Enkapsulacja komórkowa w hydrożelach 3D dla inżynierii tkankowej

Summary

Przedstawiamy protokoły do trójwymiarowej (3D) enkapsulacji komórek w syntetycznych hydrożelach. Procedura enkapsulacji jest opisana dla dwóch powszechnie stosowanych metod sieciowania (addycja typu michaela i mechanizmy wolnych rodników inicjowanych światłem), a także szereg technik oceny zachowania komórek otoczonych kapsułkami.

Abstract

Enkapsulacja 3D komórek w hydrożelach stanowi coraz ważniejszą i popularniejszą technikę hodowli komórek i rozwoju konstruktów dla inżynierii tkankowej. Środowisko to lepiej naśladuje to, co komórki obserwują in vivo, w porównaniu ze standardową hodowlą tkankową, ze względu na właściwości podobne do tkanek i środowisko 3D. Syntetyczne hydrożele polimerowe to nabrzmiałe wodą sieci, które można zaprojektować tak, aby były stabilne lub ulegały degradacji w wyniku hydrolizy lub proteolizy, gdy nowa tkanka jest osadzana przez zamknięte komórki. Do tych zastosowań zbadano szeroką gamę polimerów, takich jak poli(glikol etylenowy) i kwas hialuronowy. Najczęściej polimer jest funkcjonalizowany grupami reaktywnymi, takimi jak metakrylany lub akrylany, zdolne do sieciowania przez różne mechanizmy. W ciągu ostatniej dekady poczyniono znaczne postępy w inżynierii tych mikrośrodowisk - np. poprzez fizyczną lub wiszącą kowalencyjną inkorporację sygnałów biochemicznych - w celu poprawy żywotności i bezpośredniego fenotypu komórkowego, w tym różnicowania zamkniętych w kapsułkach komórek macierzystych (Burdick i wsp.).

Następujące metody enkapsulacji komórek 3D zostały zoptymalizowane w naszych i innych laboratoriach, aby zmaksymalizować cytokompatybilność i zminimalizować liczbę etapów przetwarzania hydrożelu. W poniższych protokołach (patrz rysunek 1 w celu zilustrowania procedury) zakłada się, że funkcjonalizowane polimery zdolne do sieciowania są już w dyspozycji; doskonałe przeglądy chemii polimerów w zastosowaniu w dziedzinie inżynierii tkankowej można znaleźć gdzie indziej (Burdick i wsp.), a metody te są kompatybilne z wieloma typami polimerów. Co więcej, addycja typu Michaela (patrz Lutolf i wsp.) oraz inicjowane światłem mechanizmy wolnych rodników (patrz Elisseeff i wsp.), na których się tutaj skupiamy, stanowią tylko niewielką część zgłoszonych technik sieciowania. Sieciowanie w trybie mieszanym, w którym część grup reaktywnych jest najpierw zużywana przez sieciowanie addycyjne, a następnie następuje mechanizm radykalny, jest kolejnym powszechnie stosowanym i potężnym paradygmatem kierowania fenotypem zamkniętych komórek (Khetan i wsp., Salinas i wsp.).

Protocol

A. Przygotowanie materiału i sterylizacja

1. Przed przygotowaniem materiałów do kapsułkowania należy przygotować 0,5% wagowy roztwór fotoinicjatora Irgacure 2959 (I2959) w roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS), mieszając i inkubując przez kilka dni w temperaturze 37°C. Roztwór można następnie przefiltrować strzykawką w celu sterylizacji i przechowywać w temperaturze pokojowej do długotrwałego użytkowania.
2. Na podstawie pożądanego składu żeli, które mają być zsyntetyzowane, oblicz (za pomocą programu arkusza kalkulacyjnego, takiego jak Microsoft Excel) potrzebną masę polimeru i środka sieciującego. Ponieważ dana masa polimeru musi zostać rozpuszczona w określonej objętości całkowitej, aby osiągnąć pożądane stężenie w hydrożelach, za pomocą arkusza kalkulacyjnego należy również określić części środka sieciującego i roztworu polimeru w całkowitej objętości żelu. Podobne obliczenia należy wykonać, jeśli jakiekolwiek ugrupowania wiszące (np. adhezyjny RGD lub YGSR zawierający oligopeptyd) mają być włączone przed sieciowaniem.
3. Odważ wymaganą ilość polimeru i środka sieciującego i umieść w probówkach Eppendorfa. Dostosuj odpowiednio arkusz kalkulacyjny do rzeczywistej masy uzyskanego polimeru. (Uwaga: objętości można zmieniać, aby skompensować rzeczywistą masę uzyskanego polimeru i środka sieciującego).
4. Przygotuj formy żelowe za pomocą żyletki, aby odciąć wierzchołki pojedynczo zapakowanych sterylnych jednorazowych strzykawek o pojemności 1 ml. Upewnij się, że wykonane jest płaskie cięcie dla form, które mają być używane do żeli z fotowzorem.
5. Umieść foremki do strzykawek, probówki Eppendorfa (z otwartymi nakrętkami) i wszelkie inne niezbędne materiały pod bakteriobójczym źródłem światła (zwykle wbudowanym w komory bezpieczeństwa biologicznego) i sterylizuj przez 30 minut.

