Artykuł metodologiczny

Enkapsulacja komórkowa w trójwymiarowych hydrożelach w inżynierii tkankowej

38.6K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/1590

⸱

26 października 2009

 , 
1Department of Bioengineering, University of Pennsylvania , 2Department of Bioengineering, University of Pennsylvania-School of Medicine

W tym artykule

Podsumowanie

Prezentujemy protokoły trójwymiarowej (3D) enkapsulacji komórek w syntetycznych hydrożelach. Procedura enkapsulacji została opisana dla dwóch powszechnie stosowanych metod sieciowania (addycji typu Michaela oraz mechanizmów wolnorodnikowych inicjowanych światłem), a także dla szeregu technik oceny zachowania enkapsulowanych komórek.

Streszczenie

Trójwymiarowa enkapsulacja komórek w hydrożelach stanowi coraz ważniejszą i popularniejszą technikę hodowli komórkowej oraz rozwoju konstruktów do inżynierii tkankowej. Środowisko to, dzięki właściwościom przypominającym tkankę i strukturze 3D, lepiej naśladuje warunki, w jakich komórki znajdują się in vivo, w porównaniu do standardowych hodowli tkankowych. Syntetyczne hydrożele polimerowe to pęczniące w wodzie sieci, które mogą być zaprojektowane tak, aby były stabilne lub ulegały degradacji poprzez hydrolizę lub proteolizę w miarę odkładania nowej tkanki przez enkapsulowane komórki. W tych zastosowaniach zbadano szeroką gamę polimerów, takich jak poli(glikol etylenowy) i kwas hialuronowy. Najczęściej polimer jest funkcjonalizowany grupami reaktywnymi, takimi jak metakrylany lub akrylany, zdolnymi do sieciowania poprzez różne mechanizmy. W ciągu ostatniej dekady poczyniono znaczne postępy w inżynierii tych mikrośrodowisk – np. poprzez fizyczne lub kowalencyjne wprowadzenie sygnałów biochemicznych – w celu poprawy żywotności i kierowania fenotypem komórkowym, w tym różnicowaniem enkapsulowanych komórek macierzystych (Burdick et al.).

Poniższe metody trójwymiarowej enkapsulacji komórek zostały zoptymalizowane w naszym oraz innych laboratoriach w celu maksymalizacji cytokompatybilności i zminimalizowania liczby etapów przetwarzania hydrożelu. W następujących protokołach (ilustracja procedury znajduje się na Rysunku 1) przyjmuje się, że funkcjonalizowane polimery zdolne do sieciowania zostały już przygotowane; doskonałe przeglądy chemii polimerów w zastosowaniu do inżynierii tkankowej można znaleźć w innych publikacjach (Burdick et al.), a opisane metody są kompatybilne z szeroką gamą typów polimerów. Ponadto, omówione tutaj mechanizmy, takie jak addycja typu Michaela (patrz. Lutolf et al.) oraz wolnorodnikowe sieciowanie inicjowane światłem (patrz. Elisseeff et al.), stanowią jedynie niewielką część opisanych technik sieciowania. Sieciowanie mieszane, w którym część grup reaktywnych jest najpierw zużywana w procesie sieciowania addycyjnego, a następnie następuje mechanizm rodnikowy, to kolejny powszechnie stosowany i skuteczny paradygmat służący do kierowania fenotypem enkapsulowanych komórek (Khetan et al., Salinas et al.).

