Monitorowanie funkcji serca u larw Drosophila melanogaster w badaniach fizjologicznych

Podsumowanie

Przedstawiamy różne metody monitorowania funkcji serca u larw Drosophila w celu analizy kwestii dotyczących funkcji złączy szczelinowych, mutacji kanałów jonowych, modulacji aktywności rozrusznika oraz w badaniach farmakologicznych.

Streszczenie

Prezentujemy różne metody rejestracji funkcji serca u larwDrosophilaPodejścia te pozwalają na pomiar tętna u nieunieruchomionych i unieruchomionych larw w całości. W celu bezpośredniej kontroli środowiska wokół serca inne podejście wykorzystuje rozcierane larwy i usunięcie organów wewnętrznych, aby móc kąpać serce w wybranych związkach. Odsłonięte serce pozwala również na monitorowanie potencjałów błonowych, co może dostarczyć informacji o prądach jonowych generowanych przez miocyty oraz o przewodnictwie elektrycznym wzdłuż rurki serca. Omówiono różnorodne zalety i wady tych podejść w kontekście przyszłych eksperymentów. Preparat serca larwalnego stanowi dodatkowy model obokDrosophilaszkieletowe NMJ w celu zbadania roli wewnątrzkomórkowej regulacji wapnia w funkcji komórkowej. Dzięki pogłębieniu wiedzy na temat podstawowych prądów jonowych kształtujących potencjały czynnościowe w miocytach różnych gatunków, można dążyć do zrozumienia znanych dysfunkcji jonowych związanych z konkretnymi genami odpowiedzialnymi za różne choroby u ssaków.

Protokół

WSTĘP

Mechanizmy komórkowe odpowiedzialne za funkcjonowanie serca u owadów i kręgowców są zadziwiająco podobne. Drosophila melanogaster są wykorzystywane do badania mutacji genowych odpowiedzialnych za stany chorobowe u innych zwierząt, w tym u ludzi (Bier i Bodmer, 2004; Peron et al., 2009). Obecnie w tym łatwym do manipulacji genetycznie organizmie indukuje się różne choroby (Dowse et al., 1995; Johnson et al., 1998; Ganetzky, 2000; Bier i Bodmer, 2004; Ocorr et al., 2007a, b) z nadzieją, że z czasem będzie można testować terapię genową w celu przywrócenia prawidłowych funkcji. Ponadto Drosophila stanowią dobry model do badania funkcji fizjologicznych na poziomie komórkowym.

Wiele z dotychczasowych badań nad sercem Drosophila koncentrowało się na aspektach rozwojowych w embrionie (Azpiazu i Frasch 1993, Bodmer 1993, Bodmer et al. 1990). Kilka badań nad funkcją fizjologiczną przeprowadzono w stadium przedpoczwarkowym, poczwarkowym lub u osobników dorosłych (Ashton et al., 2001; He i Adler, 2001; Molina i Cripps, 2001; Ponzielli et al., 2002; Sláma i Farkaš, 2005; Wessells i Bodmer, 2004). Jednak stadium poczwarki jest okresem metamorfozy i zmian hormonalnych, a także wahań poziomów różnych amin biogennych. Ponadto serce przechodzi transformację strukturalną, co może utrudnić kontrolę zmiennych podczas badania fizjologii miocytów (Dulcis et al. 2005; Johnson et al. 2002; Miller, 1997; Papaefthimiou i Theophilidis, 2001). Serca w stadium larwalnym mają charakter miogenny; można je łatwo usunąć lub pozostawić in situ, kąpiąc je w określonej soli fizjologicznej w celu ograniczenia zmiennych zakłócających, takich jak krążące hormony czy peptydy (Dowse et al. 1995; Johnson et al. 1997; Dasari i Cooper, 2006; Feng et al. 2004). Miogenna natura serca larwalnego jest porównywalna do serca ssaków w tym sensie, że występują w nim rozruszniki, które wymuszają pompowanie płynu przez resztę serca w kierunku zapewniającym efektywne obmywanie organów. Właściwości chronotropowe i ionotropowe serca larwalnego Drosophila są interesujące, ponieważ mogą służyć jako szybka metoda testowania podstawowych zasad i efektów patologicznych dla funkcji serca ssaków, a także pomóc w opracowaniu modelu porównawczego dla fizjologii komórkowej, np. w zakresie regulacji jonowej komórek rozrusznika.

