Cyfrowa mikroprzepływność w zautomatyzowanym przetwarzaniu proteomicznym

Podsumowanie

Cyfrowa mikrofluidyka to technika polegająca na manipulowaniu pojedynczymi kropelkami (~nL - mL) na matrycy elektrod poprzez przyłożenie pól elektrycznych. Jest ona odpowiednia do przeprowadzania szybkich, sekwencyjnych, zminiaturyzowanych zautomatyzowanych testów biochemicznych. W niniejszej pracy przedstawiamy platformę zdolną do automatyzacji kilku etapów przetwarzania proteomicznego.

Streszczenie

Proteomika kliniczna wyłoniła się jako ważna nowa dyscyplina, obiecująca odkrycie biomarkerów, które będą przydatne w wczesnej diagnostyce i prognozowaniu chorób. Choć metody proteomiki klinicznej są bardzo zróżnicowane, ich wspólną cechą jest konieczność (i) ekstrakcji białek z niezwykle heterogenicznych płynów (np. surowicy, krwi pełnej itp.) oraz (ii) rozległego przetwarzania biochemicznego przed analizą. W niniejszym opracowaniu przedstawiamy nową metodę opartą na cyfrowej mikrofluidyce (DMF), integrującą kilka etapów przetwarzania stosowanych w proteomice klinicznej. Obejmuje ona ekstrakcję białek, resolubilizację, redukcję, alkilację oraz trawienie enzymatyczne. Cyfrowa mikrofluidyka to mikroskalowa technika manipulacji płynami, w której krople o rozmiarach od nanolitrów do mikrolitrów są sterowane na otwartej powierzchni. Krople są umieszczane na matrycy elektrod pokrytych warstwą dielektryka – gdy do kropli przyłożony zostanie potencjał elektryczny, ładunki gromadzą się po obu stronach dielektryka. Ładunki te służą jako uchwyty elektrostatyczne, które mogą być wykorzystane do kontroli położenia kropli, a poprzez polaryzację sekwencji elektrod szeregowo można doprowadzić do dozowania, przemieszczania, łączenia, mieszania i rozdzielania kropel na powierzchni. W związku z tym DMF naturalnie nadaje się do przeprowadzania szybkich, sekwencyjnych, wieloetapowych, zminiaturyzowanych i zautomatyzowanych analiz biochemicznych. Stanowi to znaczący postęp w stosunku do metod konwencjonalnych (opierających się na ręcznym pipetowaniu lub robotach) i ma potencjał stać się użytecznym nowym narzędziem w proteomice klinicznej.

Mais J. Jebrail, Vivienne N. Luk oraz Steve C. C. Shih wnieśli równy wkład w tę pracę.

Obecny adres Sergio L. S. Freire to University of the Sciences w Filadelfii, znajdujący się pod adresem 600 South 43rd Street, Philadelphia, PA 19104.

Protokół

Część 1: Wytwarzanie urządzenia

1. Oczyść szklane podłoża w roztworze Piranha (stężony kwas siarkowy: 30% nadtlenek wodoru w stosunku 3:1). Pozostaw podłoża w roztworze Piranha na 10 min, często wstrząsając.
2. Po wypłukaniu w wodzie dejonizowanej (DI) i wysuszeniu podłoży strumieniem gazu N₂, umieść podłoża w komorze wiązki elektronowej w celu naparowania chromu (grubość 250 nm).
3. Aby odwodnić podłoże pokryte chromem, wypłucz je w izopropanolu, a następnie wypal na płycie grzejnej przez 5 min w temperaturze 115°C.
4. Wysusz podłoża i zagruntuj je heksametylodisilazanem (HMDS) metodą spin-coatingu (30 s, 3000 rpm). Ponownie nanieś warstwę metodą spin-coatingu (stosując identyczne parametry) fotorezystem Shipley S1811.
5. Wypal wstępnie podłoże na płycie grzejnej (100°C, 2 min), a następnie naświetl fotorezyst promieniowaniem ultrafioletowym (UV) przez 5 s przez fotomaskę.
6. Wywołaj naświetlone UV podłoża w wywoływaczu Shipley MF 321 przez 3 min i wypłucz w wodzie DI. Wypal końcowo na płycie grzejnej w temperaturze 100°C przez 1 min.
7. Wytraw odsłonięty chrom poprzez zanurzenie w trawieniu do chromu na 30 s. Wypłucz w wodzie DI, a następnie zanurz w stripperze AZ300T na 10 min, aby usunąć pozostały fotorezyst. Wypłucz w wodzie DI i wysusz strumieniem gazu N₂.
8. Nanieś 2-5 μm Parylenu-C (polimeru izolacyjnego) metodą chemicznego osadzania z fazy gazowej (CVD) na podłoże z naniesionym wzorem z chromu. Nanieś 50 nm Teflonu-AF (w celu nadania powierzchni właściwości hydrofobowych) metodą spin-coatingu roztworu (1% masowych w Fluorinert FC-40) przy 2000 rpm przez 60 s. Wypal końcowo na płycie grzejnej (160 °C, 10 min).
9. Aby utworzyć górną płytkę, pokryj nienadrukowane szklane podłoża z tlenku indu i cyny (ITO) warstwą 50 nm Teflonu-AF, jak opisano powyżej.
10. Wypal końcowo oba podłoża na płycie grzejnej (160 °C, 10 min).

