Monitorowanie funkcji serca u larw Drosophila melanogaster w badaniach fizjologicznych

Podsumowanie

Przedstawiamy różne metody monitorowania funkcji serca u larw Drosophila w celu analizy kwestii dotyczących funkcji złączy szczelinowych, mutacji kanałów jonowych, modulacji aktywności rozrusznika oraz w badaniach farmakologicznych.

Streszczenie

Prezentujemy różne metody rejestracji funkcji serca u larwDrosophilaPodejścia te pozwalają na pomiar tętna u nieunieruchomionych i unieruchomionych larw w całości. W celu bezpośredniej kontroli środowiska wokół serca inne podejście wykorzystuje rozcierane larwy i usunięcie organów wewnętrznych, aby móc kąpać serce w wybranych związkach. Odsłonięte serce pozwala również na monitorowanie potencjałów błonowych, co może dostarczyć informacji o prądach jonowych generowanych przez miocyty oraz o przewodnictwie elektrycznym wzdłuż rurki serca. Omówiono różnorodne zalety i wady tych podejść w kontekście przyszłych eksperymentów. Preparat serca larwalnego stanowi dodatkowy model obokDrosophilaszkieletowe NMJ w celu zbadania roli wewnątrzkomórkowej regulacji wapnia w funkcji komórkowej. Dzięki pogłębieniu wiedzy na temat podstawowych prądów jonowych kształtujących potencjały czynnościowe w miocytach różnych gatunków, można dążyć do zrozumienia znanych dysfunkcji jonowych związanych z konkretnymi genami odpowiedzialnymi za różne choroby u ssaków.

Protokół

WSTĘP

Mechanizmy komórkowe odpowiedzialne za funkcję serca u owadów i kręgowców są zdumiewająco podobne. Drosophila melanogaster są wykorzystywane do badania mutacji genowych odpowiedzialnych za stany chorobowe u innych zwierząt, w tym u ludzi (Bier and Bodmer, 2004; Peron et al., 2009). Obecnie w tym łatwym genetycznie organizmie indukuje się różne choroby (Dowse et al., 1995; Johnson et al., 1998; Ganetzky, 2000; Bier and Bodmer, 2004; Ocorr et al., 2007a, b) z nadzieją, że w przyszłości możliwe będzie testowanie terapii genowej w celu przywrócenia prawidłowej funkcji. Ponadto Drosophila służą jako dobry model funkcji fizjologicznych na poziomie komórkowym.

Wiele z poprzednich badań nad Muszka owocówka serca koncentrowały się na aspektach rozwojowych w embrionie (Azpiazu i Frasch 1993, Bodmer 1993, Bodmer i wsp.. 1990). Kilka badań nad funkcjami fizjologicznymi przeprowadzono w stadiach przedpoczwkowym, poczwkowym lub dorosłym (Ashton it al.., 2001; He i Adler, 2001; Molina i Cripps, 2001; Ponzielli i wsp.., 2002; Sláma i Farkaš, 2005; Wessells i Bodmer, 2004). Jednak stadium poczwarki jest okresem metamorfozy i zmian hormonalnych, a także wahań poziomów różnych amin biogennych. Ponadto serce przechodzi transformację strukturalną, która może utrudnić kontrolę zmiennych podczas badania fizjologii miocytów (Dulcis i wsp.. 2005; Johnson i wsp.. 2002; Miller, 1997; Papaefthimiou i Theophilidis, 2001). Wiadomo, że serce w stadium larwalnym jest miogenne i może zostać łatwo usunięte lub pozostawione in situ podczas kąpieli w określonym roztworze soli fizjologicznej w celu ograniczenia zmiennych zakłócających, takich jak krążące hormony lub peptydy (Dowse i wsp.. 1995; Johnson i in.. 1997; Dasari i Cooper, 2006; Feng i wsp.. 2004). Miogeniczny charakter serca larwalnego jest porównywalny do serca ssaków pod względem istnienia rozruszników, które wymuszają pracę pozostałej części serca w celu pompowania płynu w kierunku zapewniającym efektywne obmywanie organów. Charakter chronotropowy i ionotropowy... Muszka owocówka Serce larwy jest interesujące, ponieważ może służyć jako szybka metoda testowania fundamentalnych zasad i efektów patologicznych dla funkcji serca ssaków, a także pomagać w opracowaniu modelu porównawczego fizjologii komórkowej, takiej jak regulacja jonowa komórek rozrusznikowych.

