W tym filmie opisano metodę izolacji neuroprekursorów z rozwijającej się kory zarodków myszy. Przedstawiono procedurę usuwania zarodków z macicy, wycinania tkanki korowej oraz trawienia wyizolowanej kory mózgu.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Hodowla prekursorów neuronalnych komórek macierzystych myszy
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Pierwotne hodowle neuralnych komórek macierzystych są przydatne w badaniu mechanizmów leżących u podstaw rozwoju ośrodkowego układu nerwowego. Badania nad komórkami macierzystymi zwiększą naszą wiedzę na temat układu nerwowego i mogą pozwolić na opracowanie metod leczenia obecnie nieuleczalnych chorób i urazów mózgu. Ponadto komórki macierzyste powinny być wykorzystywane w badaniach ukierunkowanych na szczegółową analizę mechanizmów różnicowania i transróżnicowania neuralnego oraz sygnałów genetycznych i środowiskowych, które kierują specjalizacją komórek w konkretne typy komórkowe. Niniejszy film prezentuje technikę stosowaną do dysagregacji komórek z grzbietowej części przedmózgowia myszy w 12,5 dniu embrionalnym. Procedura sekcji obejmuje pobranie embrionów myszy E12.5 z macicy, usunięcie „skóry” za pomocą precyzyjnej pęsety i wreszcie wyizolowanie fragmentów kory mózgowej. Po sekcji tkanka zostaje poddana trawieniu i dysocjacji mechanicznej. Resuspensowane, zdysocjowane komórki są następnie hodowane w pożywce do „komórek macierzystych”, która sprzyja wzrostowi neuralnych komórek macierzystych.
Protokół
- Mysie prekursory neuronalne (NPCs) wyizolowano z kory zarodka w stadium E12.5.
- Warstwy skóry oraz mezenchymy usunięto z wypreparowanych pęcherzyków mózgowia przedniego.
- Pęcherzyki inkubowano przez 20 minut w temperaturze 37°C w 0,05% trypsynie z 0,02% EDTA i 0,2% BSA w HBSS.
- Trypsynizację przerwano, dodając równą objętość 1 mg/ml inhibitora trypsyny sojowej (Sigma #T6522) w HBSS.
- Trawione tkanki rozdzielono za pomocą kilku cykli trituracji przy użyciu wypalanych pipet Pasteura.
- Komórki przemyto raz w 0,2% BSA w HBSS i wysiano w zagęszczeniu 50 000 cells/ml na pokrywki szkiełkowe pokryte lamininą w pożywce zawierającej 20 ng/ml EGF, 10 ng/ml FGF2 (R&D Systems lub Peprotech) oraz 2 ug/ml heparyny (Sigma).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Znaczące postępy w rozumieniu rozwoju OUN oraz biologii komórek macierzystych stały się możliwe dzięki zdolności do pozyskiwania, izolowania i hodowli embrionalnych neuralnych komórek macierzystych. Niniejszy film prezentuje sekcję kory mózgowej myszy w stadium E12.5, a następnie dysagregację i hodowlę embrionalnych neuralnych komórek macierzystych. Wiele innych podobnych metod zostało z powodzeniem zastosowanych przez innych badaczy.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze | |
|---|---|---|---|---|
| Proste nożyczki irydologiczne | Narzędzie | Fine Science Tools | 14060-11 | |
| Nożyczki średnie | Narzędzie | Fine Science Tools | 15024-10 | |
| Mikronożyczki | Narzędzie | Fine Science Tools | 15002-08 | |
| Pinceta zakrzywiona | Narzędzie | Fine Science Tools | 11251-35 |
Bibliografia
- Currle, D., Cheng, X., Hsu, C., Monuki, E. Direct and indirect roles of CNS dorsal midline cells in choroid plexus epithelial formation. Development. 132 (15), 3549-3559 (2005).
- Flanagan, L., Rebaza, L., Derzic, S., Schwartz, P., Monuki, E. Regulation of human neural precursor cells by laminin and integrins. J Neurosci Res. 83, 845-856 (2006).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
