Monitorowanie funkcji serca u larw Drosophila melanogaster w badaniach fizjologicznych

Podsumowanie

Przedstawiamy różne metody monitorowania funkcji serca u larw Drosophila w celu analizy kwestii związanych z funkcjonowaniem złączy szczelinowych, mutacjami kanałów jonowych, modulacją aktywności rozrusznika oraz w badaniach farmakologicznych.

Streszczenie

Prezentujemy różne metody rejestracji funkcji serca w stadium larwalnymDrosophilaOpisane podejścia umożliwiają pomiar częstotliwości akcji serca u całych larw, zarówno nieunieruchomionych, jak i unieruchomionych. W celu bezpośredniej kontroli środowiska wokół serca inne podejście wykorzystuje larwy poddane sekcji i usunięciu narządów wewnętrznych, aby móc kąpać serce w pożądanych związkach. Eksponowane serce pozwala również na monitorowanie potencjałów błonowych, co może dostarczyć informacji o prądach jonowych generowanych przez miocyty oraz o przewodnictwie elektrycznym wzdłuż rurki serca. Omówiono różne zalety i wady tych podejść w kontekście przyszłych eksperymentów. Preparat serca larwalnego stanowi dodatkowy model obokDrosophilaszkieletowe NMJ, aby zbadać rolę wewnątrzkomórkowej regulacji wapnia w funkcji komórkowej. Dzięki pogłębieniu wiedzy na temat podstawowych prądów jonowych kształtujących potencjały czynnościowe w miocytach u różnych gatunków, można mieć nadzieję na lepsze zrozumienie znanych dysfunkcji jonowych związanych z konkretnymi genami odpowiedzialnymi za różne choroby u ssaków.

Protokół

WSTĘP

Mechanizmy komórkowe odpowiedzialne za funkcjonowanie serca u owadów i kręgowców są zdumiewająco podobne. Drosophila melanogaster są wykorzystywane do badania mutacji genowych odpowiedzialnych za stany chorobowe u innych zwierząt, w tym u ludzi (Bier and Bodmer, 2004; Peron et al., 2009). Obecnie u tego podatnego na manipulacje genetyczne organizmu indukuje się różne choroby (Dowse et al., 1995; Johnson et al., 1998; Ganetzky, 2000; Bier and Bodmer, 2004; Ocorr et al., 2007a, b) z nadzieją, że z czasem będzie można przetestować terapię genową w celu przywrócenia prawidłowych funkcji. Ponadto Drosophila stanowią dobry model do badania funkcji fizjologicznych na poziomie komórkowym.

Wiele z dotychczasowych badań nad sercem Drosophila koncentrowało się na aspektach rozwojowych w embrionie (Azpiazu and Frasch 1993, Bodmer 1993, Bodmer et al. 1990). Kilka badań nad funkcją fizjologiczną przeprowadzono w stadiach przepoczwarkowym, poczwarkowym lub u osobników dorosłych (Ashton et al., 2001; He and Adler, 2001; Molina and Cripps, 2001; Ponzielli et al., 2002; Sláma and Farkaš, 2005; Wessells and Bodmer, 2004). Jednak stadium poczwarki charakteryzuje się metamorfozą, zmianami poziomu hormonów, a także wahaniami stężeń różnych amin biogennych. Dodatkowo serce przechodzi transformację strukturalną, co może utrudnić kontrolę zmiennych podczas badania fizjologii miocytów (Dulcis et al. 2005; Johnson et al. 2002; Miller, 1997; Papaefthimiou and Theophilidis, 2001). Wiadomo, że serce w stadium larwalnym jest miogenne i można je łatwo usunąć lub pozostawić in situ, kąpiąc je w określonym roztworze soli fizjologicznej, aby ograniczyć wpływ zmiennych towarzyszących, takich jak krążące hormony czy peptydy (Dowse et al. 1995; Johnson et al. 1997; Dasari and Cooper, 2006; Feng et al. 2004). Miogenny charakter serca larwalnego jest porównywalny do serca ssaków w tym sensie, że występują w nim rozruszniki, które wymuszają pompowanie płynu przez resztę serca w kierunku umożliwiającym efektywne obmywanie organów. Chronotropowy i ionotropowy charakter serca larwalnego Drosophila jest interesujący, ponieważ może służyć jako szybki sposób testowania fundamentalnych zasad i efektów patologicznych funkcji serca ssaków, a także pomagać w opracowaniu modelu porównawczego dla fizjologii komórkowej, np. w zakresie regulacji jonowej komórek rozrusznika.