Część 2: Konfiguracja i automatyzacja urządzenia

1. W cyfrowych urządzeniach mikroprzepływowych pracujących w konfiguracji „dwupłytkowej”¹ krople są umieszczane pomiędzy podłożem dolnym (z naniesionymi elektrodami) a podłożem górnym (z jedną ciągłą, przezroczystą elektrodą, zazwyczaj wykonaną z ITO).
2. Aby przygotować urządzenie, należy usunąć powłoki polimerowe z pól kontaktowych podłoża dolnego, delikatnie zeskrobując je skalpelem. Połącz odsłonięte pola podłoża dolnego z konektorami 40-pinowymi (Rycina 1a).
3. Włącz komputer z uruchomionym programem LabView (National Instruments, Austin, TX), własnej konstrukcji moduł sterujący (wyposażony w macierz przekaźników wysokiego napięcia sterowanych sygnałami z modułu National Instruments DaqPad), generator funkcji oraz wzmacniacz. Komputer i moduł sterujący umożliwiają użytkownikowi kontrolę nad przyłożeniem do urządzenia sygnałów 100 V_RMS/18 kHz poprzez konektory 40-pinowe.
4. Zmontuj urządzenie, umieszczając dwa kawałki dwustronnej taśmy klejącej (całkowita grubość 140 μm) na krawędziach podłoża dolnego, a następnie przykryj je nie naniesionymi wzorami szkiełkami ITO (płyta górna).
5. W celu inicjalizacji systemu sterowania uruchom program kalibracyjny LabView (stworzony wewnętrznie), aby skalibrować sterowanie sprzężeniem zwrotnym.
6. Wprowadź próbkę i odczynniki do odpowiednich zbiorników (patrz sekcja 3 poniżej) i zamknij je pod podłożem górnym (stroną pokrytą teflonem skierowaną w dół). Podłącz złącze uziemienia do podłoża górnego.
7. Wgraj kod sterujący w LabView (stworzony wewnętrznie) i uruchom program, aby zainicjować manipulację kroplami.

Część 3: Przygotowanie próbek i odczynników

1. Przygotować bufor roboczy (WB): 100 mM TrisHCl (pH 7,8) oraz 0,08% Pluronic F127 w/v.
2. Rozpuścić analizowane białko(a) w buforze WB i nanieść próbkę do zbiornika 1 (R-1) na urządzeniu, zgodnie z rysunkiem 1b.
3. Przygotować czynnik wytrącający: 20% kwas trójchlorooctowy (TCA) w wodzie DI i nanieść go do R-2.
4. Przygotować bufor piorący: chloroform/acetonitryl (ACN) w proporcji 70/30 i nanieść go do R-4.
5. Przygotować bufor do resolubilizacji: 100 mM wodorowęglanu amonu (pH 8,0) oraz 0,08% Pluronic F127 w/v i nanieść go do R-5.
6. Rozpuścić reduktor, tris(2-karboksetylo)fosfinę (TCEP), do stężenia 10 mM w buforze WB i nanieść go do R-6.
7. Rozpuścić czynnik alkilujący, jodoacetamid (IAM), do stężenia 12 mM w buforze WB i nanieść go do R-7.
8. Rozpuścić trypsynę w buforze WB do stężenia równego 1/5 stężenia całkowitego białka w próbce (patrz punkt 3.1 powyżej) i nanieść ją do R-8.

Część 4: Cyfrowe mikrofluidyczne przetwarzanie próbek

1. Następująca procedura jest realizowana automatycznie za pomocą wewnętrznego kodu LabView. Objętość kropli dozowanych z rezerwuarów jest określona przez wymiary elektrod (w tym przypadku dozowane krople mają objętość ~600nL).
2. Należy dozować kroplę próbki zawierającej białko z R-1 oraz kroplę czynnika wytrącającego z R-2 (Rysunek 2, Klatka 1). Należy połączyć obie krople i inkubować połączoną kroplę przez 5 min, co doprowadzi do wytrącenia białek na powierzchni (Rysunek 2, Klatki 2-3). Następnie należy przemieścić nadnadkład do rezerwuaru na odpady, R-3 (Rysunek 2, Klatka 4).
3. Należy dozować trzy krople buforu piorącego z R-4 i przesuwać je przez miejsce wytrąconego białka do rezerwuaru na odpady, R-3 (Rysunek 2, Klatka 5).
4. Należy pozwolić osadowi wyschnąć, a następnie dozować kroplę buforu do ponownego rozpuszczania z R-5 na białko. Należy inkubować bufor przez 20 min, aż osad zostanie rozpuszczony (Rysunek 2, Klatka 6).
5. Należy dozować kroplę reduktora z R-6 i połączyć ją z kroplą próbki. Połączoną kroplę należy wymieszać, przesuwając ją po 6 elektrodach po okręgu. Kroplę należy inkubować przez 1 h w temperaturze pokojowej w komorze z nawilżeniem (Rysunek 3, Klatki 1-2).
6. Należy dozować kroplę czynnika alkilującego z R-7 i połączyć ją z kroplą próbki, a następnie wymieszać (podobnie jak w pkt 4.5). Kroplę należy inkubować przez 15 min w temperaturze pokojowej w komorze z nawilżeniem, chroniąc ją przed światłem (Rysunek 3, Klatki 2-3).
7. Należy dozować kroplę trypsyny z R-8 i połączyć ją z kroplą próbki, a następnie wymieszać (podobnie jak w pkt 4.5). Kroplę należy inkubować przez 3 h w temperaturze 37°C w komorze z nawilżeniem na płycie grzewczej (Rysunek 3, Klatki 3-4).