Protokół

A. Przygotowanie i sterylizacja materiałów

  1. Przed przygotowaniem materiałów do enkapsulacji przygotować 0,5 wt% roztwór fotoinicjatora Irgacure 2959 (I2959) w soli fizjologicznej z buforem fosforanowym (PBS), mieszając i inkubując przez kilka dni w 37°C. Roztwór można następnie przefiltrować za pomocą strzykawki w celu sterylizacji i przechowywać w temperaturze pokojowej do długotrwałego użytku.
  2. Na podstawie pożądanego składu syntetyzowanych żeli obliczyć (za pomocą programu do arkuszy kalkulacyjnych, np. Microsoft Excel) masę potrzebnego polimeru i sieciowania. Ponieważ określona masa polimeru musi zostać rozpuszczona w zdefiniowanej objętości całkowitej, aby uzyskać pożądane stężenie w hydrożelach, za pomocą arkusza kalkulacyjnego należy również wyznaczyć udziały sieciowania oraz roztworu polimeru w całkowitej objętości żelu. Podobne obliczenia należy przeprowadzić, jeśli przed sieciowaniem mają zostać włączone jakiekolwiek grupy boczne (np. adhezyjny oligopeptyd zawierający RGD lub YGSR).
  3. Odważyć wymaganą ilość polimeru i sieciowania i umieścić w probówkach Eppendorf. Odpowiednio dostosować arkusz obliczeń do faktycznie uzyskanej masy polimeru. (Uwaga: objętości można zmienić, aby skompensować faktyczną masę uzyskanego polimeru i sieciowania).
  4. Przygotować formy do żelu, odcinając żyletką końcówki sterylnych jednorazowych strzykawek o pojemności 1 mL w indywidualnych opakowaniach. W przypadku form przeznaczonych do żeli fotowzorowanych należy upewnić się, że cięcie jest płaskie.
  5. Umieścić formy ze strzykawek, probówki Eppendorf (z otwartymi nakrętkami) oraz wszelkie inne niezbędne materiały pod bakteriobójczym źródłem światła (zazwyczaj wbudowanym w komory bezpieczeństwa biologicznego) i sterylizować przez 30 minut.

B. Przygotowanie komórek

  1. Po sterylizacji do probówki Eppendorf z polimerem należy dodać odpowiednią objętość sterylnego buforu (zgodnie z obliczeniami w arkuszu; choć wybór buforu może się różnić, do sieciowania wolnorodnikowego zazwyczaj stosuje się PBS, a do sieciowania typu Michaela bufor słabo zasadowy, np. trietanoloaminę) oraz (opcjonalnie) grupę boczną, która ma zostać włączona (np. peptyd adhezyjny), a następnie wymieszać w wstrząsarku w celu rozpuszczenia (jeśli wstrząsanie odbywa się poza komorą sterylną, probówkę Eppendorf należy owinąć parafilmem).
  2. Do roztworu polimeru należy dodać odpowiednią objętość roztworu grupy bocznej i zabezpieczyć zamknięcie parafilmem. Krótko wymieszać w wstrząsarku i inkubować w 37°C w celu przeprowadzenia reakcji (jeżeli to możliwe, na mieszadle obrotowym) podczas przygotowywania komórek. Proces ten obejmuje reakcję tiolu w peptydzie (poprzez grupę cysteiny) z akrylanem lub metakrylanem, tak aby peptyd został włączony jako grupa boczna w końcowym hydrożelu.
  3. Komórki należy poddać trypsynizacji, policzyć i rozdzielić na porcje zawierające odpowiednią liczbę dla każdego zestawu żeli. Na przykład dla zestawu trzech żeli o objętości 50 μL przy gęstości 10 milionów komórek/mL, należy odseparować 1,5 miliona komórek do oddzielnej probówki stożkowej. Ze względu na czas żelowania zaleca się, aby w jednym zestawie przygotowywać nie więcej niż 4 żele (uwaga: w przypadku syntezy wielu zestawów żeli można przygotować jedną probówkę Eppendorf zawierającą odpowiednią objętość roztworu polimeru dla wszystkich zestawów).
  4. Komórki należy odwirować.
  5. Podczas wirowania komórek:
    1. Sieciowanie wolnorodnikowe inicjowane światłem: do roztworu polimeru dodać roztwór I2959 o stężeniu 0,5 wt% w ilości odpowiadającej 10% całkowitej objętości zestawu żeli (aby uzyskać końcowe stężenie inicjatora 0,05 wt%).
    2. Sieciowanie typu Michaela (addycyjne): do sieciowania dodać bufor w celu uzyskania odpowiedniego stężenia roztworu.
    3. W przypadku sieciowania sekwencyjnego: żele te obejmują oba typy sieciowania i wymagają wykonania obu poprzednich kroków.