Serce larwy jest bardzo wrażliwe na aminy biogenne i peptydy, których stężenie w hemolimfie zmienia się w zależności od źródła pożywienia lub stanu wewnętrznego zwierzęcia (Dasari and Cooper, 2006; Johnson et al. 1997, 2000; Nichols et al. 1999; Zornik et al. 1999). Interesujące jest zbadanie mechanizmów, poprzez które związki endogenne lub egzogenne wpływają na serce. Lepsze zrozumienie fizjologii i farmakologii owadów może pozwolić na opracowanie nowych insektycydów o mniejszym wpływie na inne organizmy.

Komórkowy mechanizm działania neurotransmiterów i modulatorów kardiologicznych u larw nie został dotąd opisany, ponieważ nie istnieje wystarczające zrozumienie prądów jonowych i typów kanałów obecnych w sercu larwalnym, które przyczyniają się do aktywności rozrusznika i regulują ją. Z tego co wiemy, nie istnieją raporty dokumentujące pozakomórkowe lub wewnątrzkomórkowe rejestracje z miocytów w celu oceny prądów jonowych, co pozwoliłoby na zbadanie mechanistycznych efektów modulatorów u larw Drosophila.

W niniejszym raporcie przedstawiamy różne metody rejestrowania tętna oraz właściwości fizjologicznych serca larwalnego.

METODY

Nienaruszone larwy:

1. Dobrym sposobem wizualizacji bijącego serca larwy w stanie nienaruszonym jest bezpośrednia obserwacja pod mikroskopem; jednak larwa musi pozostać wystarczająco nieruchoma, aby można było policzyć skurcze. Opracowaliśmy metody monitorowania częstości akcji serca zarówno u larw poruszających się swobodnie, jak i u larw unieruchomionych. W zależności od postawionego pytania badawczego jedno z tych podejść może być bardziej odpowiednie od drugiego.
2. Podejścia te mogą być wykorzystane do obserwacji pojedynczego osobnika przez dłuższy czas, pod warunkiem zachowania ostrożności w celu uniknięcia odwodnienia. Metody te można również zastosować do oceny działania środków farmakologicznych wprowadzonych z dietą lub do badania różnych etapów rozwoju w liniach mutacyjnych bądź po indukcji genów szoku termicznego.
3. Pierwszą metodę bez unieruchamiania nazywamy „farmą mrówek”. Technika ta polega na zastosowaniu dwóch szklanych płytek oddzielonych cienką warstwą pożywki dla larw. Dzięki temu larwy można wizualizować w jednej płaszczyźnie ostrości. Technika ta była również stosowana do monitorowania za pomocą aktywności elektrycznej ruchu okołodobowego u larw (Cooper and Cooper, 2004). Układ składa się z dwóch szklanych płytek (szkiełka przedmiotowe; 75 x 25 mm; J. Melvin Freed Brand) rozmieszczonych w niewielkiej odległości (od 1 do 1,5 mm) za pomocą cienkiej warstwy pożywki dla larw (np. wilgotna mąka kukurydziana – zmodyfikowana wersja wg Lewis, 1960), tak aby larwy można było wizualizować w jednej płaszczyźnie ostrości. Dystansery powszechnie stosowane do płytek do elektroforezy żelowej (mini gel Bio-Rad; Life Science Research, Hercules, CA 94547, USA) sprawdzają się bardzo dobrze, ponieważ można je nabyć o różnych grubościach, dostosowanych do procedur „farmy mrówek” dla larw 1., 2. lub 3. stadium. Opcją jest również użycie litego plastiku o określonej grubości i wycięcie obszaru, który będzie służył jako przestrzeń do pełzania.
4. Aby zapobiec pełzaniu larw poza krawędzie dwóch szklanych płytek, stosuje się plastik o pożądanej grubości. Lekkie nachylenie platformy pod kątem od 20 do 45 stopni sprawia, że larwy przez większość czasu pozostają z głową skierowaną w dół, a ich odwłok zawierający przetchawki znajduje się nad pożywką lub w kanale powietrznym w warstwie pożywki.
5. Ta „technika farmy mrówek” umożliwia również obrazowanie wideo w jednej płaszczyźnie przy zastosowaniu pożywki o jednolitej grubości. W tej konfiguracji larwy zazwyczaj nie pełzają przez całą pożywkę, lecz żerują i stopniowo przemieszczają się w płaszczyźnie 2D. Światło białe jest rzutowane od spodu stolika mikroskopowego za pomocą lustra, tak aby można było je odpowiednio przesuwać dla uzyskania najlepszego kontrastu serca lub dwóch tchawic, które poruszają się podczas skurczu serca. Użyto mikroskopu (regulowany zoom od 0,67 do 4,5; World Precision Instrument; Model 501379). Zastosowano obiektyw podstawowy 2X oraz obiektyw tubusowy 0,5X, aby uzyskać wystarczającą rozdzielczość przestrzenną i powiększenie obejmujące prostokąt o wymiarach 1 cm na 0,5 cm. Kamera zamontowana przez uchwyt trójokularowy (Mintron, MTV; World Precision Instrument). Temperatura otoczenia jest utrzymywana na poziomie 20°C.
   