B. Przygotowanie komórek

1. Po sterylizacji dodaj odpowiednią objętość sterylnego buforu (zgodnie z obliczeniami arkusza kalkulacyjnego; chociaż wybór buforu może się różnić, PBS i słaby bufor zasadowy, taki jak trietanoloamina, są zwykle używane odpowiednio do sieciowania wolnych rodników i typu michaela) do polimeru Eppendorf i (opcjonalnie) ugrupowania wisiorka, które należy dołączyć (np. peptyd adhezyjny) i wiru do rozpuszczenia (w przypadku wirowania na zewnątrz sterylnego kaptura owiń Eppendorf parafilmem).
2. Dodać odpowiednią objętość roztworu ugrupowania wisiorka do roztworu polimeru i owinąć uszczelkę parafilmem. Krótko wirować i inkubować w temperaturze 37°C, aby zareagować (jeśli to możliwe, na obrotowej płytce mieszającej) podczas przygotowywania komórek. Polega to na reakcji tiolu na peptyd (poprzez grupę cysteinową) z akrylanem lub metakrylanem, tak że peptyd jest zawarty jako grupa wisząca w końcowym hydrożelu.
3. Trypsynizuj i policz komórki, a następnie podziel na porcje zawierające odpowiednią liczbę dla każdego zestawu żeli. Na przykład, w przypadku zestawu trzech żeli o objętości 50 μl o gęstości 10 milionów komórek/ml, oddziel 1,5 miliona komórek w pojedynczą stożkową probówkę. Zaleca się, aby nie przygotowywać więcej niż 4 żele w pojedynczym zestawie ze względu na czas żelowania (uwaga: w przypadku syntezy wielu zestawów żeli można przygotować jeden Eppendorf zawierający odpowiednią objętość roztworu polimeru dla wszystkich zestawów).
4. Odwirować komórki.
5. Podczas gdy komórki się obracają
   1. Sieciowanie wolnorodnikowe inicjowane światłem: dodać 0,5% wag. roztworu I2959 do roztworu polimeru równego 10% całkowitej objętości zestawu żelu (dla końcowego stężenia inicjatora 0,05% wag.).
   2. Sieciowanie typu Michaela (addycyjne): dodać bufor do środka sieciującego, aby uzyskać roztwór o odpowiednim stężeniu.
   3. Do sieciowania sekwencyjnego: żele te łączą oba rodzaje sieciowania i wymagają obu poprzednich kroków.

C. Tworzenie hydrożelu

1. Odessać supernatant z odwirowanej części komórkowej. Poczekaj, aż płyn opadnie po początkowej aspiracji i ponownie zaaspiruj, aby usunąć jak najwięcej pożywki bez naruszania osadu komórkowego.
2. Ponownie zawiesić osad komórkowy z roztworem polimeru, aż komórki zostaną równomiernie rozłożone. Zminimalizuj tworzenie się pęcherzyków, powoli pipetując roztwór w górę iw dół (około 10 cykli powinno wystarczyć do rozprowadzenia komórek).
3. Hydrożele sieciujące
   1. Sieciowanie wolnorodnikowe inicjowane światłem: Porcjować odpowiednią objętość do form końcówek strzykawek. Wystawić strzykawki na działanie światła UV w celu radykalnego sieciowania (np. 10-minutowa ekspozycja na światło UV 365 nm, 4 mW/cm2 jest powszechne w przypadku polimerów funkcjonalizowanych akrylanem). Ten krok należy wykonać szybko, aby zminimalizować osadzanie się komórek przed ekspozycją na światło UV.
   2. Sieciowanie typu Michaela (dodawanie): Za pomocą końcówki pipety z szerokim otworem dodaj odpowiednią objętość roztworu sieciującego do roztworu polimeru/komórki, ustaw pipetę na żądaną indywidualną objętość żelu, pipetuj roztwór w górę iw dół do homogenizacji i wlej do formy końcówki strzykawki. Ten krok należy wykonać szybko, aby zapewnić równomierne rozmieszczenie komórek. Odczekać 10-30 minut (w zależności od indywidualnego systemu) inkubację w kapturze hodowlanym w celu sieciowania.
   3. Sieciowanie sekwencyjne: Polega to najpierw na reakcji dodawania typu Michaela, a następnie na wystawieniu na działanie światła w celu drugiego sieciowania. Podczas pierwszego sieciowania należy zareagować tylko ułamek teoretycznych usieciowań, a następnie sterylną maskę należy nałożyć bezpośrednio na powierzchnię żelu przed ekspozycją na światło za pomocą wysterylizowanej pęsety. Funkcjonalizowany barwnik (np. metakrylanowana rodamina (MeRho) o końcowym stężeniu w żelu 20 nM) może być również dodany do roztworu początkowego w celu wizualizacji wzoru, ponieważ będzie on włączał się preferencyjnie w radykalnie usieciowanych obszarach żelu (ryc. 2).