C. Tworzenie hydrożelu

  1. Odssać nadsącz z odwirowanej frakcji komórek. Odczekać, aż ciecz opadnie po wstępnym odsysaniu, a następnie odessać ponownie, aby usunąć jak najwięcej pożywki bez naruszenia osadu komórkowego.
  2. Resuspender osad komórkowy w roztworze polimeru aż do równomiernego rozprzestrzenienia komórek. Zminimalizować powstawanie pęcherzyków powietrza poprzez powolne pipetowanie roztworu w górę i w dół (około 10 cykli powinno być wystarczających do rozprzestrzenienia komórek).
  3. Sieciowanie hydrożeli
    1. Sieciowanie wolnorodnikowe inicjowane światłem: Odmierzyć odpowiednią objętość do form z końcówek strzykawki. Naświetlić strzykawki światłem UV w celu sieciowania wolnorodnikowego (np. 10-minutowa ekspozycja na światło UV o długości fali 365 nm i mocy 4 mW/cm2 jest powszechna dla polimerów funkcjonalizowanych akrylanem). Krok ten należy wykonać szybko, aby zminimalizować osiadanie komórek przed ekspozycją na światło UV.
    2. Sieciowanie typu Michaela (addycyjne): Używając końcówki pipety o szerokim otworze, dodać odpowiednią objętość roztworu sieciującego do roztworu polimeru/komórek, ustawić pipetę na pożądaną objętość pojedynczego żelu, pipetować roztwór w górę i w dół w celu homogenizacji, a następnie rozdzielić do form z końcówek strzykawki. Krok ten należy wykonać szybko, aby zapewnić równomierny rozkład komórek. Pozostawić na 10-30 minut (w zależności od konkretnego systemu) w dygestorium do inkubacji w celu sieciowania.
    3. Sieciowanie sekwencyjne: Proces ten obejmuje najpierw reakcję addycji typu Michaela, a następnie naświetlanie w celu drugiego sieciowania. Podczas pierwszego sieciowania powinna zajść reakcja tylko części teoretycznych wiązań sieciujących, a następnie przed naświetlaniem należy za pomocą wysterylizowanej pęsety nałożyć sterylną maskę bezpośrednio na powierzchnię żelu. Do początkowego roztworu można dodać funkcjonalizowany barwnik (np. metakrylowaną rodaminę (MeRho) w końcowym stężeniu w żelu 20 nM) w celu wizualizacji wzoru, ponieważ będzie on wbudowywać się preferencyjnie w regionach żelu sieciowanych wolnorodnikowo (Rysunek 2).

