Przygotowanie i hodowla eksplantów nabłonka soczewki szczura do badań nad różnicowaniem terminalnym

Podsumowanie

Eksplanty z regionu centralnego nabłonka soczewki szczura różnicują się synchronicznie podczas hodowli w obecności FGF-2. Mikroskopia immunofluorescencyjna takich hodowli może dostarczyć nowych informacji na temat ekspresji genów i zdarzeń sygnalizacyjnych związanych z różnicowaniem końcowym.

Streszczenie

Przednia powierzchnia soczewki oka pokryta jest monowarstwą komórek nabłonkowych, które proliferują w strefie pierścieniowatej znajdującej się pod ciałem rzęskowym. Po podziale komórki te migrują w kierunku tylnym, gdzie dyfundujący z siatkówki FGF indukuje ich różnicowanie w tylny układ wydłużonych komórek włókien soczewki, które stanowią główną masę soczewki. Różnicowanie komórek nabłonkowych soczewki w włókna soczewki można indukować in vitro, hodując eksplanty centralnego regionu nabłonka przedniego w obecności FGF-2. Eksplanty przygotowuje się z soczewek nowonarodzonych szczurów poprzez usunięcie soczewki z oka i uchwycenie torebki soczewki po stronie tylnej pęsetą sekcyjną. Następnie tylna torebka jest delikatnie rozrywana i dociskana do plastikowego dna naczynia do hodowli tkanek. Regiony peryferyjne eksplantu usuwa się skalpelem, a obszar centralny hoduje się w obecności 100 ng/ml FGF-2 przez okres od 2 do 3 tygodni, w zależności od parametrów poddawanych badaniu. Ponieważ komórki nabłonkowe w hodowanych eksplantach różnicują się w przybliżeniu synchronicznie w okresie od kilku dni do kilku tygodni, przebieg czasowy sygnalizacji i ekspresji genów można określić za pomocą technik molekularnych, biochemicznych i farmakologicznych. Mikroskopia immunofluorescencyjna stanowi potężne uzupełnienie tych metod, ponieważ pozwala na wykazanie subkomórkowej lokalizacji interesujących białek oraz może ujawnić fizjologiczne skutki eksperymentalnych manipulacji szlakami sygnalizacyjnymi.

Protokół

Część 1: Usunięcie soczewek

Materiały i odczynniki:

1. Nożyczki do mikrosekcji, zakrzywione, z tępymi końcówkami (np. RS-5983, Roboz Surgical Instrument Co., Inc, Gaithersburg, MD); pęseta do mikrosekcji, zakrzywiona końcówka (np. Roboz #RS5137).
2. Pożywka do zawiesiny: Medium 199 zawierające 0,1% albuminy surowicy bydlęcej, 100 units/ml penicyliny, 100μg/ml streptomycyny, 2,5 μg/ml amfoterycyny B. Odczynniki są dostępne w firmie Invitrogen, Carlsbad, CA.

Procedura:

1. Uśmierć noworodki szczurów (w wieku 2-4 dni) zgodnie z wytycznymi National Institutes of Health, Bethesda, MD.
2. Usuń powieki za pomocą nożyczek chirurgicznych. Delikatnie naciśnij zakrzywioną pęsetą po przeciwnych stronach oczodołu, aby wypchnąć gałkę oczną na zewnątrz. Wykonaj nożyczkami niewielkie nacięcie na tylnej stronie oka. Naciskając pęsetą bok oka przeciwległy do nacięcia, soczewkę wraz z niewielką ilością przylegającego ciała szklistego można wypchnąć przez otwór, co umożliwia pobranie soczewki zakrzywioną pęsetą. Należy zachować ostrożność, aby nie przerwać torebki soczewki.
3. Za pomocą zakrzywionej pęsety przenieś soczewki do plastikowej szalki hodowlanej o średnicy 60 mm zawierającej 5 ml ciepłego, sterylnego medium zawiesinowego.