Serce larwy jest bardzo wrażliwe na aminy biogenne i peptydy, których stężenie w hemolimfie zmienia się w zależności od źródła pożywienia lub stanu wewnętrznego zwierzęcia (Dasari i Cooper, 2006; Johnson et al. 1997, 2000; Nichols et al. 1999; Zornik et al. 1999). Interesujące jest zbadanie mechanizmów, poprzez które związki endogenne lub egzogenne wpływają na pracę serca. Lepsze zrozumienie fizjologii i farmakologii owadów może pozwolić na opracowanie nowych insektycydów o mniejszym wpływie na inne organizmy.

Komórkowy mechanizm działania neuroprzekaźników i modulatorów kardiologicznych u larw nie został do tej pory opisany, ponieważ nie było wystarczającej wiedzy na temat prądów jonowych i typów kanałów obecnych w sercu larwy, które przyczyniają się do aktywności rozrusznika i ją regulują. Z naszej wiedzy wynika, że nie istnieją raporty dokumentujące pozakomórkowe lub wewnątrzkomórkowe rejestracje z miocytów w celu oceny prądów jonowych, co pozwoliłoby określić mechanistyczne efekty modulatorów u larw Drosophila.

W niniejszym raporcie przedstawiamy różne metody rejestracji częstości akcji serca oraz właściwości fizjologicznych serca larwalnego.

METODY

Nieuszkodzone larwy:

1. Dobrą metodą wizualizacji nienaruszonego, bijącego serca larwy jest bezpośrednia obserwacja pod mikroskopem; jednak larwa musi pozostać wystarczająco nieruchoma, aby można było policzyć skurcze. Opracowaliśmy metody monitorowania tętna zarówno u larw poruszających się swobodnie, jak i u larw unieruchomionych. W zależności od postawionego pytania badawczego jedno podejście może być bardziej odpowiednie od drugiego.
2. Podejścia te mogą być wykorzystane do śledzenia pojedynczego osobnika przez dłuższe okresy czasu, pod warunkiem zachowania ostrożności, aby uniknąć odwodnienia. Metody te mogą być również stosowane do oceny działania środków farmakologicznych wprowadzanych z dietą lub do badania różnych etapów rozwoju w liniach mutacyjnych bądź po indukcji genów szoku termicznego.
3. Pierwszą metodę bez unieruchamiania nazywamy „farmą mrówek”. Technika ta polega na zastosowaniu dwóch szklanych płytek oddzielonych cienką warstwą pokarmu dla larw. Dzięki temu larwy można wizualizować w jednej płaszczyźnie ostrości. Technika ta była również wykorzystywana do monitorowania za pomocą aktywności elektrycznej ruchu okołodobowego u larw (Cooper and Cooper, 2004). Metoda ta składa się z dwóch szklanych płytek (szkiełek przedmiotowych; 75 x 25 mm; J. Melvin Freed Brand) rozmieszczonych w niewielkiej odległości (1 do 1.5 mm) od siebie za pomocą cienkiej warstwy pokarmu dla larw (np. wilgotna mączka kukurydziana – zmodyfikowana wersja według Lewisa, 1960), tak aby larwy mogły być widoczne w jednej płaszczyźnie ostrości. Bardzo dobrze sprawdzają się dystanse powszechnie stosowane do płytek do elektroforezy w żelu (mini gel Bio-Rad; Life Science Research, Hercules, CA 94547, USA), ponieważ można je nabyć w różnych grubościach do stosowania w procedurach farmy mrówek dla larw 1., 2. lub 3. stadium. Inną opcją jest użycie litego plastiku o danej grubości i wycięcie obszaru, który będzie służył jako przestrzeń do pełzania.
4. Aby zapobiec pełzaniu larw poza krawędzie dwóch szklanych płytek, stosuje się plastik o pożądanej grubości. Lekkie nachylenie platformy pod kątem od 20 do 45 stopni powoduje, że larwy przez większość czasu pozostają z głową skierowaną w dół, a odwłok zawierający przetchawniki znajduje się ponad pokarmem lub wewnątrz kanału powietrznego w warstwie pokarmowej.
5. Ta „technika farmy mrówek” pozwala również na obrazowanie wideo w jednej płaszczyźnie przy jednolitej grubości pokarmu. W tej konfiguracji larwy nie mają tendencji do pełzania przez całą warstwę pokarmu, lecz zamiast tego żerują i stopniowo poruszają się w płaszczyźnie 2D. Światło białe jest rzutowane od spodu stolika mikroskopowego za pomocą lustra, tak aby można je było odpowiednio przesuwać w celu uzyskania najlepszego kontrastu serca lub dwóch tchawic, które poruszają się podczas skurczów serca. Używany jest mikroskop (regulowany zoom od 0.67 do 4.5; World Precision Instrument; Model 501379). Obiektyw podstawowy 2X oraz obiektyw tubusowy 0.5X są stosowane w celu uzyskania wystarczającej rozdzielczości przestrzennej i powiększenia, aby objąć prostokąt o wymiarach 1 cm na 0.5 cm. Poprzez uchwyt trynokularny stosowana jest zamontowana kamera (Mintron, MTV; World Precision Instrument). Temperatura otoczenia jest utrzymywana na poziomie 20°C.
   