D. Hodowla i analiza komórek

  1. Po sieciowaniu umieść żele w dołkach płytki do hodowli tkankowej zawierającej pożywkę do inkubacji i analizy (patrz następne kroki).
  2. Morfologię komórek można wizualizować za pomocą mikroskopii świetlnej (Rysunek 3; zazwyczaj syntetyzowane hydrożele są przezroczyste), a żywotność za pomocą fluorescencyjnego zestawu do barwienia żywe/martwe (Rysunki 3 i 4). Barwienie aktyny komórkowej (np. faloidyną znakowaną rodaminą lub fluoresceiną) oraz jąder komórkowych (np. 4’-6-diamidino-2-fenyloindolem (DAPI)) można przeprowadzić przy użyciu standardowych procedur fiksacji i permeabilizacji (Rysunek 4) zgodnie z poniższą procedurą.
    1. Płucz konstrukty 3 razy przez 5 min w PBS.
    2. Utrwal żele poprzez inkubację w 1 mL 4% formaldehydu przez 30 min w temperaturze pokojowej.
    3. Płucz konstrukty 3 razy roztworem blokującym zawierającym 3% (w/v) BSA i 0,5% (w/v) Tween w PBS.
    4. Przeprowadź permeabilizację błony za pomocą 0,25% (w/v) Triton X w roztworze blokującym przez 20 min.
    5. Płucz konstrukty 3 razy roztworem blokującym.
    6. Barw F-aktynę za pomocą 0,66 μg/mL faloidyny z FITC lub rodaminą w roztworze blokującym przez dwie godziny w temperaturze pokojowej.
    7. Płucz 3 razy roztworem blokującym.
    8. Barw jądra komórkowe za pomocą 0,4 μL/mL DAPI w PBS przez 20 min.
    9. Płucz 3 razy w PBS.
    10. Wizualizuj komórki za pomocą mikroskopii epifluorescencyjnej lub konfokalnej.
  3. Proliferację komórek w żelach zazwyczaj ocenia się przy użyciu dostępnych komercyjnie testów (np. całkowitej zawartości DNA lub zawartości biochemicznej). PicoGreen jest powszechnie stosowanym i czułym fluorescencyjnym barwnikiem kwasów nukleinowych do kwantyfikacji dwuniciowego DNA (Singer et al.). Komórki można również policzyć i znormalizować do początkowej liczby kontrolnej, korzystając z metod wizualizacji opisanych w kroku 2.
  4. Do wizualizacji komórek i utworzonej macierzy można również zastosować cięcie histologiczne i barwienie. Poniższy protokół odwodnienia i cięcia hydrożeli 3D może zostać wykorzystany do uzyskania przekrojów poprzecznych na szkiełkach przedmiotowych:
    1. Fiksacja i odwodnienie
      1. Płucz preparat 3 razy w PBS.
      2. Utrwal przez 5–30 minut w 4% paraformaldehydzie.
      3. Płucz preparat 3 razy w PBS.
      4. Inkubuj próbkę w EtOH w 25°C przez 1 godzinę dla każdego z następujących stężeń EtOH (v/v) w wodzie (w podanej kolejności): 50%, 70%, 95%, 95%, 100% (na tym etapie próbki można przechowywać przez noc w 25°C).
    2. Przezroczystość i infiltracja
      1. Przenieś do 100% Citrisolv na 1 h w 25°C, a następnie na jedną godzinę w 65°C.
      2. Przetnij próbki na pół żyletką w szalce Petriego tak, aby odsłonić przekrój poprzeczny próbki.
      3. Przenieś do mieszaniny Citrisolv/Micro-cut Paraffin w stosunku 1:1 na 1 h w 65°C.
      4. Przenieś do 100% Micro-cut Paraffin na 1 h w 65°C.
      5. Przenieś do 100% Micro-cut Paraffin na noc w 65°C.
      6. Przenieś do 100% Micro-cut Paraffin na 1–2 godziny w 65°C.
    3. Zatapianie
      1. Umieść preparat w formie odrywanej z 100% parafiną.
      2. Nałóż niewielką ilość wosku do dna formy i włóż dwie połowy próbki przekrojem poprzecznym do dołu.
      3. Nałóż górny element filtra
        1. Dodaj dodatkowy wosk, aby zanurzyć górną część, i pozostaw do stwardnienia przez ok. 10 minut.
      4. Przenieś wkłady do lodówki w 4°C, aby preparat stwardniał przez noc.
      5. Preparat można pociąć następnego dnia, zazwyczaj z grubością plastra 5–10 μm, używając dostępnych komercyjnie mikrotomów. Zazwyczaj forma odrywana jest montowana pionowo względem stołu mikrotomu, a do ustawienia grubości cięcia, noża i wyrównania próbki z ostrzem używa się sterowania ręcznego.
    4. Ekstrakcja RNA

      Ekspresję genów można również ocenić ilościowo (np. za pomocą reakcji polimerazy łańcuchowej w czasie rzeczywistym (RT-PCR)). Protokół ekstrakcji RNA z hydrożeli 3D, którego przykład podano poniżej, różni się znacząco od znacznie prostszego przypadku 2D.
      1. Oznacz certyfikowaną probówkę Eppendorf wolną od RNazy dla każdego hydrożelu 3D i dodaj do każdej probówki 500 μL odczynnika Trizol®.
      2. Użyj tłuczka (homogenizatora tkanek), aby ręcznie rozetrzeć hydrożele, aż do uzyskania przejrzystego roztworu. Upewnij się, że dla każdego wariantu badania używane są oddzielne homogenizatory.
      3. Wymieszaj każdą probówkę Eppendorf w wortexie przez 20 sekund w celu homogenizacji próbek.
      4. Inkubuj próbki w temperaturze pokojowej przez pięć minut, aby umożliwić całkowitą dysocjację kompleksów nukleoproteinowych.
      5. Schładzaj próbki na lodzie przez 20 min.
      6. Dodaj 200 μL (na mL Trizolu) chloroformu do każdej próbki i wymieszaj w wortexie.
      7. Inkubuj próbki w temperaturze pokojowej przez pięć min.
      8. Wiruj próbki z prędkością 12 000 ×g w 4°C przez 15 min.
      9. Przenieś fazę wodną (przejrzysta górna warstwa) do nowych probówek Eppendorf (unikając regionu międzyfazowego i dolnej czerwonej fazy fenolowo-chloroformowej). RNA pozostaje w przejrzystej fazie wodnej.
      10. Można teraz zastosować standardowe techniki izolacji i przechowywania RNA.
      11. Po ekstrakcji RNA często stosuje się dostępne komercyjnie zestawy do odwrotnej transkrypcji i RT-PCR z pewnymi modyfikacjami (Elisseff et al., Strehin et al.).