Część 2: Mikrodysekcja eksplantów

Materiały i odczynniki:

1. Pęseta do mikrodisekcji, końcówki 0.1 mm (np. Roboz RS-4976). Stosujemy stop Dumostar ze względu na elastyczność końcówki, lecz dopuszczalne są również inne stopy stali. Nie zaleca się stosowania pęset z końcówkami cieńszymi niż 0.1 mm, ponieważ mają one tendencję do łamania się lub wyginania podczas tej procedury.
2. Medium do zawiesiny (patrz Część 1)
3. Nieuzupełnione medium Ham’s F12 lub Medium 199 (Invitrogen, Carlsburg, CA)

Procedura:

1. Kolejne kroki należy przeprowadzić w czystym środowisku bez przeciągów, używając sterylnych narzędzi do mikrodysekcji oraz sterylnego medium.
2. Używając stereomikroskopu, oczyścić soczewki z przylegających tkanek za pomocą pęsety z końcówką 0,1 mm i przenieść je do drugiej szalki hodowlanej o średnicy 60 mm zawierającej 5 ml sterylnego medium zawiesinowego (krok ten pomaga zmniejszyć zanieczyszczenie). Pęsetą przenieść pożądaną liczbę soczewek do szalki hodowlanej o średnicy 35 mm zawierającej 5 ml sterylnego, nieuzupełnionego medium. (W tym kroku często stosujemy medium Ham’s F12 (Invitrogen), ponieważ niższe stężenie barwnika ułatwia dysekcję; dopuszczalne jest jednak również Medium 199. Na tym etapie nie są wymagane antybiotyki ani inne dodatki). W centrum szalki tej wielkości można przygotować do 12 eksplantatów. Należy jednak używać szalki 35 mm nawet przy mniejszej liczbie eksplantatów, ponieważ w mniejszej szalce trudniej manipulować narzędziami do dysekcji). Szalkę z pozostałymi soczewkami przenieść do inkubatora do hodowli tkanek w temperaturze 37°C do czasu ich wykorzystania.
3. Zidentyfikować stronę tylną soczewki. Istnieje wiele sposobów na jej rozpoznanie: 1) Strona tylna jest bardziej okrągła niż przednia, która jest lekko spłaszczona; 2) W soczewkach noworodków szczurów w trakcie dysekcji, podczas chłodzenia do temperatury pokojowej, tworzą się tzw. zimne zaćmy. Jeśli zimna zaćma nie wypełniła całkowicie soczewki, stroną tylną jest ta, która znajduje się najdalej od obszaru nieprzezroczystego. Jeśli nieprzezroczystość wypełniła całą soczewkę, ogrzanie szalki do 37°C przez kilka minut cofnie ten proces. Stronę tylną można zidentyfikować, gdy zaćma ponownie uformuje się podczas chłodzenia. 3) Na stronie tylnej mogą być widoczne pozostałości tunica vasculosa lentis. 4) Na stronie tylnej może być widoczna szew tylny. Prawidłowa identyfikacja strony tylnej jest kluczowa, ponieważ to właśnie w tym miejscu zostanie otwarta torebka. Otwarcie soczewki od strony przedniej spowoduje rozerwanie nabłonka.
4. Po zidentyfikowaniu strony tylnej, należy ją odwrócić górą do góry i uchwycić soczewkę lewą pęsetą (w przypadku osoby praworęcznej). Następnie ucisnąć torebkę tylną prawą pęsetą, aby stworzyć małe zagięcie.
5. Trzymając torebkę tylną prawą pęsetą, uchwycić zagięcie torebki lewą pęsetą i rozsunąć obie pęsety w przeciwnych kierunkach, aby wykonać małe nacięcie w torebce.
6. Trzymając pęsetą krawędź odsuwanej torebki, pociągnąć ją w dół, najpierw z jednej strony, a potem z drugiej, dociskając ją pęsetą do plastiku szalki. Powtórzyć tę czynność kilka razy, przesuwając się wokół równika soczewki, aż torebka zostanie mocno przytwierdzona do płytki w wielu punktach. Trzymając torebkę w miejscu lewą pęsetą, delikatnie poruszać masą włókien prawą pęsetą, aby przerwać połączenie między komórkami włókien a komórkami nabłonka na równiku soczewki. Następnie odsunąć masę włókien, zsuwając ją z torebki/nabłonka, które pozostają przytwierdzone do dna szalki. Kontynuować ten proces dla wszystkich soczewek w szalce. Usunąć i zutylizować masy włókien (lub zamrozić je jako źródło białek soczewki do innych badań).

