Profilowanie przeciwciał za pomocą systemów immunoprecypitacji lucyferazy (LIPS)

Podsumowanie

Opisano techniczne aspekty przeprowadzania metody LIPS (Luciferase Immunoprecipitation Systems). Ogólne podejście polega na ekspresji chimerycznych genów kodujących antygeny połączone z lucyferazą Renilla (Ruc) w komórkach ssaków. Następnie przygotowuje się surowe ekstrakty antygenów-Ruc, które bez oczyszczania są wykorzystywane w testach immunoprecypitacyjnych do ilościowego oznaczenia przeciwciał.

Streszczenie

Technologie służące do kompleksowego zrozumienia i ilościowego określania profili przeciwciał przeciwko autoantygenom i czynnikom zakaźnym mogą dostarczyć nowych informacji na temat mechanizmów chorób oraz pomóc w wyłonieniu nowych markerów do substratyfikacji schorzeń o różnych cechach klinicznych i lepszego zrozumienia patogenezy. Opracowaliśmy wysoce ilościową metodę o nazwie systemy immunoprecypitacji lucyferazy (LIPS) do profilowania odpowiedzi przeciwciał w surowicach pacjentów na autoantygeny oraz antygeny patogenów związanych z infekcją. W przeciwieństwie do testów ELISA, wysoce czuła metoda LIPS jest łatwa do wdrożenia w celu badania profili humoralnej odpowiedzi serologicznej na różne antygeny w uniwersalnym formacie i pozwala na uzyskanie dynamicznego zakresu miana przeciwciał do 6 log₁₀dla niektórych antygenów. W badaniach tych profilowanie ilościowe za pomocą LIPS w celu analizy humoralnych odpowiedzi pacjentów przeciwko panelom antygenów, a nawet całemu proteomowi niektórych patogenów (np. HIV), jest zazwyczaj bardziej informacyjne niż testowanie pojedynczego antygenu metodą ELISA. Ponadto LIPS eliminuje czas i wysiłek potrzebny na otrzymanie wysokiej czystości antygenów, a także pracochłonne etapy optymalizacji testów niezbędne w przypadku standardowych testów ELISA. Przedstawiamy tutaj szczegółowy protokół opisujący techniczne aspekty przeprowadzania analiz LIPS w celu sprawnego profilowania odpowiedzi przeciwciał na pojedyncze lub wiele antygenów.

Protokół

1. Schematyczny przegląd:

Niniejszy film demonstruje etapy przeprowadzania testu LIPS. Antygeny są ekspresjonowane w komórkach Cos1 jako białka rekombinowane Renilla fuzje lucyferazy (Ruc) z antygenem oraz uzyskuje się surowe ekstrakty, które są wykorzystywane bez oczyszczania. Analizę LIPS rozpoczyna się od inkubacji surowyche Ruc-antygen ekstrakty z surowicami pacjentów w dołkach mikropłytki. Mieszaninę przeciwciało-antygen przenosi się następnie na 96-dołkową płytkę filtrującą zawierającą kulki z białkiem A/G w celu wychwycenia cząsteczek IgG. Po przemyciu płytki filtrującej z kulkami z białkiem A/G mierzy się ilość związanego z przeciwciałem antygenu Ruc poprzez dodanie podłoża coelenterazynowego, a jednostki światła mierzy się za pomocą luminometru.

CZĘŚĆ 1: Transfekcja plazmidów w celu produkcji białek fuzyjnych Renilla-antygen

Przygotowanie: Komórki Cos1 są hodowane w pożywce DMEM z dodatkiem 10% FCS zgodnie ze standardowymi protokołami hodowli tkanek. Plazmidy dla fuzji lucyferazy Renilla zostały opisane wcześniej¹. DNA dla tych plazmidów jest przygotowywane przy użyciu zestawu Midiprep firmy Qiagen. Wydajność powinna wynosić około 1 -3 mg. Należy zmierzyć stężenie DNA i przechowywać jako roztwór zapasowy o stężeniu 1000 μg/ml w temperaturze -20°C.

