania.

Część 2: Operacja zwierzęca bez przeżycia i implantacja mikropryzmatu

1. Całkowity czas trwania procedury, od pierwszego nacięcia do zakończenia obrazowania, zależy od celów eksperymentu. Można jednak oczekiwać, że procedura chirurgiczna w modelu nieprzeżywalnym oraz umieszczenie mikropryzmatu zajmą około 30 – 40 minut.
2. Myszy (P30-P60) są ważone i poddane odpowiedniej anestezji za pomocą wtrysku d.o. (I.P.) ketaminy (100 mg/kg) i ksylazyny (10 mg/kg) do poziomu odpowiedniego dla procedur chirurgicznych.
3. Przez cały czas trwania eksperymentu należy sprawdzać zwierzę co 15-20 minut, aby ocenić poziom anestezji. Jeśli zwierzę reaguje na mocne uciśnięcie palca stopy, wymagana jest dodatkowa dawka ketaminy/ksylazyny. Zazwyczaj dawka uzupełniająca stanowi jedną trzecią dawki początkowej i może być przygotowana wcześniej w strzykawce do natychmiastowego wtrysku d.o. w razie potrzeby.
4. Po prawidłowym znieczuleniu myszy większość włosów na głowie zwierzęcia jest zgolona przy użyciu trymera z głowicą nr 40.
5. Pozostałe włosy na głowie są poddawane działaniu preparatu Nair®, aby pomóc w stworzeniu powierzchni wolnej od włosów, które mogłyby przeszkodzić w pracy mikropryzmatu podczas obrazowania. Po 5 minutach preparat Nair® jest usuwany za pomocą patyczka z bawełnianym końcem.
6. Znieczulone zwierzę jest odpowiednio umieszczane w stereotaktycznym uchwycie dla myszy. Podczas procedur chirurgicznych i sesji obrazowania zwierzę spoczywa na wypełnionej wodą podkładce grzewczej ustawionej na 36 stopni Celsjusza.
7. Po prawidłowym unieruchomieniu głowy zwierzęcia skalpelem wykonuje się jedno czyste nacięcie wzdłuż linii środkowej czaszki w celu oddzielenia skóry.
8. Niewielką ilość 3% nadtlenku wodoru nanosi się na patyczek z bawełnianym końcem i aplikuje na czaszkę, aby usunąć błony znajdujące się między czaszką a skórą.
9. Nadtlenek wodoru pomaga również w zlokalizowaniu punktu bregma, który jest kluczowym punktem orientacyjnym przy określaniu miejsca wykonania kraniotomii i wprowadzenia mikropryzmatu.
10. Przed rozpoczęciem kraniotomii odpowiednio reguluje się pręty uszne i pręt zgryzowy, aby przechylić odsłoniętą czaszkę tak, by była ona w zasadzie równoległa do stołu. Zapewnia to lepszą platformę do kraniotomii. Dodatkowo sprawia to, że górna powierzchnia pryzmatu jest prostopadła do wpadającego światła wzbudzenia, co pomaga zminimalizować aberracje optyczne podczas obrazowania.
11. Mały wiertło dentystyczne (rozmiar głowicy ~0,8 mm) jest podłączone do narzędzia Dremel® za pomocą elastycznego przedłużenia. W przypadku kraniotomii prędkość ustawiamy na około 7 000 do 10 000 obr./min.
12. Wiertłem dentystycznym wykonuje się płytkie nacięcia wzdłuż czaszki, aż do utworzenia kwadratowego rowka w kości. Boki kwadratu mają długość około 2-3 mm i są wyśrodkowane 1,5 mm za tylną krawędzią (caudal) i 1 mm bocznie (lateral) względem punktu bregma.
13. Następnie kontynuuje się ścieńczanie kości, aż powstanie niewielki otwór w czaszce. Pincetą można unieść płat kostny z czaszki.
14. Przed wprowadzeniem mikropryzmatu do kory należy usunąć oponę twardą. Krwawienie najlepiej kontrolować, pozwalając krwi ściąć się na powierzchni przez kilka minut. Następnie, przed wprowadzeniem mikropryzmatu, skrzepniętą krew usuwa się za pomocą gąbki chirurgicznej.
15. Aby ułatwić wyrównanie pryzmatu z korą, pionową ściankę mikropryzmatu ustawia się równolegle do uchwytów pincety.
16. Trzymając pryzmat w odpowiedni sposób, wprowadza się cały mikropryzmat, aż jego góra zrówna się z powierzchnią nowokory.
17. Przy prawidłowym wprowadzeniu mikropryzmat powinien pozostać w odpowiedniej pozycji. Ewentualne krwawienie jest minimalne i można je wchłonąć niewielką gąbką chirurgiczną. Gdy pryzmat znajdzie się na miejscu, zwierzę jest gotowe do obrazowania.
18. Mikropryzmat po użyciu u zwierzęcia może być wykorzystany wielokrotnie. Wymaga jednak odpowiedniego oczyszczenia w celu usunięcia pozostałości materiału biologicznego. Można to osiągnąć poprzez zanurzenie pryzmatu w niewielkiej objętości kwasu HCl, a następnie w metanolu. Oczyszczony mikropryzmat można następnie zawinąć w papier do soczewek do czasu kolejnego użycia.

