Cyfrowa mikrofluidyka do zautomatyzowanego przetwarzania proteomicznego

Summary

Cyfrowa mikrofluidyka to technika charakteryzująca się manipulacją dyskretnymi kropelkami (~nL - mL) na układzie elektrod poprzez zastosowanie pól elektrycznych. Doskonale nadaje się do przeprowadzania szybkich, sekwencyjnych, zminiaturyzowanych zautomatyzowanych testów biochemicznych. W tym miejscu przedstawiamy platformę zdolną do automatyzacji kilku etapów przetwarzania proteomicznego.

Abstract

Proteomika kliniczna stała się ważną nową dyscypliną, obiecując odkrycie biomarkerów, które będą przydatne do wczesnej diagnozy i prognozowania choroby. Chociaż kliniczne metody proteomiczne różnią się znacznie, wspólną cechą jest potrzeba (i) ekstrakcji białek z niezwykle niejednorodnych płynów (tj. surowicy, krwi pełnej itp.) oraz (ii) intensywnego przetwarzania biochemicznego przed analizą. W tym miejscu przedstawiamy nową metodę opartą na mikrofluidyce cyfrowej (DMF), integrującą kilka etapów przetwarzania stosowanych w proteomice klinicznej. Obejmuje to ekstrakcję białek, rozpuszczanie, redukcję, alkilowanie i trawienie enzymatyczne. Mikrofluidyka cyfrowa to technika obsługi płynów w mikroskali, w której kropelki o rozmiarach nanolitrów i mikrolitrów są manipulowane na otwartej powierzchni. Kropelki są umieszczane na szczycie układu elektrod, które są pokryte warstwą dielektryczną - gdy do kropli przyłożony jest potencjał elektryczny, ładunki gromadzą się po obu stronach dielektryka. Ładunki służą jako uchwyty elektrostatyczne, które mogą być używane do kontrolowania pozycji kropel, a poprzez polaryzację sekwencji elektrod szeregowo, kropelki mogą być dozowane, przesuwane, łączone, mieszane i rozdzielane na powierzchni. Dlatego DMF w naturalny sposób nadaje się do przeprowadzania szybkich, sekwencyjnych, wieloetapowych, zminiaturyzowanych zautomatyzowanych testów biochemicznych. Stanowi to znaczący postęp w stosunku do metod konwencjonalnych (opartych na ręcznym pipetowaniu lub robotach) i ma potencjał, aby stać się użytecznym nowym narzędziem w proteomice klinicznej.

Mais J. Jebrail, Vivienne N. Luk i Steve C. C. Shih w równym stopniu przyczynili się do powstania tej pracy.

Obecny adres Sergio L. S. Freire znajduje się na Uniwersytecie Nauk w Filadelfii pod adresem 600 South 43rd Street, Filadelfia, PA 19104.

Protocol

Część 1: Produkcja urządzeń

1. Czyste szklane podłoża w roztworze piranii (kwas siarkowy 3:1: 30% nadtlenek wodoru). Pozostaw podłoża w roztworze Piranha na 10 minut z częstym mieszaniem.
2. Po wypłukaniu w wodzie dejonizowanej (DI) i wysuszeniu podłoży gazem_N2, należy umieścić podłoża w komorze wiązki elektronów do osadzania chromu (grubość 250 nm).
3. Aby odwodnić podłoże pokryte chromem, należy opłukać w izopropanolu, a następnie piec na gorącej płycie przez 5 minut w temperaturze 115°C.
4. Wysuszyć podłoża i zagruntować heksametylodilazanem (HMDS) przez wirowanie (30 s, 3000 obr./min). Ponownie pokryć (przy identycznych parametrach) fotorezystem Shipley S1811.
5. Wstępnie upiecz podłoże na płycie grzejnej (100°C, 2 min), a następnie ułóż fotorezystor poprzez naświetlanie promieniowaniem ultrafioletowym (UV) przez 5 sekund przez fotomaskę.
6. Podłoża naświetlone promieniami UV rozwiń w wywoływaczu Shipley MF 321 przez 3 minuty i umyj w wodzie DI. Po upieczeniu na płycie grzejnej w temperaturze 100°C przez 1 minutę.
7. Wytrawić odsłonięty chrom, zanurzając go w wytrawiaczu chromowym na 30 s. Spłucz w wodzie DI, a następnie zanurz w stripperze AZ300T na 10 minut, aby usunąć pozostały fotorezyst. Spłukać w wodzie DI i osuszyć gazem_N2.
8. Osadzać 2-5 μm Parylene-C (polimer izolacyjny) przez chemiczne osadzanie z fazy gazowej na podłożu zawierającym wzorzysty chrom. Osadzać 50 nm teflonu-AF (w celu nadania powierzchni hydrofobowości) poprzez wirowanie roztworu (1% wag./wag. w fluoroobojętnym FC-40) przy 2000 obr./min przez 60 s. Po upieczeniu na płycie grzejnej (160 °C, 10 min).
9. Aby uformować górną płytę, pokryj niewzorzyste podłoża szklane z tlenku indu i cyny (ITO) 50 nm Teflon-AF, jak powyżej.
10. Upiecz oba podłoża na płycie grzejnej (160 °C, 10 min).