   
   Rycina 1. Widok grzbietowy nienaruszonej larwy 3^rd stadium. Ruch tchawic spowodowany pociąganiem załączników z serca jest wykorzystywany do obserwacji tętna.
6. Aby monitorować swobodnie poruszające się zwierzę, można nanieść kilka kropli rozcieńczonej mieszanki pokarmowej nad głowę zwierzęcia. Należy to zrobić w szklanej szalce, tak aby światło przechodzące mogło przenikać przez larwy w celu wizualizacji rurki serca. Do obserwacji bicia serca i zliczania skurczów można użyć takiego samego zestawu mikroskopowego, jak opisano powyżej.
7. Innym podejściem jest unieruchomienie larwy w jednym miejscu za pomocą dwustronnej taśmy klejącej na szkiełku przedmiotowym i przyłożenie strony brzusznej larwy do taśmy (Baker et al., 1999). Jednak podejście to nie sprawdza się dobrze, jeśli taśma zamoczy się podczas karmienia larw. Aby zapobiec zamoczeniu taśmy, można użyć wazeliny (wprowadzonej za pomocą małej igły wokół podstawy larwy i wokół krawędzi taśmy). W ten sposób można karmić larwę w czasie, bez konieczności poganiania jej do płaszczyzny ostrości lub podczas gdy porusza się ona po szalce. Jeśli chce się uwolnić larwy, taśmę można zwilżyć, co spowoduje utratę jej przylepności do zwierzęcia.

Jeśli nie planuje się uwalniania larw do dalszych doświadczeń, można zastosować metodę trwałego unieruchomienia larwy poprzez przyklejenie zwierzęcia do szkiełka przedmiotowego. Przy zastosowaniu metody z użyciem superkleju, zwierzę może pobierać pokarm, a nawet być pokryte wilgotnym roztworem, pozostając przytwierdzonym do szkiełka nakrywkowego. Procedury są następujące:

1. Należy wziąć czyste szkiełko i umieścić na jednym jego końcu szkiełko nakrywkowe.
2. W jednym rogu szkiełka nakrywkowego należy umieścić małą kroplę superglue.
3. Należy zlokalizować larwę Drosophila i wyjąć ją z probówki.
4. Larwę należy umieścić w szalce Petriego i opłukać niewielką ilością wody, aby usunąć nadmiar pożywki.
5. Pozostałą pożywkę należy wchłonąć rogiem małej chusteczki lub ręcznika papierowego.
6. Larwę należy delikatnie podnieść pęsetą i umieścić na szkiełku po przeciwnej stronie niż szkiełko nakrywkowe.
7. Szkiełko należy umieścić pod mikroskopem i ustawić soczewkę na larwie. Larwa powinna znajdować się na brzuchu, grzbietem skierowanym do góry. Dwie strony larwy można odróżnić po tym, że na grzbiecie znajdują się dwa „pasy wyścigowe”, którymi są tchawki. Na brzuchu widoczne są słabe poziome bruzdy biegnące wzdłuż ciała z bardzo drobnymi czarnymi włoskami.
8. Jeśli larwa jest skierowana w niewłaściwą stronę, należy ją po prostu obrócić, delikatnie odwracając ją pęsetą.
9. Używając nowej pęsety przeznaczonej specjalnie do kleju, należy pobrać niewielką ilość z kropli na końcu szkiełka nakrywkowego i nanieść ją w rogu przeciwległego końca. Należy użyć minimalnej ilości kleju; wystarczy tyle, by pokryć końcówkę pęsety. Należy również pamiętać o wytarciu końcówek pęsety, aby nie skleiły się one ze sobą.
10. Pod mikroskopem należy ponownie sprawdzić, czy larwa nadal znajduje się w prawidłowej pozycji. Jeśli się obróciła, należy postąpić zgodnie z krokiem ósmym.
11. Teraz, za pomocą pęsety używanej do manipulacji larwą, należy ją podnieść i delikatnie umieścić na świeżej plamie kleju. Należy upewnić się, że czarne haczyki gębowe znajdują się w pobliżu lub na krawędzi szkiełka nakrywkowego i że ani one, ani brązowe przetchlinki nie mają kontaktu z klejem.
12. Należy ostrożnie docisnąć larwę, aby ją spłaszczyć.
13. Gdy larwa jest już na miejscu, można podać substancje, które mają zostać przetestowane.
14. Najlepiej zrobić to za pomocą strzykawki, pobierając substancję i podając ją w małych dawkach przy głowie larwy, aby mogła ją spożyć.
15. Na koniec częstotliwość akcji serca można zaobserwować, licząc liczbę pulsacji przetchlinek w ciągu jednej minuty.