Serce larwy jest bardzo podatne na działanie amin biogennych i peptydów, których stężenie w hemolimfie zmienia się w zależności od źródła pokarmu lub stanu wewnętrznego zwierzęcia (Dasari and Cooper, 2006; Johnson et al. 1997, 2000; Nichols et al. 1999; Zornik et al. 1999). Interesujące jest zbadanie mechanizmów, poprzez które związki endogenne lub egzogenne wpływają na pracę serca. Lepsze zrozumienie fizjologii i farmakologii owadów może pozwolić na opracowanie nowych insektycydów o mniejszym wpływie na inne organizmy.

Komórkowy mechanizm działania neurotransmiterów i modulatorów kardiologicznych u larw nie został dotychczas opisany, ponieważ nie opracowano wystarczającej wiedzy na temat prądów jonowych i rodzajów kanałów obecnych w sercu larwy, które przyczyniają się do aktywności rozrusznika i ją regulują. Z naszej wiedzy nie istnieją raporty dokumentujące zewnątrz- lub wewnątrzkomórkowe pomiary z miocytów w celu oceny prądów jonowych, co pozwoliłoby określić mechanistyczne efekty działania modulatorów u larw Drosophila.

W niniejszym raporcie przedstawiamy różne metody rejestrowania częstotliwości akcji serca oraz właściwości fizjologicznych serca larwalnego.

METODY

Nieuszkodzone larwy:

1. Dobrym sposobem wizualizacji nienaruszonego, bijącego serca larwy jest bezpośrednia obserwacja pod mikroskopem; jednak larwa musi pozostawać wystarczająco nieruchoma, aby można było policzyć skurcze. Opracowaliśmy metody monitorowania częstości pracy serca zarówno u larw swobodnie poruszających się, jak i u larw unieruchomionych. W zależności od pytania badawczego jedno z tych podejść może być bardziej odpowiednie od drugiego.
2. Podejścia te mogą być wykorzystane do śledzenia pojedynczego osobnika przez dłuższy czas, pod warunkiem zachowania ostrożności, aby uniknąć odwodnienia. Metody te mogą być również stosowane do oceny czynników farmakologicznych wprowadzanych do diety lub do badania różnych etapów rozwoju w liniach mutacyjnych lub przy indukcji genów szoku termicznego.
3. Pierwszą metodę bez unieruchamiania nazywamy „farmą mrówek”. Technika ta polega na zastosowaniu dwóch płyt szklanych oddzielonych cienką warstwą pokarmu dla larw. Dzięki temu larwy mogą być wizualizowane w jednej płaszczyźnie ogniskowania. Technika ta była również stosowana do monitorowania aktywności elektrycznej rytmu okołodobowego u larw (Cooper i Cooper, 2004). Metoda ta składa się z dwóch płytek szklanych (szkiełka przedmiotowe; 75 x 25 mm; J. Melvin Freed Brand) rozmieszczonych w niewielkich odstępach (1 do 1,5 mm) za pomocą cienkiej warstwy pokarmu dla larw (np. wilgotna mączka kukurydziana – zmodyfikowana wersja wg Lewis, 1960), tak aby larwy mogły być wizualizowane w jednej płaszczyźnie ogniskowania. Bardzo dobrze sprawdzają się dystanse powszechnie stosowane do płytek do elektroforezy żelowej (mini gel Bio-Rad; Life Science Research, Hercules, CA 94547, USA), ponieważ można je nabyć o różnej grubości do stosowania w procedurach „farmy mrówek” dla larw 1., 2. lub 3. stadium rozwojowego. Opcją jest również użycie litego tworzywa sztucznego o określonej grubości i wycięcie obszaru, który będzie służył jako przestrzeń do pełzania.
4. Aby zapobiec pełzaniu larw poza krawędzie dwóch szklanych płytek, stosuje się tworzywo sztuczne o pożądanej grubości. Lekkie nachylenie platformy pod kątem od 20 do 45 stopni sprawia, że larwy przez większość czasu pozostają z głową skierowaną w dół, a ogonem zawierającym przetchawki ponad pokarmem lub wewnątrz kanału powietrznego w warstwie pokarmu.
5. Ta „Technika Farmy Mrówek” pozwala również na obrazowanie wideo w jednej płaszczyźnie przy pokarmie o jednolitej grubości. W tej konfiguracji larwy nie mają tendencji do pełzania w głąb pokarmu, lecz zamiast tego jedzą i stopniowo poruszają się w płaszczyźnie 2D. Białe światło jest rzutowane z dołu stolika mikroskopowego za pomocą lustra, tak aby można je było odpowiednio przesuwać w celu uzyskania najlepszego kontrastu serca lub dwóch tchawicek, które poruszają się podczas skurczu serca. Używany jest mikroskop (regulowany zoom 0,67 do 4,5; World Precision Instrument; Model 501379). Wykorzystuje się obiektyw podstawowy 2X oraz obiektyw tubusowy 0,5X, aby uzyskać wystarczającą rozdzielczość przestrzenną i powiększenie obejmujące prostokąt o wymiarach 1 cm na 0,5 cm. Używana jest kamera zamontowana przez uchwyt trójokularowy (Mintron, MTV; World Precision Instrument). Temperatura otoczenia jest utrzymywana na poziomie 20°C.
   