Część 2: Konfiguracja i automatyzacja urządzeń

1. W cyfrowych urządzeniach mikroprzepływowych działających w konfiguracji "dwupłytkowej^"1 kropelki są umieszczane między dolnym podłożem (z elektrodami wzorzystymi) a górnym podłożem (z jedną ciągłą, przezroczystą elektrodą, zwykle utworzoną z ITO).
2. Aby ustawić urządzenie, usuń powłoki polimerowe z podkładek stykowych dolnego podłoża poprzez delikatne skrobanie skalpelem. Połącz odsłonięte pady dolnego podłoża za pomocą 40-pinowych złączy (Rysunek 1a).
3. Włącz komputer z uruchomionym oprogramowaniem LabView (National Instruments, Austin, TX), domową skrzynkę kontrolną (zawierającą szereg przekaźników wysokiego napięcia, które są sterowane sygnałami z National Instruments DaqPad), generator funkcyjny i wzmacniacz. Komputer/skrzynka sterownicza ułatwia użytkownikowi kontrolę nad podawaniem sygnałów 100 V_RMS/18 kHz do urządzenia za pomocą 40-pinowych złączy.
4. Zmontuj urządzenie, umieszczając dwa kawałki taśmy dwustronnej (całkowita grubość 140 μm) na krawędziach dolnego podłoża i uzupełnij szkiełkami ITO bez wzoru (płyta górna).
5. Aby zainicjować system sterowania, uruchom program kalibracyjny LabView (napisany we własnym zakresie) w celu skalibrowania sterowania ze sprzężeniem zwrotnym.
6. Załaduj próbkę i odczynniki do odpowiednich zbiorników (patrz sekcja 3 poniżej) i umieść je pod górnym podłożem (stroną pokrytą teflonem skierowaną w dół). Przymocuj złącze uziemiające do górnego podłoża.
7. Załaduj kod aktywacji do LabView (napisany wewnętrznie) i uruchom program, aby zainicjować uruchamianie kropli.

Część 3: Przygotowanie próbki i odczynnika

1. Przygotować bufor roboczy (WB): 100 mM TrisHCl (pH 7,8) i 0,08% Pluronic F127 w/v.
2. Rozpuścić białko(-a) do analizy w WB i odpipetować próbkę do zbiornika 1 (R-1) na urządzeniu, jak pokazano na rysunku 1b.
3. Przygotować środek strącający, 20% kwas trichlorooctowy (TCA) w wodzie DI i pipetować do R-2.
4. Przygotować bufor do płukania, 70/30 chloroformu/acetonitrylu (ACN) i odpipetować do R-4.
5. Przygotować bufor rozpuszczający, 100 mM wodorowęglanu amonu (pH 8,0) i 0,08% Pluronic F127 w/v i odpipetować do R-5.
6. Rozpuścić reduktor, tris(2-karboksyetylo)fosfinę (TCEP), w temperaturze 10 mM w WB i pipetą do R-6.
7. Rozpuścić środek alkilowy, jodoacetamid (IAM), w temperaturze 12 mM w WB i pipetą do R-7.
8. Rozpuścić trypsynę w WB w stężeniu równym 1/5 stężenia całkowitej próbki białka (patrz ppkt 3.1 powyżej) i pipetować do R-8.

Część 4: Cyfrowe przetwarzanie próbek mikroprzepływowych

1. Poniższa procedura jest realizowana automatycznie za pomocą napisanego przez nas kodu LabView. Objętość kropel dozowanych ze zbiorników jest określona przez wymiary elektrod (w tym przypadku dozowane kropelki to ~600nL).
2. Dozować kroplę próbki zawierającej białko z R-1 i kroplę osadu z R-2 (Rysunek 2, Ramka 1). Połącz dwie kropelki i pozwól połączonej kropli inkubować przez 5 minut, co spowoduje wytrącenie się białek na powierzchnię (ryc. 2, ramki 2-3). Uruchomić supernatant z dala od wytrąconego białka do zbiornika odpadów, R-3 (Rysunek 2, Ramka 4).
3. Dozować trzy kropelki buforu płuczącego z R-4 i przekierować je przez wytrącone białko do zbiornika na odpady, R-3 (Rysunek 2, Ramka 5).
4. Pozostawić osad do wyschnięcia i dozować kroplę rozpuszczalnego buforu z R-5 do białka. Pozostawić bufor do inkubacji przez 20 minut, aż osad się rozpuści (Rysunek 2, Ramka 6).
5. Dozować kroplę reduktora z R-6 i połączyć ją z kroplą próbki. Wymieszaj połączoną kroplę, przesuwając ją przez 6 elektrod w okrągły wzór. Pozostawić kroplę do inkubacji przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej w wilgotnej komorze (Rysunek 3, Ramki 1-2).
6. Dozować kroplę środka alkilującego z R-7 i połączyć ją z kroplą próbki, a następnie wymieszać (jak w ppkt 4.5). Pozostawić kroplę do inkubacji przez 15 minut w temperaturze pokojowej w wilgotnej komorze, chronionej przed światłem (Rysunek 3, ramki 2-3).
7. Dozować kroplę trypsyny z R-8 i połączyć ją z kroplą próbki, a następnie wymieszać (jak w ppkt 4.5). Pozostawić kroplę do inkubacji przez 3 godziny w temperaturze 37°C w wilgotnej komorze na gorącej płycie (Rysunek 3, Ramki 3-4).