Procedura:

1. Na jeden dzień przed transfekcją przesiać komórki Cos-1 do nowych szalek 100 x 20 mm w zagęszczeniu około 2 X 10⁶ na płytkę i inkubować w temperaturze 37 °C.
2. Następnego dnia komórki Cos-1 powinny osiągnąć 80-95% konfluencji. Oznaczyć polipropylenowe probówki do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml dla każdego plazmidowego DNA przeznaczonego do transfekcji. Pozostawić odczynnik do transfekcji FuGENE-6, przechowywany w temperaturze 4° C, do ogrzania do temperatury pokojowej.
3. Do każdej probówki dodać 94 μl pożywki Opti-MEM. Następnie dodać 6 μl FuGENE 6 do pożywki Opti-MEM, unikając dotykania ścianek naczynia.
4. Inkubować mieszaninę przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
5. Dodać 1-2 μg (z zapasu DNA 1mg/ml) plazmidu dla konstruktu fuzyjnego antygenu lucyferazy Renilla. Wymieszać, a następnie inkubować mieszaninę przez 15 minut w temperaturze pokojowej.
6. Przenieść roztwór DNA-FuGENE 6-Opti-MEM do komórek, rozprowadzając go równomiernie kroplami do pożywki z komórkami Cos1.

CZĘŚĆ 2: Pozyskiwanie fuzji antygenów z Renilla

1. Dwa dni po transfekcji zbiera się komórki Cos-1. Procedurę rozpoczyna się od usunięcia medium, a następnie przemycia komórek 6 ml PBS. Po zlaniu PBS należy odpipetować pozostałości tego roztworu z naczynia hodowlanego.
2. Dodaje się 1,4 ml zimnego buforu do lizy składającego się z 50 mM Tris, pH 7.5, 100 mM NaCl, 5 mM MgCl₂, 1% Triton X-100, 50% glicerolu oraz inhibitorów proteaz (2 tabletki kompletnego koktajlu inhibitorów miniproteaz na 50 ml buforu do lizy). Komórki zbiera się za pomocą skrobaka do komórek i szybko przenosi połowę lizatu do każdej z dwóch probówek do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml, umieszczonych w lodzie.
3. Do rozbicia komórek używa się sonifikatora Branson Sonifier 150. Probówkę do mikrowirówki zawierającą lizat komórkowy umieszcza się w lodzie i poddaje sonikacji w trzech impulsach po 5 s, 5 s i 5 s, przy ustawieniach sonikacji odpowiednio 2, 2 i 4.
4. Lizat komórkowy wiruje się przy 12 500 RPM w dwóch cyklach po 4 minuty w temperaturze 4 °C. Po pierwszym wirowaniu należy delikatnie odwrócić probówki, aby usunąć luźno przylegające zanieczyszczenia ze ścianek probówki. Po drugim wirowaniu ostrożnie przenosi się nadosad, nie naruszając osadu, z obu probówek do nowej probówki do mikrowirówki w lodzie.
5. Oblicza się jednostki światła (LU) na μl lizatu. Aby zmierzyć LU, 1 μl lizatu rozcieńcza się 8 μl PBS w nowej probówce do mikrowirówki. Bezpośrednio do rozcieńczonej mieszaniny dodaje się 100 μl podłoża coelenterazyny 1X i natychmiast mierzy się luminescencję w probówce za pomocą luminometru do probówek (20/20ⁿ Turner Scientific) z czasem odczytu 5 s.
6. Lizat antygenu Ruc przechowuje się w temperaturze -20° C przez 1-2 dni lub przez dłuższy czas w alikwotach w temperaturze -80° C.