D. Hodowla i analiza komórkowa

1. Po usieciowaniu zanurz żele w studzienkach płytki do hodowli tkankowej zawierającej pożywki do inkubacji i analizy (patrz poniższe kroki).
2. Komórki można wizualizować pod kątem morfologii za pomocą mikroskopii świetlnej (ryc. 3; zazwyczaj zsyntetyzowane hydrożele są przezroczyste) i żywotności za pomocą fluorescencyjnego zestawu do barwienia żywego/martwego (ryc. 3 i 4). Barwienie aktyny komórkowej (np. rodaminy lub fluoresceiny znakowanej falloidyną) i jąder (np. 4'-6-Diamidino-2-fenyloindolu (DAPI)) można przeprowadzić przy użyciu standardowych procedur utrwalania i przepuszczalności (ryc. 4) zgodnie z następującą procedurą.
   1. Płukać konstrukcje 3X przez 5 minut PBS.
   2. Utrwal żele przez inkubację w 1 ml 4% formaldehydu przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
   3. Przepłukać konstrukty 3X roztworem blokującym zawierającym 3% (w/v) BSA i 0,5% (w/v) Tween w PBS.
   4. Przepuszczalność membrany z 0,25% (w/v) Triton X w roztworze blokującym przez 20 min.
   5. Spłucz konstrukty 3X roztworem blokującym.
   6. Barwienie F-aktyny 0,66 μg/ml FITC lub falloidyny rodaminy w roztworze blokującym przez dwie godziny w temperaturze pokojowej.
   7. Spłucz 3x roztworem blokującym.
   8. Wybarwić jądra komórkowe za pomocą 0,4 μl/ml DAPI w PBS przez 20 min.
   9. Spłucz 3X PBS.
   10. Wizualizacja komórek za pomocą mikroskopii epifluorescencyjnej lub konfokalnej.
3. Proliferacja komórek w żelach jest powszechnie oceniana za pomocą dostępnych na rynku testów (np. całkowitego DNA lub zawartości biochemicznej). PicoGreen jest powszechnie stosowanym i czułym fluorescencyjnym barwnikiem kwasu nukleinowego do ilościowego oznaczania dwuniciowego DNA (Singer i wsp.). Komórki mogą być również zliczane i normalizowane do początkowej liczby kontrolnej przy użyciu metod wizualizacji opisanych w kroku 2.
4. Sekcje histologiczne i barwienie mogą być również wykorzystywane do wizualizacji komórek i utworzonej macierzy. Do uzyskania przekrojów poprzecznych na szkiełkach można zastosować następujący protokół odwadniania i dzielenia hydrożeli 3D:
   1. Utrwalenie i odwodnienie
      1. Przepłukać próbkę 3X w PBS.
      2. Utrwalaj przez 5 - 30 minut w 4% paraformaldehydzie.
      3. Przepłukać próbkę 3X w PBS.
      4. Inkubować próbkę w EtOH w temperaturze 25°C przez 1 godzinę przy każdym z następujących stężeń EtOH (v/v) w wodzie (w kolejności): 50%, 70%, 95%, 95%, 100% (w tym momencie próbki można przechowywać przez noc w temperaturze 25°C).
   2. Czyszczenie i infiltracja
      1. Przenieś do 100% Citrisolv na 1 godzinę w temperaturze 25°C, a następnie na godzinę w temperaturze 65°C.
      2. Przeciąć próbki na pół żyletką na szalce Petriego w taki sposób, aby przekrój poprzeczny próbki był odsłonięty.
      3. Przenieść do mieszaniny 1:1 Citrisolv/Micro-cut Paraffin na 1 godzinę w temperaturze 65°C.
      4. Przenieś do 100% mikro-ciętej parafiny na 1 godzinę w temperaturze 65°C.
      5. Przenieś na noc do 100% Micro-cut Paraffin w temperaturze 65°C.
      6. Przenieś do 100% Micro-cut Paraffin na 1-2 godziny w temperaturze 65°C.
   3. Osadzanie
      1. Umieść próbkę w odklejanej formie ze 100% parafiną.
      2. Umieść niewielką ilość wosku w łożu formy i włóż dwie połówki próbki przekrojem skierowanym w dół.
      3. Zastosuj górny element filtra
         1. Dodaj dodatkowy wosk, aby zanurzyć górną część i pozostaw do stwardnienia na ~10 minut.
      4. Przenieś wkładki do lodówki o temperaturze 4°C, aby próbka stwardniała przez noc.
      5. Próbka może być podzielona na sekcje następnego dnia, zwykle o grubości 5-10 μm na plaster przy użyciu dostępnych na rynku mikrotomów. Zazwyczaj forma do odklejania jest montowana pionowo względem stolika mikrotomowego, a ręczne elementy sterujące służą do ustawiania grubości sekcji, krajalnicy i wyrównania próbki z ostrzem.
   4. Ekstrakcja RNA
      