   
   Rycina 1. Widok grzbietowy nienaruszonej larwy 3^rd stadium. Do obserwacji częstości akcji serca wykorzystuje się ruch tchawic wynikający z pociągania za przyczepy do serca.
6. Aby monitorować swobodnie poruszające się zwierzę, można nanieść kilka kropel rozcieńczonej mieszanki pożywki nad głowę zwierzęcia. Należy to zrobić w szklanej szalce, aby światło przechodzące mogło przejść przez larwy, umożliwiając wizualizację rurki serca. Do obserwacji bicia serca i zliczania skurczów można użyć takiego samego zestawu mikroskopowego, jak opisano powyżej.
7. Innym podejściem jest unieruchomienie larwy w jednym miejscu za pomocą dwustronnej taśmy klejącej na szkiełku przedmiotowym i przyłożenie strony brzusznej larwy do taśmy (Baker et al., 1999). Jednak to podejście nie sprawdza się dobrze, jeśli taśma namoknie podczas karmienia larw. Aby zapobiec namoczeniu taśmy, można zastosować wazelinę (wprowadzoną z małej igły wokół podstawy larwy i wokół krawędzi taśmy). W ten sposób można karmić larwę w czasie, bez konieczności śledzenia jej w płaszczyźnie ostrości lub podczas poruszania się po szalce. Jeśli chcemy uwolnić larwy, taśmę można zwilżyć, co spowoduje utratę jej przyczepności do zwierzęcia.

Jeśli nie planuje się uwalniania larw do przeprowadzania doświadczeń, można zastosować trwałą metodę unieruchomienia larwy poprzez przyklejenie zwierzęcia do szkiełka przedmiotowego. Przy zastosowaniu metody z użyciem superkleju zwierzę może żerować, a nawet być pokryte wilgotnym roztworem, pozostając przytwierdzonym do szkiełka nakrywki. Procedury są następujące:

1. Należy wziąć czyste szkiełko przedmiotowe i umieścić na jednym z jego końców szkiełko nakrywkowe.
2. Należy nanieść niewielką ilość superkleju na jeden z narożników szkiełka nakrykowego.
3. Należy zlokalizować larwę Drosophila i wyjąć ją z probówki.
4. Larwę należy umieścić w szalce Petriego i wypłukać niewielką ilością wody, aby usunąć nadmiar pożywki.
5. Pozostałości pożywki należy wchłonąć narożnikiem małej chusteczki lub ręcznika papierowego.
6. Przy pomocy pęsety należy delikatnie podnieść larwę i umieścić ją na szkiełku przedmiotowym po przeciwnej stronie niż szkiełko nakrywkowe.
7. Należy umieścić szkiełko pod mikroskopem i ustawić soczewki na larwie. Larwa powinna leżeć na brzuchu, grzbietem do góry. Dwie strony ciała larwy można odróżnić po dwóch „pasach wyścigowych” na grzbiecie, którymi są tchawki. Brzuch posiada słabo widoczne poziome bruzdy biegnące wzdłuż ciała z bardzo drobnymi czarnymi włoskami.
8. Jeśli larwa jest skierowana w niewłaściwą stronę, należy ją po prostu obrócić, delikatnie odwracając ją pęsetą.
9. Przy użyciu nowej pęsety, przeznaczonej wyłącznie do kleju, należy pobrać niewielką ilość kleju z kropli na końcu szkiełka nakrykowego i nanieść ją na narożnik przeciwległego końca. Należy użyć minimalnej ilości kleju, zaledwie tyle, by pokryć końcówkę pęsety. Należy również pamiętać o wytarciu końców pęsety, aby nie skleiły się one ze sobą.
10. Pod mikroskopem należy ponownie sprawdzić, czy larwa nadal znajduje się w prawidłowej pozycji. Jeśli się obróciła, należy postąpić zgodnie z krokiem ósmym.
11. Następnie, za pomocą pęsety używanej do manipulowania larwą, należy podnieść larwę i delikatnie umieścić ją na świeżej plamce kleju. Należy upewnić się, że czarne haczyki gębowe znajdują się blisko krawędzi szkiełka nakrykowego lub na jego krawędzi, a ani one, ani brązowe przetchlinki nie mają kontaktu z klejem.
12. Należy ostrożnie docisnąć larwę, aby ją spłaszczyć.
13. Gdy larwa jest już na miejscu, można podać substancje przeznaczone do testów.
14. Najlepiej zrobić to za pomocą strzykawki, pobierając substancję i podając ją w małych dawkach przy głowie larwy w celu jej spożycia.
15. Na koniec częstość akcji serca można zaobserwować, licząc liczbę pulsacji przetchlinków w ciągu jednej minuty.