CZĘŚĆ 3: Przygotowanie płytki matrycowej z surowicami

1. Przygotuj płytkę główną z surowicą, dodając najpierw 450 μl buforu A (50 mM Tris, pH 7.5, 100 mM NaCl, 5 mM MgCl₂, 1% Triton X-100) do każdego dołka polipropylowej płytki mikrotitracyjnej z 96 głębokimi dołkami. Na tym etapie do buforu A można dodać barwnik, czerwień fenolową (stężenie końcowe w buforze A wynosi 0,2 μg/ml), który będzie służył jako znacznik do monitorowania późniejszego dodawania próbek surowicy i innych etapów analizy LIPS.
2. Następnie dodaj 50 μl surowicy z każdej próbki do poszczególnych dołków zawierających 450 μl buforu A. Należy odnotować, że jest to rozcieńczenie surowicy w buforze A w stosunku 1:10. Zazwyczaj surowicy nie dodaje się do dwóch ostatnich dołków płytki głównej, ponieważ są one zarezerwowane dla próbek ślepych z samym buforem.
3. Przed użyciem płytka główna jest intensywnie wstrząsana (przez 1-2 godziny) na platformie rotacyjnej. Surowica w płytce głównej jest stabilna przez co najmniej 1 miesiąc (lub dłużej) w temperaturze 4° C, pod warunkiem prawidłowego przechowywania w celu zapobiegania odparowaniu.
4. Jak opisano poniżej, płytka główna dostarcza po 10 μl rozcieńczonej surowicy, które są wielokrotnie pobierane w celu profilowania surowicy przeciwko wielu antygenom. Można stosować również większe lub mniejsze płytki główne. Gdy płytka nie jest używana, należy ją szczelnie zabezpieczyć Parafilmem.

CZĘŚĆ 4: Analiza LIPS

1. Do badania surowic wykorzystuje się polipropylenowe płytki mikrotitracyjne z 96 płytkimi dołkami. W pierwszym kroku, za pomocą mikropipety 8-kanałowej, należy dodać 40 μl buforu A do każdego dołka płytki 96-dołkowej.
2. Następnie należy pobrać 10 μl rozcieńczonej surowicy (ekwiwalent 1 μl surowicy) z płytki matki i przenieść bezpośrednio do każdego dołka płytki roboczej za pomocą mikropipety 8-kanałowej.
3. Następnie przygotowuje się mieszaninę główną (master mix) zawierającą ekstrakt antygenu Ruc w taki sposób, aby do każdego dołka dodać 1 X 10⁷ jednostek świetlnych (LU) w 50 μl buforu A. Można zastosować mniejsze ilości (nawet 1 X 10⁶), co jednak skutkuje niższym zakresem dynamicznym. Po przygotowaniu mieszaniny głównej należy pipetować 50 μl mieszaniny antygenu Ruc do każdego dołka.
4. Płytkę inkubuje się na wytrząsarce obrotowej przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
5. Podczas inkubacji, do dna każdego dołka nowej płytki filtracyjnej HTS z 96 dołkami (Millipore, Bedford, MA) należy dodać 5 μl 30% zawiesiny kulek Ultralink protein A/G (Pierce Biotechnology, Rockford, IL) w PBS.
6. Po 1-godzinnej inkubacji, za pomocą mikropipety 8-kanałowej, należy przenieść 100 μl mieszaniny reakcyjnej antygenu Ruc i przeciwciał na płytki filtracyjne HTS z 96 dołkami zawierające kulki białka A/G.
7. Płytkę filtracyjną 96-dołkową inkubuje się na wytrząsarce obrotowej przez dodatkową 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
8. Następnie płytkę filtracyjną przemywa się na manifoldzie próżniowym. Każdy dołek należy przemyć 8 razy 100 μl buforu A, a następnie dwukrotnie 100 μl PBS. Można to przeprowadzić ręcznie lub za pomocą robotycznej stacji pipetującej.
9. Po ostatnim płukaniu należy wyłączyć próżnię. Płytkę filtracyjną wyjmuje się i osusza za pomocą ręczników papierowych lub papieru filtracyjnego, dbając o usunięcie wilgoci z górnej i dolnej części płytki.