In situ: Disekcja i pomiar częstości akcji serca:

Preparaty rozcina się wzdłuż środkowej osi podłużnej strony brzusznej, a następnie rozpłaszcza i przypina. Pojemnik do preparatów składał się z szkiełka przedmiotowego (VWR) z przyklejoną do jednej strony taśmą magnetyczną (sklep detaliczny Best Buys). Otwór w centrum paska magnetycznego umożliwia oglądanie preparatu w świetle przechodzącym. Szpilki sekcyjne (Fine Scientific Tools, WA) są wyginane i przyklejane do spinaczy biurowych. Spinacze te można łatwo przesuwać po taśmie magnetycznej, aby utrzymać rozciętą preparację w miejscu. Ten typ pojemnika do rejestracji został wcześniej opisany w kontekście przypinania zwojów wyizolowanych z brzusznego sznura nerwowego pijawki (Muller et al., 1981).

1. Umieść nienaruszoną larwę w 3. stadium rozwojowym na płytce sekcyjnej. Obróć larwę na stronę brzuszną, aż tchawice przestaną być widoczne przez kutykulę.
2. Wbij cztery szpilki w nienaruszoną larvę. Dwie szpilki umieść po obu stronach haczyków gębowych, a dwie szpilki po obu stronach przetchlinek.
3. Dodaj sól fizjologiczną i wykonaj cięcie poziome w niewielkiej odległości od szpilek przy głowie, a następnie kontynuuj cięcie poziome wzdłuż osi podłużnej.
4. Przerwij cięcie w niewielkiej odległości od serca rurkowego. Wykonaj cięcia wokół serca rurkowego oraz wzdłuż przetchlinek.
5. Podnieś jedną z grzbietowych szpilek i zahacz ją pod kutykulą. Użyj szpilki, aby otworzyć jamę ciała i rozszerzyć ją. Powtórz tę czynność z pozostałymi szpilkami.
6. Usuń przewód pokarmowy, uważając, aby nie uszkodzić tchawic ani serca. Należy zauważyć, że niektóre struktury są przytwierdzone do serca i ich usunięcie może doprowadzić do jego uszkodzenia. Dotyczy to kilku ciał tłuszczowych oraz mózgu. Jeśli zauważysz, że serce jest rozciągane podczas usuwania wnętrzności, natychmiast zaprzestań prób usunięcia danej struktury.

Serce jest teraz odsłonięte i gotowe do poddania go warunkom eksperymentalnym.

Rycina 2. Sekcja brzuszna larwy w 3^rd stadium w celu bezpośredniej obserwacji serca. Przytwierdzenie zwierzęcia szpilkami na grzbiecie po sekcji umożliwia bezpośrednie aplikowanie związków na serce, z zachowaniem lub bez zachowania nienaruszonego OUN. Mała strzałka wskazuje miejsce rozdzielenia serca i aorty na potrzeby badań nad naciętym naczyniem grzbietowym (patrz poniżej). Tr, tchawka; Sp, przetchlinki; H, serce; AO, aorta.

Niniejsza technika sekcji była stosowana do bezpośredniej oceny działania środków farmakologicznych na serce larw Drosophila (Gu i Singh, 1995). Czas sekcji wynosi 3-6 min. Po sekcji preparat pozostawia się do regeneracji w soli fizjologicznej HL3 przez 3-5 min.