In situ: Disekcja i pomiar częstotliwości uderzeń serca:

Preparaty są rozcinane wzdłuż środkowej osi podbrzusznej i rozpłaszczone za pomocą szpilek. Naczynie do preparowania składało się z szkiełka podstawowego (VWR) z przyklejoną do jednej strony taśmą magnetyczną (Best Buys retail out-let). Otwór w centrum paska magnetycznego umożliwia oglądanie preparatu w świetle przechodzącym. Szpilki sekcyjne (Fine Scientific Tools, WA) są zginane i przyklejane do spinaczy biurowych. Spinacze te są łatwo przemieszczane po taśmie magnetycznej, aby utrzymać rozcięty preparat w odpowiedniej pozycji. Ten typ naczynia do rejestracji został wcześniej opisany w kontekście unieruchamiania zwojów izolowanych z brzusznego sznura nerwowego pijawki (Muller et al., 1981).

1. Umieść nienaruszoną larwę trzeciego stadium na płytce do sekcji. Obróć larwę na stronę brzuszną, aż tchawki przestaną być widoczne przez kutykulę.
2. Wbij cztery szpilki w nienaruszoną larwę. Dwie szpilki umieść po obu stronach haczyków gębowych, a dwie pozostałe po obu stronach przetchlinek.
3. Dodaj roztwór soli fizjologicznej i wykonaj nacięcie poziome w niewielkiej odległości od szpilek przy głowie, a następnie kontynuuj nacięcie poziome wzdłuż osi podłużnej.
4. Przerwij cięcie w niewielkiej odległości od serca właściwego. Wykonaj cięcie wokół serca właściwego oraz wzdłuż przetchlinek.
5. Podnieś jedną szpilkę grzbietową i zahacz ją pod kutykulą. Użyj szpilki, aby otworzyć jamę ciała i ją rozszerzyć. Powtórz tę czynność z pozostałymi szpilkami.
6. Usuń przewód pokarmowy, uważając, aby nie uszkodzić tchawki ani serca. Należy zauważyć, że niektóre struktury są przytwierdzone do serca i mogą je uszkodzić podczas usuwania. Zaliczają się do nich kilka ciał tłuszczowych oraz mózg. Jeśli zauważysz, że serce jest rozciągane podczas usuwania wnętrzności, natychmiast przestań próbować usuwać daną strukturę.

Serce jest teraz odsłonięte i gotowe do poddania działaniu warunków eksperymentalnych.

Rycina 2. Sekcja brzuszna larwy w 3^rd stadium w celu bezpośredniego odsłonięcia serca. Przypięcie zwierzęcia na grzbiecie po sekcji służy do bezpośredniej aplikacji związków na serce, z zachowaniem lub bez zachowania nienaruszonego OUN. Mała strzałka wskazuje miejsce oddzielenia serca od aorty na potrzeby badań nad przeciętym naczyniem grzbietowym (patrz poniżej). Tr, tchawka; Sp, przetchlinki; H, serce; AO, aorta.

Ta technika sekcji była stosowana do bezpośredniej oceny działania środków farmakologicznych na serce larw Drosophila (Gu i Singh, 1995). Czas sekcji wynosi 3-6 min. Po sekcji preparat pozostawia się do odzyskania równowagi w roztworze soli HL3 przez 3-5 min.