CZĘŚĆ 5: Pomiar luminescencji i analiza danych

Przygotowanie:

Do pomiaru luminescencji w każdej studzience przy użyciu pojedynczego wtryskiwacza wykorzystuje się luminometr do mikropłytek Berthold LB 960 Centro. Po włączeniu urządzenia należy przepłukać wtryskiwacz wodą destylowaną H₂O, korzystając z cyklu mycia wtryskiwacza. Podłoże z koelenterazyną przygotowuje się przy użyciu zestawu do podłoży Renilla firmy Promega zgodnie z instrukcją producenta. Zazwyczaj przygotowuje się 6 ml mieszaniny podłoża z koelenterazyną 1X (tj. 60 μl roztworu zapasu koelenterazyny oraz 6 ml buforu 1X), co wystarcza do przygotowania urządzenia i przebadania jednej pełnej płytki 96-dołkowej. Przed analizą płytki luminometr do mikropłytek Berthold LB 960 Centro należy nasycić podłożem z koelenterazyną 1X. Należy otworzyć plik programu zawierający ustawienia wtryskiwania podłoża i odczytu płytki. W przypadku tych pomiarów wtryskuje się 50 μl podłoża z koelenterazyną, płytkę wstrząsa się przez 2 sec, a następnie przeprowadza 5-sekundowy odczyt luminescencji.

1. Chociaż luminometr do płytek posiada możliwość odczytu całej płytki, można również wybrać odczyt częściowy (w menu odczytu). Uruchom program, aby rozpocząć odczyt płytki.
2. Po zakończeniu pomiaru niezwłocznie wyjmij mikrofiltracyjną płytkę miareczkową, aby zapobiec rozlaniu cieczy w luminometrze. Wyeksportuj dane wygenerowane w programie MikroWin do formatu Excel w celu przeprowadzenia analizy.
3. Zaleca się ocenę surowic w dwóch niezależnych seriach pomiarowych. Dane są następnie uśredniane, aby uzyskać wartości miana w LU dla każdej próbki. Wartości te mogą być dalej korygowane poprzez odjęcie wartości tła dla buforu.
4. Dodatkową analizę danych, taką jak wyznaczenie wartości odcięcia (cutoff), można przeprowadzić, obliczając średnią powiększoną o 3 lub 5 odchylenia standardowe wartości kontrolnych.

Dyskusja

Metoda LIPS wymaga minimalnej optymalizacji testu i dzięki swojej prostocie zazwyczaj pozwala na uzyskanie wysokiej jakości danych w czasie krótszym niż dwa tygodnie dla dowolnego antygenu. Najbardziej czasochłonnymi etapami są klonowanie i generowanie odpowiedniego plazmidowego wektora ekspresyjnego zawierającego fuzję Ruc-antygen. Po przygotowaniu tych plazmidów można szybko przebadać za pomocą LIPS pojedyncze lub wiele antygenów zgodnie z powyższym opisem. Należy zauważyć, że LIPS jest bardzo wszechstronny, dzięki czemu surowice można testować również w formacie probówkowym lub alternatywnie na mikrotitracyjnej płycie filtracyjnej z pomocą robota BIOMEK² lub myjki do płytek z filtracją próżniową. Ten wysoce skalowalny system umożliwia równoległe profilowanie LIPS panelu ludzkich autoantygenów³ lub całego proteomu wirusa⁴. Prawdopodobnie wiele różnych profili przeciwciał generowanych przez LIPS znajdzie zastosowanie w diagnostyce^3-9, odkrywaniu antygenów⁹, śledzeniu przebiegu leczenia¹⁰ oraz monitorowaniu szczepionek, co ma szerokie implikacje dla konkretnych stanów chorobowych i zdrowia publicznego w ogóle.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Zestaw HiSpeed Plasmid Midi Kit	Qiagen	12643
Szalki do hodowli tkankowej 100 x 20 mm	Fisher Scientific	353003
Opti-MEM	Invitrogen	31985
FuGENE 6	Roche Group	1814443
Kompletny, mini koktajl inhibitorów proteaz	Roche Group	11836153001
Polipropylenowa płytka 96-dołkowa DeepWell 1 ml	Fisher Scientific	12-566-120	Płytka głęboko dołkowa z pokrywką i uszczelnieniem z Parafilmu
Polipropylenowa płytka mikrotytrowa	Fisher Scientific	12-566-120
Płytka filtrująca HTS	EMD Millipore	MSBVN1B50
Ultralink Immobilized Protein A/G	Pierce, Thermo Scientific	53133 (10ml)
System do analizy lucyferazy Renilla	Promega Corp.	E2820	Na 2000 analiz
Luminometr do mikro płytek Centro	Berthold Technologies	LB 960