Część 3: Reprezentatywne wyniki

Rycina 1: Zdjęcia mikropryzmatu prostokątnego. Pryzmaty wykorzystane w tym eksperymencie to pryzmaty szklane BK7 o rozmiarze 1 mm, z wzmocnioną powłoką srebrową na przeciwprostokątnej, aby umożliwić wewnętrzne odbicie światła wzbudzenia i emisji.

Rycina 2: Obraz neuronów piramidowych YFP z warstwy V. Obrazowanie z szerokim polem widzenia z użyciem mikropryzmatu ujawnia dużą populację ciał komórek piramidowych na głębokości ~800 – 900 μm od powierzchni kory. Dodatkowo można rozpoznać dendryty apikalne rozciągające się w górę w kierunku warstwy I. Pasek skali = 200 μm.

Rysunek 3: Obiektyw o większej aperturze numerycznej stosowany w połączeniu z mikropryzmatem zapewnia rozdzielczość przestrzenną wystarczającą do rozdzielenia kolców dendrytycznych na dendrytach apikalnych neuronów piramidowych warstwy V. Pasek skali = 10 μm.

Rysunek 4: Obraz uzyskany przy użyciu mikropryzmatu i wstrzyknięcia barwnika fluorescencyjnego do żyły ogonowej. Obraz przedstawia pionowe naczynia o dużym kalibrze wychodzące z głębokich obszarów mózgu oraz mniejsze kapilary odgałęziające się przez objętość kory. Pasek skali = 200 μm.

Rysunek 5: Przy użyciu obiektywu o wyższej aperturze numerycznej sieć naczyń włosowatych w nowokorze może być obrazowana z większą szczegółowością. Pasek skali = 50 μm.

Rysunek 6: Mikropryzmaty umożliwiają również obrazowanie erytrocytów (RBC) przepływających przez naczynia. Erytrocyty nie absorbują barwnika fluorescencyjnego, w związku z czym są widoczne jako ciemne pasma przecinające naczynie. Poprzez skanowanie liniowe w poprzek naczynia można uzyskać pomiary strumienia i prędkości erytrocytów. Pasek skali = 10 μm (poziomy pasek na górnym i dolnym obrazie) oraz 250 ms (pionowy pasek na dolnym obrazie).

Dyskusja

Wykorzystanie mikropryzmatu w eksperymencie obrazowania jest stosunkowo proste i oferuje wiele zalet w badaniach in vivo nad neokorą. Reprezentatywne przykłady z zastosowaniem tej techniki obejmują obrazy uzyskane z myszy transgenicznych wykazujących ekspresję żółtego białka fluorescencyjnego w neuronach warstwy V kory. Dzięki zastosowaniu mikropryzmatów można zaobserwować skupisko dużych ciał komórek piramidowych w warstwie V, niemal 1 mm poniżej powierzchni kory. Widoczne są również dendryty apikalne, które przechodzą ...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Z podwyższoną srebrną powłoką refleksyjną-(R77)	OptoSigma Corp. (Santa Ana, CA)	055-0010	Z podwyższoną srebrną powłoką refleksyjną-(R77)
Dekstran fluoresceinowy	Sigma-Aldrich	FD70	70 kDa
Obiektyw powietrzny 4x, NA 0,28	Olympus Corporation	XLFLUOR 4x/340
Obiektyw powietrzny 40x, NA 0,60	Olympus Corporation	LUCPLFLN	Z korekcją szkiełka coverglass 0-2 mm