   
   Rycina 1. Widok grzbietowy nienaruszonej larwy 3^ego stadium rozwojowego. Ruch tchawicek wynikający z pociągania przyczepów przez serce jest wykorzystywany do obserwacji częstości pracy serca.
6. Aby monitorować swobodnie poruszające się zwierzę, można nanieść kilka kropel rozcieńczonej mieszanki pokarmowej nad głową zwierzęcia. Powinno to być wykonane w szklanej szalce, aby światło przechodzące mogło przejść przez larwy w celu wizualizacji rurki serca. Do obserwacji bicia serca i uzyskania odczytów można użyć tego samego zestawu mikroskopowego, opisanego powyżej.
7. Innym podejściem jest unieruchomienie larwy w jednym miejscu za pomocą dwustronnej taśmy klejącej na szkiełku przedmiotowym i przyłożenie strony brzusznej larwy do taśmy (Baker et al., 1999). Jednak to podejście nie sprawdza się dobrze, jeśli taśma namoczy się podczas karmienia larw. Aby uniknąć zamoczenia taśmy, można zastosować wazelinę (wprowadzaną z małej igły wokół podstawy larw i wokół krawędzi taśmy). W ten sposób można karmić larwy w czasie, bez konieczności śledzenia ich w płaszczyźnie ogniskowania lub podczas gdy poruszają się po szalce. Jeśli chce się uwolnić larwy, taśmę można zwilżyć, co spowoduje utratę jej przyczepności do zwierzęcia.

Jeśli nie ma potrzeby uwalniania larw do dalszych doświadczeń, można zastosować trwałą metodę unieruchomienia larwy poprzez przyklejenie zwierzęcia do szkiełka przedmiotowego. Przy zastosowaniu metody z użyciem superglue zwierzę może pobierać pokarm, a nawet być pokryte wilgotnym roztworem, pozostając przytwierdzonym do szkiełka nakrywkowego. Procedury są następujące:

1. Weź czyste szkiełko i umieść na jednym z jego końców szkiełko nakrywkę.
2. Nałóż małą kropkę superglue w jednym z narożników szkiełka nakrywki.
3. Zlokalizuj larwę Drosophila i wyjmij ją z probówki.
4. Umieść larwę w szalce Petriego i opłucz ją niewielką ilością wody, aby usunąć nadmiar pożywki.
5. Osusz pozostałości pożywki narożnikiem małej chusteczki lub ręcznika papierowego.
6. Delikatnie chwyć larwę pęsetą i umieść ją na szkiełku po przeciwnej stronie niż szkiełko nakrywka.
7. Umieść szkiełko pod mikroskopem i ustaw soczewki na larwie. Larwa powinna leżeć na brzuchu, z grzbietem skierowanym do góry. Dwie strony larwy można rozpoznać po tym, że na grzbiecie znajdują się dwa „pasy wyścigowe”, które są tchawicami. Brzuch posiada słabo widoczne poziome bruzdy biegnące wzdłuż ciała z bardzo drobnymi, czarnymi włoskami.
8. Jeśli larwa jest skierowana w niewłaściwą stronę, po prostu odwróć ją, delikatnie przekładając pęsetą.
9. Za pomocą nowej pęsety, używanej specjalnie do kleju, nabierz niewielką ilość kleju z kropli na końcu szkiełka nakrywki i nałóż ją w narożniku przeciwległej strony. Należy użyć minimalnej ilości kleju; wystarczy tyle, aby pokrył końcówkę pęsety. Należy również wytrzeć końce pęsety, aby nie skleiły się ze sobą.
10. Pod mikroskopem upewnij się, czy larwa nadal znajduje się w prawidłowej pozycji. Jeśli się obróciła, wykonaj krok ósmy.
11. Teraz, używając pęsety przeznaczonej do manipulowania larwą, chwyć ją i delikatnie umieść na świeżej plamce kleju. Upewnij się, że czarne haczyki gębowe znajdują się blisko lub na krawędzi szkiełka nakrywki i że ani one, ani brązowe przetchlinki nie mają kontaktu z klejem.
12. Ostrożnie dociśnij larwę, aby ją spłaszczyć.
13. Gdy larwa jest już na miejscu, można podać substancje, które mają zostać przetestowane.
14. Najlepiej zrobić to za pomocą strzykawki, pobierając substancję i podając ją w małych dawkach przy głowie larwy, aby mogła ją przyjąć.
15. Na koniec można zaobserwować czynność serca, licząc liczbę pulsacji przetchlinek w ciągu jednej minuty.