Część 3: Mikrodyssekcja i hodowla eksplantów centralnych

Materiały i odczynniki:

1. Sterylny skalpel jednorazowy, ostrze #15, (Cincinnati Surgical Co. Cincinnati, OH)
2. Sterylny roztwór soli fizjologicznej z buforem fosforanowym z dodatkiem wapnia i magnezu (Invitrogen, Carlsbad, CA)
3. Pożywka hodowlana: pożywka do zawiesiny zawierająca 100ng/ml FGF-2 (Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO).

Procedura:

1. Za pomocą sterylnego skalpela odetnij nabłonek obwodowy (PE), który zawiera komórki we wczesnych stadiach różnicowania (Rycina 1A), pozostawiając centralny kwadrat o boku około 2,0 mm, składający się wyłącznie z centralnych komórek nabłonkowych (CE) (Rycina 1B).
2. Przenieś szalkę zawierającą eksplantaty centralne do komory z laminarnym przepływem powietrza. Przemyj 3 razy sterylnym PBS z dodatkiem wapnia i magnezu oraz raz 1 ml świeżego, zrównoważonego (37°C, 5% CO₂) medium zawiesinowego. Przemycia te znacznie zmniejszają ryzyko kontaminacji.
3. Dodaj 2 ml pożywki hodowlanej w celu indukcji różnicowania¹ i umieść eksplantaty w inkubatorze do hodowli tkanek z nawilżaniem w temperaturze 37°C i 5% CO₂. Okresy hodowli mogą trwać od kilku godzin do dwóch lub trzech tygodni, w zależności od badanego parametru. Pożywkę należy wymieniać co dwa do trzech dni.

Część 4: Pozyskiwanie eksplantów do analizy zdarzeń związanych z różnicowaniem

1. Pobieranie eksplantów do analizy białek lub RNA

Materiały:

1. Pęseta do mikrosekcji
2. Bufor lizujący SDS lub RNA-later

Procedura:

1. Po zakończeniu okresu inkubacji usunąć pożywkę hodowlaną.
2. Używając stereomikroskopu sekcyjnego, delikatnie poluzować brzegi każdego eksplantu.
3. Podnieść każdy eksplant pęsetą i przenieść go do probówki zawierającej około 100μl buforu lizującego SDS (do analizy białek) lub RNA-later (do analizy RNA). Poruszyć końcówką pęsety w roztworze, aby upewnić się, że eksplant nie przywarł do pęsety.

2. Pobieranie eksplantów do immunofluorescencji

Materiały i odczynniki:

1. Fosforan buforowany roztwór soli z dodatkiem wapnia i magnezu (Invitrogen, Carlsbad, CA)
2. Fosforan buforowany roztwór soli (bez wapnia i magnezu) (Invitrogen, Carlsbad, CA)
3. 4% paraformaldehyd (Boston Bioproducts, Worcester, MA)
4. Pincety do mikrosekcji
5. Hydrofobowy marker do znakowania
6. Szklane laminki mikroskopowe
7. 0.25% Triton X-100 w fosforanie buforowanym roztworze soli.

Procedura:

1. Krótko opłucz eksplantaty w PBS zawierającym wapń i magnez.
2. Utrwal tkanki, dodając 4% paraformaldehyd na 30 minut w temperaturze pokojowej.
3. Usuń utrwalacz i zastąp go solą fizjologiczną z buforem fosforanowym. Utrwalone eksplantaty stają się nieco sztywniejsze, co pozwala na ich podniesienie i przeniesienie na szkiełka przedmiotowe w celu przeprowadzenia immunobarwienia.
4. Nanieś na szkiełko małą kroplę PBS (bez wapnia i magnezu), aby ułatwić ułożenie tkanki i zapobiec jej zwijaniu się. Używając pęsety do mikrodysekcji, podnieś eksplantat i umieść go w kropli na szkiełku. Nie dotykając eksplantatu, ostrożnie usuń nadmiar cieczy za pomocą papierowego knotka, aby spłaszczyć eksplantat na szkle, a następnie pozostaw tkankę do wyschnięcia na powietrzu w temperaturze pokojowej przez 3 do 5 minut.