Roztwór soli fizjologicznej HL3 był starannie kontrolowany, aby utrzymać pH 7,2, ponieważ częstość akcji serca (HR) spada przy wysokim pH i wzrasta przy niższym pH (Badre et al., 2005). Gu i Singh (1995) stosowali pH 7,0 do analizy farmakologicznej serca, wykazując również zachowanie żywotności. Podczas tych prób roztwór był napowietrzany poprzez mieszanie soli fizjologicznej, polegające na wielokrotnym wstrzykiwaniu jej do zlewki za pomocą igły o rozmiarze 21G.

Aby określić częstotliwość akcji serca (HR), można zastosować bezpośrednią obserwację lub zarejestrować obrazy na kasetach VHS lub kamerą cyfrową w celu późniejszego odtworzenia na ekranie. Wcześniej opisano metodę z wykorzystaniem fotodiody (Dasari and Cooper, 2006).

Ekspozycja na szok termiczny:

1. Wykonaj sekcję larwy.
2. Umieść zdyssekowany preparat na szkiełku nakrywce.
3. Podgrzej kąpiel wodną.
4. Sprawdź temperaturę wewnątrz kąpieli, umieszczając sondę temperaturową na pływającej nakładce.
5. Po osiągnięciu odpowiedniej temperatury umieść preparat wraz z szkiełkiem nakrywką w kąpieli.
6. Pozostaw preparat na żądany czas, a następnie wyjmij go po zakończeniu procesu.

Można zastosować dowolny impuls ciepła oraz temperaturę wymaganą do przeprowadzenia eksperymentu.

Stymuluj elektrycznie serce w celu nadania rytmu:

1. Napełnij elektrodę ogniskową (o średnicy około 20 µm), używając strzykawki włożonej i uszczelnionej na otwartym końcu, a następnie wciągając sól fizjologiczną dla muszek (HL3) w temperaturze pokojowej (21° C) do wnętrza elektrody. Zamontuj elektrodę w manipulatorze, upewniając się, że drut znajduje się w soli fizjologicznej wewnątrz elektrody, a stymulator jest wyłączony.
2. Umieść preparat wypreparowanego serca larwy Drosophila w trzecim stadium larwalnym pod mikroskopem sekcyjnym i zabezpiecz go w miejscu. Wprowadź drut uziemiający do soli fizjologicznej preparatu, uważając, aby nie dotknął on szpilek ani krawędzi preparatu.
3. Użyj manipulatora, aby ustawić końcówkę elektrody na górnej części serca, dostosowując w razie potrzeby ostrość mikroskopu. Najlepszą metodą osiągnięcia tego celu jest ustawienie ostrości na elektrodzie podczas przesuwania końcówki w dół.
4. Gdy końcówka znajdzie się w odpowiedniej pozycji, należy włączyć stymulator (model S9 Grass Instruments, Quincy, Massachusetts, USA), ustawiając częstotliwość na 2 Hz, czas trwania impulsu od 0,5 do 1 ms oraz napięcie na najniższej wartości. Ustawienie opóźnienia (delay) powinno wynosić od 12 do 14.
5. Obserwując rytm serca, należy zwiększyć częstotliwość do około 3 Hz i powoli podnosić napięcie, aż zaobserwowany rytm serca będzie odpowiadał rytmowi generowanemu przez stymulator. Zazwyczaj wypreparowane serce muszki bije z częstotliwością około 2 Hz, zatem gdy rytm stymulowany jest wyższy niż rytm własny, serce będzie bić szybciej niż normalnie. Napięcie nie powinno przekraczać około 20 V, ponieważ wysokie napięcia mogą spowodować uszkodzenie komórek, czyniąc preparat bezużytecznym. Zazwyczaj serce można stymulować przy napięciu od 2 do 8 V, w zależności od odległości i stopnia uszczelnienia styku z sercem.
6. Jeśli osiągnięto maksymalne napięcie i nie zaobserwowano efektu, można zmienić polaryzację. Jeśli to również nie zadziała, należy przesunąć sondę, aby lepiej ustanowić połączenie z sercem.
7. Po ustanowieniu rytmu sterowanego stymulacją, można nim manipulować, zmieniając ustawienia częstotliwości i czasu trwania impulsu. Należy jednak pamiętać, że częstotliwości powyżej 4 Hz mogą doprowadzić do tetanii serca. Po ustanowieniu pożądanego rytmu można dodawać różne alkohole i środki farmakologiczne, aby zaobserwować ich wpływ na połączenia szczelinowe. Zablokowane połączenia szczelinowe nie przewodzą prądu, co spowoduje ustanie propagacji rytmu.
   
   
   Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.