In situ: Disekcja i pomiar częstości akcji serca:

Preparaty rozcina się wzdłuż środkowej osi podłużnej strony brzusznej, a następnie przypina na płasko. Pojemnik do preparacji składał się z szkiełka przedmiotowego (VWR) z przyklejoną z jednej strony taśmą magnetyczną (sklep detaliczny Best Buys). Otwór w centrum paska magnetycznego umożliwia oglądanie preparatu w świetle przechodzącym. Szpilki sekcyjne (Fine Scientific Tools, WA) są zginane i przyklejane do spinaczy biurowych. Spinacze można łatwo przesuwać po taśmie magnetycznej, aby utrzymać rozciętą preparację w miejscu. Ten typ pojemnika rejestracyjnego został wcześniej opisany w kontekście unieruchamiania zwojów izolowanych z brzusznego sznura nerwowego pijawki (Muller et al., 1981).

1. Umieść nienaruszoną larwę w 3. stadium rozwojowym na płytce do sekcji. Obracaj larwę na stronę brzuszna, aż tchawice przestaną być widoczne przez kutykulę.
2. Wbij cztery szpilki w nienaruszoną larwę. Dwie szpilki umieść po obu stronach haczyków gębowych, a dwie po obu stronach przetchlinek.
3. Dodaj roztwór soli fizjologicznej i wykonaj nacięcie poziome w niewielkiej odległości od szpilek przy głowie, następnie kontynuuj nacięcie poziome wzdłuż osi podłużnej ciała.
4. Przerwij cięcie w niewielkiej odległości od serca prawdziwego. Wykonaj cięcia wokół serca prawdziwego oraz wzdłuż przetchlinek.
5. Podnieś jedną szpilkę grzbietową i zahacz ją pod kutykulą. Użyj szpilki, aby otworzyć jamę ciała i ją rozszerzyć. Powtórz tę czynność z pozostałymi szpilkami.
6. Usuń przewód pokarmowy, uważając, aby nie uszkodzić tchawic ani serca. Należy pamiętać, że niektóre struktury są przytwierdzone do serca i mogą je uszkodzić podczas usuwania. Dotyczy to kilku ciał tłuszczowych oraz mózgu. Jeśli zauważysz, że serce jest rozciągane podczas usuwania wnętrzności, natychmiast zaprzestań próby usunięcia danej struktury.

Serce jest teraz odsłonięte i gotowe do poddania go warunkom eksperymentalnym.

Rycina 2. Disekcja brzuszna osobnika w 3^rd stadium larwalnym w celu bezpośredniej obserwacji serca. Przypięcie zwierzęcia na grzbiecie po disekcji służy do bezpośredniego aplikowania związków na serce, z zachowaniem lub bez zachowania ciągłości OUN. Mała strzałka wskazuje miejsce oddzielenia serca od aorty na potrzeby badań naczynia grzbietowego po przecięciu (patrz poniżej). Tr, tchawka; Sp, przetchlinki; H, serce; AO, aorta.

Tę technikę sekcji stosowano do bezpośredniej oceny działania czynników farmakologicznych na serce larw Drosophila (Gu i Singh, 1995). Czas sekcji wynosi 3-6 min. Po sekcji preparat pozostawia się do odpoczynku w kąpieli z soli fizjologicznej HL3 przez 3-5 min.

Roztwór soli HL3 był ściśle kontrolowany, aby utrzymać pH 7,2, ponieważ częstość akcji serca (HR) spada przy wysokim pH i wzrasta przy niższym pH (Badre et al., 2005). Gu i Singh (1995) zastosowali pH 7,0 do analizy farmakologicznej serca, wykazując również zachowanie żywotności tkanek. Podczas tych prób roztwór soli był napowietrzany poprzez mieszanie uzyskiwane przez wielokrotne wstrzykiwanie soli igłą o rozmiarze 21G do zlewki.