      Ekspresję genów można również ocenić ilościowo (np. za pomocą reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR) w czasie rzeczywistym). Protokół ekstrakcji RNA z hydrożeli 3D, którego przykład podano poniżej, jest zupełnie inny niż w znacznie prostszym przypadku 2D.
      1. Oznacz certyfikowaną probówkę Eppendorfa wolną od RNA dla każdego hydrożelu 3D i dodaj 500 μl odczynnika Trizol® do każdej probówki.
      2. Za pomocą tłuczka (młynka do chusteczek) ręcznie zmielić hydrożele, aż do uzyskania klarownego roztworu. Upewnij się, że do każdego stanu używane są różne młynki.
      3. Wirować każdy Eppendorf przez 20 sekund, aby homogenizować próbki.
      4. Inkubować próbki w temperaturze pokojowej przez pięć minut, aby umożliwić całkowitą dysocjację kompleksów nukleoproteinowych.
      5. Schłodzić próbki na lodzie przez 20 minut
      6. Dodać 200 μl (na ml trizolu) chloroformu do każdej próbki i odwirować.
      7. Próbki inkubować w temperaturze pokojowej przez pięć minut.
      8. Odwirować próbki o masie 12 000 x g w temperaturze 4°C przez 15 minut.
      9. Przenieś fazę wodną (przezroczysta górna warstwa) do nowych probówek Eppendorfa (unikając obszaru międzyfazowego i dolnej czerwonej fazy fenolowo-chloroformowej). RNA pozostaje w klarownej fazie wodnej.
      10. Można teraz stosować powszechne techniki izolacji i przechowywania RNA.
      11. Po ekstrakcji RNA często stosuje się dostępne na rynku zestawy do odwrotnej transkryptazy i PCR w czasie rzeczywistym z pewnymi modyfikacjami (Elisseff i wsp., Strehin i wsp.).

Reprezentatywne wyniki:

Zobacz rysunki 2-4 (jak odwołują się do powyższych protokołów), aby uzyskać reprezentatywne wyniki wizualizacji fotowzorzystych hydrożeli i enkapsulacji komórek w żelach.

Rysunek 1. Przegląd procedury enkapsulacji 3D. Kroki diagramu odpowiadają tytułom sekcji w protokołach krokowych.

Rysunek 2. Hydrożel fotowzorzysty z zastosowaniem sekwencyjnej addycji typu Michaela, a następnie polimeryzacji rodnikowej. (A) Schemat fotomodelingu częściowo usieciowanego hydrożelu z włączeniem barwnika fotoreaktywnego. (B) Okrągła lub (C) przezroczysta maska z przezroczystej folii z wzorem hydrożeli kwasu hialuronowego. Metakrylanowana rodamina (MeRho) jest włączana tylko w obszarach żelu, które były wystawione na działanie światła. Podziałka = 100 μm.