Pomiar potencjałów polowych:

1. Elektrody szklane wykonuje się ze szkła Kimax (średnica zewnętrzna: 1.5 mm). Rurkę szklaną wyciąga się i poleruje ogniowo, aby uzyskać końcówki do patch-clampu o średnicach wewnętrznych od 10 do 20 μm.
2. Światło elektrody wypełnia się medium kąpielowym. Wzmacniacz oraz system rejestracji połączony z komputerem są takie same, jak te użyte poniżej do pomiarów wewnątrzkomórkowych.
3. Światło elektrody rejestrującej typu „macro-patch” (Stühmer et al.,1983) umieszcza się bezpośrednio nad obszarem serca. Spontaniczne tempo pracy włókien mięśniowych generuje potencjał polowy, który można monitorować za pomocą elektrody ogniskowej.
4. Należy zachować ostrożność, delikatnie obniżając i podnosząc światło elektrody nad każdym monitorowanym obszarem serca. Potencjały są rejestrowane za pomocą elektrody macro-patch.

Możliwe jest bezpośrednie zliczanie częstotliwości akcji serca oraz monitorowanie zdarzeń elektrycznych. W celu oceny wpływu na potencjały polowe możliwe jest również zmienianie pożywki podczas rejestracji tych potencjałów.

Pomiar potencjałów wewnątrzkomórkowych:

Aby monitorować potencjały błonowe miocytów, w obszar serca wprowadza się ostrą elektrodę wewnątrzkomórkową (oporność od 20 do 30 mOhm) wypełnioną 3 M KCl. Można zastosować standardowy przedwzmacniacz i wzmacniacz do rejestracji wewnątrzkomórkowej; w tym przypadku wykorzystano wzmacniacz Axonclamp 2B (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA) oraz przedwzmacniacz 1 X LU. Wydaje się, że tylny koniec serca jest sztywniejszy i to tam znajdują się komórki rozrusznikowe, ponieważ w większości przypadków skurcz rozpoczyna się w tym obszarze (Badre et al., 2005; Dasari and Cooper 2006; Dasari et al., 2007).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Narzędzia do sekcji: Precyzyjne pęsety nr 5 i precyzyjne nożyczki (wszystkie zakupione w Fine Science Tools (USA), Inc., 373-G Vintage Park Drive, Foster City, CA 94404-1139) Mikroskop sekcyjny z funkcją zoom do sekcji i pomiaru tętna. Jest on również niezbędny do ogniskowej stymulacji serca. Do rejestracji zewnątrzkomórkowej i wewnątrzkomórkowej stosuje się mikroskop złożony z obiektywami pionowymi (4x i 20X). Standardowy wzmacniacz wewnątrzkomórkowy i karta A/D do rejestracji online w komputerze. Sygnały elektryczne są rejestrowane online za pomocą interfejsu PowerLab/4s (ADInstruments, Australia). Stosujemy standardowe oprogramowanie firmy ADInstruments o nazwie Chart lub Scope. Odczynniki chemiczne: Wszystkie odczynniki do roztworów soli fizjologicznych pochodzą z firmy chemicznej Sigma (St. Louis, MO). Do rejestracji wewnątrzkomórkowej stosujemy szklane rurki kapilarne (nr katalogowy 30-31-0 z FHC, Brunswick, ME, 04011, USA), a do ogniskowej rejestracji macropatch oraz jako elektrody stymulujące stosujemy Kimax-51, Kimble Products Art. No. 34502, ID 0,8-1,1 mm, długość 100 mm. Elektroda wewnątrzkomórkowa powinna mieć rezystancję od 20 do 30 mOhm. Elektrodę macropatch wykonuje się poprzez odłamanie końcówki szkła po uformowaniu cienkiego wierzchołka za pomocą wyciągarki do elektrod. Odłamana końcówka musi stanowić czyste, prostopadłe pęknięcie o średnicy około 20μM. Następnie końcówkę poleruje się termicznie do średnicy wewnętrznej około 10μM w celu ogniskowej rejestracji zewnątrzkomórkowej. W przypadku elektrody stymulującej do pobudzania serca stosujemy końcówkę o średnicy około 20-50 μM. Trzon elektrody przesuwa się nad elementem grzejnym, aby wygiąć go łagodnie pod kątem około 45 stopni. Powoduje to uzyskanie płaskiego lub prostopadłego światła elektrody nad rurką serca, ponieważ kąt ustawienia mikromanipulatora stworzy kolejne około 45 stopni względem preparatu.