Wartość pH soli fizjologicznej HL3 była starannie kontrolowana i utrzymywana na poziomie 7,2, ponieważ częstość akcji serca (HR) spada przy wysokim pH i wzrasta przy niższym pH (Badre et al., 2005). Gu i Singh (1995) stosowali pH 7,0 do analizy farmakologicznej serca, wykazując przy tym utrzymanie żywotności tkanek. Podczas tych prób roztwór soli był napowietrzany poprzez mieszanie, polegające na wielokrotnym wstrzykiwaniu soli fizjologicznej do zlewki za pomocą igły o rozmiarze 21G.

W celu określenia HR można zastosować bezpośrednie obserwacje lub zarejestrować obrazy na kasetach VHS bądź za pomocą kamery cyfrowej do późniejszego odtworzenia na ekranie. Wcześniej opisano metodę z użyciem fotodiody (Dasari i Cooper, 2006).

Ekspozycja na szok termiczny:

1. Przeprowadzić sekcję larwy.
2. Umieścić przygotowany preparat na szkiełku nakrywkowym.
3. Podgrzać kąpiel wodną.
4. Sprawdzić temperaturę wewnątrz kąpieli, umieszczając sondę temperatury na pływającym szkiełku nakrywkowym.
5. Po osiągnięciu odpowiedniej temperatury umieścić preparat wraz ze szkiełkiem nakrywkowym w kąpieli.
6. Pozostawić preparat w kąpieli przez wymagany czas, a następnie wyjąć po zakończeniu procesu.

Można określić wartość każdego impulsu cieplnego oraz temperaturę wymaganą do przeprowadzonych doświadczeń.

Stymuluj elektrycznie serce w celu nadania rytmu:

1. Napełnij elektrodę ogniskową (o średnicy około 20 micronów), używając strzykawki włożonej i uszczelnionej na otwartym końcu, i wciągnij sól fizjologiczną dla much (HL3) w temperaturze pokojowej (21° C) do wnętrza elektrody. Zamocuj elektrodę w manipulatorze, upewniając się, że drut znajduje się w soli fizjologicznej wewnątrz elektrody, a stymulator jest wyłączony.
2. Umieść preparat wypreparowanego serca larwy Drosophila w III stadium larwalnym pod mikroskopem sekcyjnym i przymocuj go na miejscu. Umieść przewód uziemiający w soli fizjologicznej preparatu, uważając, aby nie dotknął on pinów ani krawędzi preparatu.
3. Za pomocą manipulatora ustaw końcówkę elektrody na górnej części serca, dostosowując w razie potrzeby ostrość mikroskopu. Najlepszym sposobem na osiągnięcie tego celu jest ustawienie ostrości na elektrodzie podczas przesuwania końcówki w dół.
4. Gdy końcówka znajdzie się w odpowiedniej pozycji, należy włączyć stymulator (model S9 Grass Instruments, Quincy, Massachusetts, USA), ustawiając częstotliwość na 2 Hz, czas trwania od 0,5 do 1 ms oraz napięcie na najniższym ustawieniu. Opóźnienie (delay) powinno wynosić od 12 do 14.
5. Obserwując rytm serca, należy zmienić częstotliwość na około 3 Hz i powoli zwiększać napięcie, aż zaobserwowany rytm serca będzie odpowiadał rytmowi generowanemu przez stymulator. Zazwyczaj wypreparowane serce muchy bije z częstotliwością około 2 Hz, zatem gdy rytm stymulowany jest wyższy niż częstotliwość własna, serce będzie bić szybciej niż normalnie. Napięcie nie powinno przekraczać około 20 V, ponieważ wysokie napięcia mogą spowodować uszkodzenie komórek, czyniąc preparat bezużytecznym. Zazwyczaj serce można stymulować napięciem od 2 do 8 V, w zależności od odległości i szczelności połączenia z sercem.
6. Jeśli osiągnięto maksymalne napięcie i nie zaobserwowano efektu, można odwrócić polaryzację. Jeśli to również nie zadziała, należy przesunąć sondę, aby lepiej ustanowić połączenie z sercem.
7. Po ustanowieniu rytmu sterowanego stymulacją, można nim manipulować, zmieniając ustawienia częstotliwości i czasu trwania. Należy jednak pamiętać, że częstotliwości powyżej 4 Hz mogą wprowadzić serce w stan tetanii. Po ustanowieniu pożądanego rytmu można dodawać różne alkohole i środki farmakologiczne, a następnie obserwować ich wpływ na złącza szczelinowe. Zablokowane złącza szczelinowe nie przewodzą prądu, co spowoduje ustanie propagowanego rytmu.
   