Reprezentatywne wyniki:

Wyniki reprezentatywne dla wizualizacji fotowzorowanych hydrożeli oraz enkapsulacji komórek w żelach przedstawiono na Rysunkach 2-4 (zgodnie z odniesieniami w powyższych protokołach).

Schemat procesu przygotowania komórek, przedstawiający przygotowanie materiałów, tworzenie sieci i metody analizy.
Rysunek 1. Przegląd procedury enkapsulacji 3D. Kroki na schemacie odpowiadają tytułom sekcji w protokołach krok po kroku.

Fotochemiczna synteza hydrożelu z użyciem światła UV, fotomasek i barwnika; obrazy mikroskopowe pokazują wzory.
Rysunek 2. Fotolitograficzny wzór hydrożelu otrzymanego poprzez sekwencyjną addycję typu Michaela, a następnie polimeryzację rodnikową. (A) Schemat fotolitografii częściowo sieciowanego hydrożelu z włączeniem fotoreaktywnego barwnika. Hydrożele z kwasu hialuronowego wzorowane za pomocą (B) kołowej lub (C) prążkowanej maski z folii przezroczystej. Metakrylowana rodamina (MeRho) została wbudowana tylko w obszarach żelu, które były wystawione na działanie światła. Paski skali = 100 μm.

Obrazy z mikroskopii obserwacyjnej komórek; kontrast fazowy (A), znakowanie fluorescencyjne (B) do analizy komórkowej.
Rysunek 3. Wizualizacja komórek w hydrożelach 3D. Komórki macierzyste wizualizowane za pomocą (a) mikroskopii świetlnej lub (b) barwienia żywych (zielony, Calcein AM) i martwych (czerwony, Ethidium homodimer-1) komórek 24 godziny po enkapsulacji w stężeniu 1 milion cells/mL w hydrożelu z kwasu hialuronowego sieciowanym poprzez mechanizm wolnorodnikowy inicjowany światłem. Paski skali = 100 μm.

Obrazy z mikroskopii fluorescencyjnej cytozyglowitu komórkowego; włókna aktynowe (A), barwienia łączone (B).
Rysunek 4. Wizualizacja komórek w hydrożelach 3D. hMSC barwione na (a) żywe komórki (Calcein AM) lub (b) aktynę komórkową (rodamina falloidyna) i jądra komórkowe (DAPI) pięć dni po enkapsulacji w zagęszczeniu 1 milion cells/mL w hydrożelu z kwasu hialuronowego sieciowanym poprzez mechanizm typu Michaela (z użyciem wiszących peptydów adhezyjnych i bifunkcyjnych proteolitycznie degradowalnych peptydów sieciujących). Paski skali = 100 μm.

Dyskusja

Opisane protokoły stanowią prostą i skuteczną metodę enkapsulacji komórek w rusztowaniach hydrożelowych w sposób cytokompatybilny. Techniki te są szczególnie istotne, ponieważ komórki macierzyste oraz komórki terminalnie zróżnicowane mogą wykazywać wyraźnie odmienne zachowanie w mikrośrodowiskach 2D w porównaniu do 3D. Nawet w przypadku podejść terapeutycznych obejmujących implantację materiałów (np. polimeryzację rodnikową in situ), enkapsulacja komórek oraz analiza ich żywotności i różnicowania mogą pomóc w procesie opracowywania materiału. Opisany proces sekwencyjny może być wykorzystany do przestrzennej manipulacji środowiskiem hydrożelowym, a w konsekwencji do sterowania zachowaniem komórek (patrz Khetan et al.).

Ogólnie rzecz biorąc, najistotniejszym elementem opisanych protokołów jest jednorodność wszystkich stosowanych roztworów. W szczególności należy zadbać o to, aby komórki były równomiernie rozmieszczone w roztworze prepolimeru, a sam roztwór został dobrze wymieszany poprzez resuspensję pipetą po dodaniu roztworu sieciującego. Brak zapewnienia tych warunków może prowadzić do agregacji komórek lub lokalnych różnic w strukturze i pęcznieniu żelu.