Aby określić częstotliwość akcji serca (HR), można zastosować bezpośrednie obserwacje lub zarejestrować obrazy na taśmach VHS bądź za pomocą kamery cyfrowej w celu późniejszego odtworzenia na ekranie. Wcześniej opisano metodę z wykorzystaniem fotodiody (Dasari and Cooper, 2006).

Ekspozycja na szok termiczny:

1. Wykonaj sekcję larwy.
2. Umieść zsekowany preparat na szkiełku nakrywkowym.
3. Podgrzej kąpiel wodną.
4. Sprawdź temperaturę wewnątrz kąpieli, umieszczając sondę temperatury na pływającym szkiełku nakrywkowym.
5. Po osiągnięciu odpowiedniej temperatury umieść preparat wraz ze szkiełkiem nakrywkowym w kąpieli.
6. Pozostaw preparat w kąpieli przez wymagany czas, a następnie wyjmij go po zakończeniu procesu.

Można zastosować każdy impuls cieplny i temperaturę wymaganą do przeprowadzonych doświadczeń.

Stymuluj elektrycznie serce w celu nadania rytmu:

1. Napełnij elektrodę ogniskową (o średnicy około 20 µm), używając strzykawki wstawionej i uszczelnionej na otwartym końcu, i zaciągając do elektrody sól fizjologiczną dla much (HL3) w temperaturze pokojowej (21° C). Zamocuj elektrodę w manipulatorze, upewniając się, że drut znajduje się w soli fizjologicznej wewnątrz elektrody, a stymulator jest wyłączony.
2. Umieść preparat wypreparowanego serca larwy Drosophila w 3. stadium larwalnym pod mikroskopem sekcyjnym i zabezpiecz go w miejscu. Umieść drut uziemiający w soli fizjologicznej preparatu, uważając, aby nie dotknął on pinów ani ścianek naczynia z preparatem.
3. Użyj manipulatora, aby ustawić końcówkę elektrody na górnej części serca, regulując w razie potrzeby ostrość mikroskopu. Najlepszym sposobem na osiągnięcie tego jest ustawienie ostrości na elektrodzie podczas przesuwania końcówki w dół.
4. Gdy końcówka znajdzie się w odpowiedniej pozycji, należy włączyć stymulator (model S9 Grass Instruments, Quincy, Massachusetts, USA), ustawiając częstotliwość na 2 Hz, czas trwania od 0,5 do 1 ms oraz napięcie na najniższej wartości. Ustawienie opóźnienia (delay) powinno wynosić od 12 do 14.
5. Obserwując rytm serca, należy zmienić częstotliwość na około 3 Hz i powoli zwiększać napięcie, aż zaobserwowany rytm serca będzie odpowiadał rytmowi generowanemu przez stymulator. Zazwyczaj wypreparowane serce muchy bije z częstotliwością około 2 Hz, zatem gdy stymulowany rytm jest wyższy niż rytm wewnętrzny, serce będzie bić szybciej niż normalnie. Napięcie nie powinno przekraczać około 20 V, ponieważ przy wysokich napięciach może dojść do uszkodzenia komórek, co uczyni preparat bezużytecznym. Zazwyczaj serce można stymulować napięciem od 2 do 8 V, w zależności od odległości i szczelności połączenia z sercem.
6. Jeśli osiągnięto maksymalne napięcie i nie zaobserwowano efektu, można odwrócić polaryzację. Jeśli to również nie zadziała, należy przesunąć sondę, aby lepiej ustanowić połączenie z sercem.
7. Po ustanowieniu rytmu sterowanego stymulacją, można go modyfikować, zmieniając ustawienia częstotliwości i czasu trwania. Należy jednak pamiętać, że częstotliwości powyżej 4 Hz mogą doprowadzić do tetanii serca. Po ustanowieniu pożądanego rytmu można dodawać różne alkohole i środki farmakologiczne, obserwując ich wpływ na połączenia szczelinowe (gap junctions). Zablokowane połączenia szczelinowe nie przewodzą prądu, co spowoduje ustanie propagacji rytmu.
   
   
   Prosimy kliknąć tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.