   
   Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej ryciny.

Pomiar potencjałów polowych:

1. Elektrody szklane wykonuje się ze szkła Kimax (średnica zewnętrzna: 1.5 mm). Rurkę szklaną wyciąga się i poleruje ogniowo, aby uzyskać końcówki do patch-clamp o średnicach wewnętrznych od 10 do 20 μm.
2. Środek elektrody wypełnia się medium kąpielowym. Wzmacniacz i zapis online do komputera są takie same, jak te użyte poniżej do pomiarów wewnątrzkomórkowych.
3. Środek elektrody rejestrującej typu „macro-patch” (Stühmer et al., 1983) umieszcza się bezpośrednio nad obszarem serca. Spontaniczne tempo pracy włókien mięśniowych generuje potencjał polowy, który można monitorować za pomocą elektrody ogniskowej.
4. Należy zachować ostrożność, delikatnie opuszczając i podnosząc środek elektrody nad każdym monitorowanym obszarem serca. Potencjały są rejestrowane za pomocą elektrody macro-patch.

Możliwe jest bezpośrednie zliczanie tętna oraz monitorowanie zdarzeń elektrycznych. W celu oceny wpływu na potencjały polowe dopuszczalne jest również zmienianie medium kąpielowego podczas rejestracji tych potencjałów.

Pomiar potencjałów wewnątrzkomórkowych:

Aby monitorować potencjały błonowe miocytów, w obszar serca wprowadza się ostrą elektrodę wewnątrzkomórkową (oporność od 20 do 30 mOhm) wypełnioną 3 M KCl. Można zastosować standardowy przedwzmacniacz i wzmacniacz do rejestracji wewnątrzkomórkowej; w naszej pracy wykorzystaliśmy wzmacniacz Axonclamp 2B (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA) oraz przedwzmacniacz 1 X LU. Wydaje się, że koniec ogonowy serca jest sztywniejszy i to tam znajdują się komórki rozrusznika, ponieważ skurcz w większości przypadków rozpoczyna się właśnie w tym obszarze (Badre et al., 2005; Dasari and Cooper 2006; Dasari et al., 2007).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Narzędzia do dysekcji: precyzyjne pęsety nr 5 i precyzyjne nożyczki (wszystkie zakupione w Fine Science Tools (USA), Inc., 373-G Vintage Park Drive, Foster City, CA 94404-1139) Mikroskop stereoskopowy z funkcją zoom do dysekcji i pomiaru częstości akcji serca. Jest on również niezbędny do ogniskowej stymulacji serca. Do rejestracji pozakomórkowych i wewnątrzkomórkowych stosuje się mikroskop złożony z obiektywami pionowymi (4x i 20X). Standardowy wzmacniacz wewnątrzkomórkowy i karta A/D do rejestracji danych w czasie rzeczywistym na komputerze. Sygnały elektryczne są rejestrowane online za pomocą interfejsu PowerLab/4s (ADInstruments, Australia). Używamy standardowego oprogramowania firmy ADInstruments o nazwie Chart lub Scope. Odczynniki chemiczne: wszystkie odczynniki do soli fizjologicznych pochodzą z firmy Sigma (St. Louis, MO). Do rejestracji wewnątrzkomórkowych stosujemy szklane kapilary (nr katalogowy 30-31-0 z FHC, Brunswick, ME, 04011, USA), a do ogniskowej rejestracji macropatch oraz jako elektrody stymulujące stosujemy Kimax-51, Kimble Products Art. No. 34502, ID 0.8-1.1mm, długość 100mm. Elektroda wewnątrzkomórkowa powinna mieć oporność od 20 do 30 mOhm. Elektrodę macropatch wykonuje się poprzez odłamanie końcówki szklanej po uformowaniu cienkiego czubka za pomocą wyciągarki do elektrod. Odłamana końcówka musi być gładkim, prostopadłym przełamaniem o średnicy około 20μM. Następnie końcówkę poleruje się termicznie do uzyskania wewnętrznej średnicy około 10μM w celu ogniskowej rejestracji pozakomórkowej. Dla elektrody stymulującej serce stosujemy końcówkę o średnicy około 20-50 μM. Trzon elektrody przesuwa się nad elementem grzejnym, aby wygiąć go pod kątem około 45 stopni w sposób łagodny. Pozwala to uzyskać płaskie lub prostopadłe światło elektrody nad rurką serca, ponieważ kąt ustawienia mikromanipulatora stworzy kolejne około 45 stopni względem preparatu.