Choć zaprezentowane tutaj protokoły koncentrują się przede wszystkim na procedurze enkapsulacji komórek, należy również zauważyć, że enkapsulacja może wymagać pewnych korekt w protokołach analizy, które są zazwyczaj opracowywane dla wysiewu 2D. Przedstawiono kilka przykładów wizualizacji i oceny komórek w hydrożelach.

Podziękowania

Praca ta była finansowana z funduszy National Science Foundation Graduate Research Fellowship dla SK oraz z grantu National Institutes of Health R01EB008722.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
I2959OdczynnikCiba Specialty Chemicals
Bufor trietanolaminowy 0,2 MOdczynnikSigma-AldrichT0449
PBSOdczynnikInvitrogen14040-1171x, sterylny płyn
Zestaw do barwienia Live/DeadOdczynnikInvitrogenL3224Zawiera sondy dla komórek żywych (Calcein AM) i martwych (etydium homodimer-1)
Faloidyna-FITCOdczynnikSigma-AldrichP5282
Faloidyna rodaminaOdczynnikInvitrogenR415
DAPIOdczynnikSigma-AldrichD9542
Metakryloiloetylotiokarbamoilorodamina B (MeRho)OdczynnikPolysciences, Inc.23591
Albuminy surowicy bydlęcejOdczynnikSigma-AldrichA7030
Tween 20OdczynnikSigma-AldrichP1379
Triton X-100OdczynnikSigma-AldrichT8787
CitrisolvOdczynnikFisher Scientific22-143975
Parafina Micro-cutOdczynnikPolysciences, Inc.24202
Odczynnik TrizolOdczynnikInvitrogen15596-026
Nylonowe filtry strzykawkowe o rozmiarze porów 0,22 μmSprzętFisher Scientific09-719C
Jednorazowe strzykawki 1 mLSprzętBD Biosciences309602Odciąć strzykawki na jednakowej wysokości do naświetlania UV
Końcówki do pipet z szerokim otworemSprzętSigma-AldrichP6800
System punktowego utwardzania UV Omnicure z filtrem 365 nmSprzętEXFOS1000
Germicydowe źródło światła UV 254 nmSprzętWbudowane w większość komór bezpieczeństwa biologicznego

Bibliografia

  1. Singer, V. L., Jones, L. J., Yue, S. T., Haugland, R. P. Characterization of PicoGreen reagent and development of a fluorescence-based solution assay for double-stranded DNA quantitation. Anal Biochem. 249, 228-238 (1997).
  2. Lutolf, M. P., Raeber, G. P., Zisch, A. H., Tirelli, N., Hubbell, J. A. Cell-Responsive Synthetic Hydrogels. Adv Mater. 15, 888-892 (2003).
  3. Elisseeff, J. H., Ruffner, M., Kim, T. G., Williams, C. Cellular Photoencapsulation in Hydrogels. Culture of Cells for Tissue Engineering. , (2006).
  4. Chung, C., Mesa, J., Miller, G. J., Randolph, M. A., Gill, T. J., Burdick, J. A. Effects of auricular chondrocyte expansion on neocartilage formation in photocrosslinked hyaluronic acid networks. Tissue Eng. 12, 2665-2773 (2006).
  5. Burdick, J. A., Vunjak-Novakovic, G. V. Engineered microenvironments for controlled stem cell differentiation. Tissue Eng. Part A. 15, 205-219 (2008).
  6. Salinas, C. N., Anseth, K. S. Mixed Mode Thiol-Acrylate Photopolymerization for the Synthesis of PEG-Peptide Hydrogels. Macromolecules. 41, 6019-6026 (2008).
  7. Kraehenbuehl, T. P., Ferreira, L. S., Zammaretti, P., Hubbell, J. A., Langer, R. Cell-responsive hydrogel for encapsulation of vascular cells. Biomaterials. 30, 4318-4324 (2009).
  8. Strehin, I. A., Elisseeff, H. J. Characterizing ECM Production by Cells Encapsulated in Hydrogels. Methods Mol Biol. 522, 1-14 (2009).
  9. Khetan, S., Katz, J. S., Burdick, J. A. Sequential crosslinking to control cellular spreading in 3-dimensional hydrogels. Soft Matter. 5, 1601-1606 (2009).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Hydro ele 3Dsieciowanie hydro eliizolacja kom rektest ywotno cianaliza r nicowaniamikroskopia wietlnabarwienie fluorescencyjnefunkcjonalizacja polimer w

Powiązane artykuły