Pomiar potencjałów polowych:

1. Elektrody szklane wykonuje się ze szkła Kimax (średnica zewnętrzna: 1,5 mm). Rurkę szklaną wyciąga się i poleruje ogniowo, aby uzyskać końcówki do patch-clamp o średnicach wewnętrznych od 10 do 20 μm.
2. Środek elektrody wypełnia się medium kąpielowym. Wzmacniacz oraz rejestracja danych przesyłane do komputera są identyczne z tymi, które zostały opisane poniżej w sekcji dotyczącej rejestracji wewnątrzkomórkowych.
3. Środek elektrody rejestrującej typu „macro-patch” (Stühmer et al.,1983) umieszcza się bezpośrednio nad obszarem serca. Spontaniczne tempo pracy włókien mięśniowych generuje potencjał polowy, który można monitorować za pomocą elektrody ogniskowej.
4. Należy zachować ostrożność, delikatnie obniżając i podnosząc końcówkę elektrody nad każdym monitorowanym obszarem serca. Potencjały są rejestrowane za pomocą elektrody macro-patch.

Możliwe jest bezpośrednie zliczanie częstotliwości skurczów serca oraz monitorowanie zdarzeń elektrycznych. W celu oceny wpływu na potencjały polowe możliwe jest również zmienianie składu medium hodowlanego podczas rejestracji tych potencjałów.

Pomiar potencjałów wewnątrzkomórkowych:

W celu monitorowania potencjałów błonowych miocytów, w obszarze serca wbija się ostrą elektrodę wewnątrzkomórkową (oporność od 20 do 30 mOhm) wypełnioną 3 M KCl. Można zastosować standardowy wzmacniacz i przedwzmacniacz (head stage) do rejestracji wewnątrzkomórkowej; w niniejszym badaniu wykorzystano wzmacniacz Axonclamp 2B (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA) oraz przedwzmacniacz 1 X LU. Wydaje się, że końcowy odcinek ogonowy serca jest bardziej sztywny i to tam znajdują się komórki rozrusznika, ponieważ skurczy najczęściej inicjowane są w tym regionie (Badre et al., 2005; Dasari and Cooper 2006; Dasari et al., 2007).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Narzędzia do sekcji: Precyzyjne pęsety nr 5 i precyzyjne nożyczki (wszystkie zakupione w Fine Science Tools (USA), Inc., 373-G Vintage Park Drive, Foster City, CA 94404-1139) Mikroskop sekcyjny z funkcją zoom do sekcji i pomiaru tętna. Jest on również niezbędny do ogniskowej stymulacji serca. Do rejestracji zewnątrzkomórkowej i wewnątrzkomórkowej stosuje się mikroskop złożony z obiektywami pionowymi (4x i 20X). Standardowy wzmacniacz wewnątrzkomórkowy i karta A/D do rejestracji online w komputerze. Sygnały elektryczne są rejestrowane online za pomocą interfejsu PowerLab/4s (ADInstruments, Australia). Stosujemy standardowe oprogramowanie firmy ADInstruments o nazwie Chart lub Scope. Odczynniki chemiczne: Wszystkie odczynniki do roztworów soli fizjologicznych pochodzą z firmy chemicznej Sigma (St. Louis, MO). Do rejestracji wewnątrzkomórkowej stosujemy szklane rurki kapilarne (nr katalogowy 30-31-0 z FHC, Brunswick, ME, 04011, USA), a do ogniskowej rejestracji macropatch oraz jako elektrody stymulujące stosujemy Kimax-51, Kimble Products Art. No. 34502, ID 0,8-1,1 mm, długość 100 mm. Elektroda wewnątrzkomórkowa powinna mieć rezystancję od 20 do 30 mOhm. Elektrodę macropatch wykonuje się poprzez odłamanie końcówki szkła po uformowaniu cienkiego wierzchołka za pomocą wyciągarki do elektrod. Odłamana końcówka musi stanowić czyste, prostopadłe pęknięcie o średnicy około 20μM. Następnie końcówkę poleruje się termicznie do średnicy wewnętrznej około 10μM w celu ogniskowej rejestracji zewnątrzkomórkowej. W przypadku elektrody stymulującej do pobudzania serca stosujemy końcówkę o średnicy około 20-50 μM. Trzon elektrody przesuwa się nad elementem grzejnym, aby wygiąć go łagodnie pod kątem około 45 stopni. Powoduje to uzyskanie płaskiego lub prostopadłego światła elektrody nad rurką serca, ponieważ kąt ustawienia mikromanipulatora stworzy kolejne około 45 stopni względem preparatu.