Część 5: Przygotowanie próbek do obróbki końcowej

1. Usuń górny substrat i przerwij reakcję trawienia, dodając 0,6 mL 2,5% kwasu trifluorooctowego w wodzie.
2. Oczyść produkt przerwanej reakcji, używając ZipTips C18 (Millipore, Billerica, MA) zgodnie z instrukcjami producenta.
3. Rozcieńcz oczyszczoną próbkę w wodzie DI do końcowej objętości 100 mL.

Część 6: Spektrometria mas

1. Przeanalizuj przetworzoną próbkę za pomocą układu nano-HPLC sprzężonego z tandemowym spektrometrem mas. Zastosowany tutaj system HPLC firmy Eksigent Technologies jest wyposażony w kolumnę pułapkową (kulki C18 o średnicy 3 mm, 150 μm ID x 2,5 cm) oraz kolumnę do rozdziału w fazie odwróconej (kulki C18 o średnicy 3 μm, 75 μm ID x 15 cm). Wykorzystany spektrometr mas to model LTQ firmy Thermo-Fisher Scientific.
2. Nanieś 2 μL próbki na kolumnę pułapkową z przepływem 5 μL/min w fazie ruchomej składającej się z 5% acetonitrylu w wodzie. Rozdziel próbkę na kolumnie fazy odwróconej przy przepływie 0,5 μL/min, stosując gradient liniowy od 20% acetonitrylu do 80% acetonitrylu w ciągu 25 min. Kontynuuj pompowanie 80% acetonitrylu przez kolejne 10 min.
3. Przeanalizuj pasma eluujące z kolumny za pomocą tandemowej spektrometrii mas. W opisanej tutaj pracy eluent jest wprowadzany do spektrometru mas poprzez emitter nanoelektrospray (20 μm ID zwężający się do 10 μm ID) firmy NewObjective.
4. Zidentyfikuj białka w próbce, korzystając z programu do przeszukiwania baz danych, takiego jak SEQUEST. W niniejszej pracy zastosowano wersję programu SEQUEST zintegrowaną z Bioworks v3.01 (Thermo-Fisher Scientific); zidentyfikowane białka posiadały wartości prawdopodobieństwa poniżej 1.0E-03 (odpowiadające przedziałowi ufności 99,9%) oraz pokrycie sekwencji na poziomie co najmniej 30% (Rysunek 4).

Rysunek 1. (a) Zdjęcie urządzenia DMF połączonego z 40-pinowymi złączami do zautomatyzowanego sterowania kroplami. (b) Schemat urządzenia przedstawiający rozmieszczenie próbki i odczynników wymaganych do analizy proteomicznej.

Rysunek 2. Klatki z filmu przedstawiające zautomatyzowaną ekstrakcję i oczyszczanie BSA w 20% TCA (czynnik wytrącający) oraz 70/30% chloroformie/acetonitrylu (roztwór płuczący). Na klatce 6 wytrącone białko zostaje ponownie rozpuszczone w kropli 100 mM wodorowęglanu amonu.

Rysunek 3. Klatki z filmu ilustrujące sekwencyjną redukcję, alkilowanie i trawienie kropli resolubilizowanego białka. Na tym rysunku odczynniki są zabarwione barwnikami dla przejrzystości; w praktyce odczynniki nie są zabarwione.

Rysunek 4. Chromatogram MS próbki albuminy surowicy bydlęcej przetworzonej za pomocą cyfrowej mikrofluidyki. Zidentyfikowano 25 odrębnych peptydów (przedział ufności 99,9%), co odpowiada 44% pokrycia sekwencji.

Dyskusja

Brak standaryzacji w zakresie przygotowania i przetwarzania próbek w proteomice stanowi istotne ograniczenie dla tej dziedziny. Ponadto konwencjonalna obsługa próbek w skali makro wiąże się z użyciem wielu naczyń i wielokrotnym przenoszeniem roztworów, co może prowadzić do utraty próbki oraz zanieczyszczeń. Potencjalnym rozwiązaniem tych problemów jest tworzenie zintegrowanych systemów przetwarzania próbek opartych na cyfrowej mikrofluidyce¹ (DMF). W poprzednich badaniach wykazano, że DMF jest użyteczna w efek...