Rysunek 3. Wizualizacja komórek w hydrożelach 3D. Komórki macierzyste uwidocznione za pomocą (a) mikroskopii świetlnej lub (b) żywe (zielone, Calcein AM) i martwe (czerwone, Ethidium homodimer-1) barwienie 24 godziny po enkapsulacji w 1 milionie komórek/ml w hydrożelu kwasu hialuronowego usieciowanym przez zainicjowany światłem mechanizm wolnych rodników. Podziałka = 100 μm.

Rysunek 4. Wizualizacja komórek w hydrożelach 3D. hMSC barwione pod kątem (a) żywych komórek (Calcein AM) lub (b) aktyny komórkowej (rodaminy, falloidyny) i jąder (DAPI) pięć dni po enkapsulacji w 1 milionie komórek/ml w hydrożelu kwasu hialuronowego usieciowanym przez mechanizm typu Michaela (przy użyciu peptydów adhezyjnych do wisiorków i dwufunkcyjnych proteolitycznie degradowalnych peptydów sieciujących). Podziałka = 100 μm.

Discussion

Opisane protokoły reprezentują prostą i potężną metodę hermetyzacji komórek w rusztowaniach hydrożelowych w sposób cytozgodny. Takie techniki są szczególnie ważne, ponieważ nieuleczalnie zróżnicowane komórki macierzyste mogą wykazywać znacznie inne zachowanie w mikrośrodowiskach 2D i 3D. Nawet w przypadku podejść terapeutycznych obejmujących implantację materiałów (np. polimeryzacja rodnikowa in situ), enkapsulacja komórek i analiza pod kątem żywotności i różnicowania mogą pomóc w procesie rozwoju materiału. Opisany proces sekwencyjny może być wykorzystany do przestrzennego manipulowania środowiskiem hydrożelu, a w konsekwencji zachowaniem komórek (patrz Khetan i wsp.).

Ogólnie rzecz biorąc, najbardziej krytycznym elementem opisanych protokołów jest jednorodność wszystkich zastosowanych rozwiązań. W szczególności należy zwrócić szczególną uwagę na to, aby komórki były równomiernie rozmieszczone w roztworze prepolimeru oraz aby roztwór był dobrze wymieszany przez ponowne zawieszenie pipety po dodaniu roztworu sieciującego. Niezapewnienie tego może prowadzić do zlepiania się komórek lub miejscowych zmian w strukturze żelu i obrzęku.

Chociaż przedstawione tutaj protokoły koncentrują się przede wszystkim na procedurze enkapsulacji komórek, ważne jest również, aby pamiętać, że enkapsulacja może wymagać pewnego dostosowania do protokołów analizy, które są zwykle pisane dla rozsiewu 2D. Zilustrowano kilka przykładów wizualizacji i oceny komórek w hydrożelach.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
I2959	Odczynnik	Ciba Specialty Chemicals.2
M Odczynnik buforowy trietanoloaminy		Sigma-Aldrich	T0449
PBS	Odczynnik	Invitrogen	14040-117	1x, sterylny płyn
Zestaw do barwienia na żywo / martwego	Odczynnik	Invitrogen	L3224	Zawiera sondy żywe (Calcein AM) i martwe (homodimer-1 etydyny-1)
Odczynnik Phalloidin-FITC		Sigma-Aldrich	P5282
Odczynnik do farnodyny rodaminy		Odczynnik Invitrogen	R415
Odczynnik DAPI		Sigma-Aldrich	D9542
Odczynnik Metakryloksyloksyetylotiokarbamoyl Rodamina B (MeRho)		Polysciences, Inc.	23591
Odczynnik albuminy surowicy bydlęcej		Sigma-Aldrich	A7030
Tween 20	Odczynnik	Sigma-Aldrich	P1379
Triton X-100		Odczynnik Sigma-Aldrich	T8787
Citrisolv		Fisher Scientific	22-143975
Odczynnik		parafinowy do mikrocięciaPolysciences, Inc.	24202
Odczynnik Trizol	Odczynnik	Invitrogen	15596-026
0,22 μ Nylonowe filtry strzykawkowe o wielkości porów	Sprzęt	Fisher Scientific	09-719C
Jednorazowe strzykawki 1 ml	Sprzęt	BD Biosciences	309602	Wytnij strzykawki na stałej wysokości do ekspozycji na promieniowanie UV
Końcówki do pipet z szerokim otworem	Wyposażenie	Sigma-Aldrich	P6800
Omnicure UV Spot Cure System z filtrem 365 nm	Sprzęt	EXFO	S1000
Bakteriobójcze źródło światła UV 254 nm	Sprzęt			Wbudowany w większość szaf bezpieczeństwa biologicznego