Rycina 1 A. Nabłonek obwodowy wykazuje ekspresję białek specyficznych dla różnicowania. Przedstawiony eksplant został poddany immunostainacji w kierunku N-kadheryny bezpośrednio po mikrodysekcji. Ekspresja jest widoczna w pasmie komórek w nabłonku obwodowym, co wskazuje na rozpoczęcie procesu różnicowania komórek w tym regionie. B. Obwodowy nabłonek można przyciąć, aby usunąć komórki wykazujące ekspresję N-kadheryny oraz innych białek specyficznych dla różnicowania. Czerwony pierścień oznacza obszar występowania komórek wykazujących ekspresję N-kadheryny, natomiast mały kwadrat obwiedziony szarym kolorem reprezentuje ćwiartkę nabłonka przedstawioną na panelu 1A. Nabłonek obwodowy można usunąć za pomocą czterech cięć skalpelem, pozostawiając centralny kwadrat zawierający wyłącznie komórki, które nie rozpoczęły jeszcze procesu różnicowania.

Dyskusja

System eksplantów soczewki szczura był z sukcesem wykorzystywany przez wiele laboratoriów do badania terminalnego różnicowania się komórek nabłonka soczewki w włókna soczewki ^21,3,4,5. Po ekspozycji na FGF-2 w stężeniu 100ng/ml eksplanty zaczynają wykazywać zmiany w sygnalizacji w ciągu kilku minut ⁶, natomiast zmiany w morfologii i ekspresji genów pojawiają się sekwencyjnie w ciągu kilku dni ^3,4,5. Hodowle pozostają żywotne przez 2-3 tygodnie, pod warunkiem zachowania ostrożności w celu zapobiegania kontaminacji.

Wyjaśnione w niniejszym protokole eksplanty centralne są szczególnie użyteczne do badania sekwencji zdarzeń związanych z różnicowaniem, ponieważ zawierają niewiele lub żadnych komórek wykazujących ekspresję markerów różnicowania przed dodaniem FGF-2 ^1,5. Komórki różnicują się następnie synchronicznie, jako jedna grupa, co umożliwia śledzenie przebiegu czasowego zdarzeń sygnałowych i transkrypcyjnych związanych z różnicowaniem. Hodowla eksplantów przez różne okresy czasu dostarcza zatem dokładnych informacji czasowych na temat sekwencji zdarzeń. Do pożywki hodowlanej można dodać specyficzne inhibitory w celu zidentyfikowania istotnych szlaków sygnałowych. Eksplanty mogą być wykorzystywane do analizy ekspresji białek za pomocą elektroforezy w żelu SDS i immunoblotingu lub do analizy ekspresji specyficznych mRNA za pomocą RT-PCR. Wydajność białka wynosi od 20-50 μg/explant, a wydajność RNA wynosi około 200 – 600 ng/explant, w zależności od długości okresu hodowli. Zazwyczaj stwierdzamy, że 5-6 eksplantów na szalkę zapewni wystarczającą ilość białka lub RNA do przeprowadzenia kilku analiz. RNA z eksplantów może być również wykorzystane do przygotowania cDNA w celu oceny ekspresji genów za pomocą analizy mikromacierzy, która może zidentyfikować nowe geny krytyczne dla różnicowania. Eksplanty można również transfekować. Chociaż wydajność transfekcji jest zazwyczaj niska, jest ona wystarczająca do badania genów reporterowych ^4;7;8. Mikroskopia immunofluorescencyjna eksplantów stanowi użyteczne uzupełnienie metod biochemicznych, pozwalając na określenie subkomórkowej lokalizacji białek zainteresowania. Zatem preparatyka i hodowla eksplantów soczewki szczura stanowi potężny system do badania terminalnego różnicowania soczewki u ssaków, który może uzupełniać techniki in vivo, takie jak generowanie myszy transgenicznych i knock-out.