Część 5: Przygotowanie próbki po przetworzeniu

1. Usunąć górny substrat i wygasić reakcję trawienia, dodając 0,6 ml 2,5% kwasu trifluorooctowego do wody.
2. Oczyść wygaszony produkt reakcji za pomocą końcówek C18 ZipTips (Millipore, Billerica, MA) zgodnie z instrukcjami producenta.
3. Rozcieńczyć oczyszczoną próbkę w wodzie demineralizowanej do końcowej objętości 100 ml.

Część 6: Spektrometria mas

1. Ocenić przetworzoną próbkę za pomocą nano-HPLC połączonej z tandemowym spektrometrem masowym. Zastosowany tutaj system HPLC pochodzi od Eksigent Technologies i jest wyposażony w kolumnę pułapkową (kulki C18 o średnicy 3 mm, średnica wewnętrzna 150 μm x 2,5 cm) oraz kolumnę separacji faz odwróconych (kulki C18 o średnicy 3 μm, średnica 75 μm x 15 cm). Zastosowany tutaj spektrometr masowy to LTQ firmy Thermo-Fisher Scientific.
2. Załadować próbkę o objętości 2 μl do kolumny pułapki z prędkością 5 μl/min w fazie ruchomej zawierającej 5% acetonitrylu w wodzie. Oddzielić próbkę na kolumnie z odwróconymi fazami w tempie 0,5 μl/min, stosując gradient liniowy od 20% acetonitrylu do 80% acetonitrylu przez 25 minut. Kontynuuj bieg z 80% acetonitrylem przez kolejne 10 minut.
3. Przeanalizować pasma eluujące z kolumny za pomocą tandemowej spektrometrii mas. W opisanej tutaj pracy eluent jest próbkowany do spektrometru mas za pomocą emitera nanoelektronsprayu (20 μm ID zwężającego się do 10 μm ID) firmy NewObjective.
4. Zidentyfikuj białka w próbce za pomocą programu do przeszukiwania bazy danych, takiego jak SEQUEST. W tej pracy użyliśmy wersji SEQUEST włączonej do Bioworks v3.01 (Thermo-Fisher Scientific), a zidentyfikowane białka miały wyniki prawdopodobieństwa mniejsze niż 1,0E-03 (co odpowiada 99,9% przedziału ufności) i pokrycie sekwencji co najmniej 30% (Figura 4).

Rysunek 1. (a) Zdjęcie urządzenia DMF połączonego z 40-pinowymi złączami w celu automatycznego uruchamiania kropel. b) Schemat urządzenia przedstawiający rozmieszczenie próbki i odczynników wymaganych do badania proteomicznego.

Rysunek 2. Kadry z filmu przedstawiającego automatyczną ekstrakcję i oczyszczanie BSA w 20% TCA (środek strącający) i 70/30% chloroformu/acetonitrylu (roztwór do płukania). W ramce 6 wytrącone białko rozpuszcza się ponownie w kropli 100 mM wodorowęglanu amonu.

Rysunek 3. Kadry z filmu ilustrującego sekwencyjną redukcję, alkilowanie i trawienie kropli rozpuszczalnego białka. Na tym rysunku odczynniki są barwione barwnikami dla przejrzystości; W praktyce odczynniki nie są barwione.

Rysunek 4. Chromatogram MS próbki albuminy surowicy bydlęcej przetworzonej za pomocą mikrofluidyki cyfrowej. Zidentyfikowano 25 różnych peptydów (przedział ufności 99,9%), co odpowiada pokryciu sekwencji na poziomie 44%.

Discussion

Brak ustandaryzowanej obsługi i przetwarzania próbek w proteomice jest głównym ograniczeniem w tej dziedzinie. Ponadto konwencjonalna obsługa próbek w makroskali obejmuje wiele pojemników i transferów roztworów, co może prowadzić do utraty i zanieczyszczenia próbki. Potencjalnym rozwiązaniem tych problemów jest tworzenie zintegrowanych systemów do przetwarzania próbek opartych na cyfrowej mikrofluidyce¹ (DMF). W poprzednich pracach wykazano, że DMF jest przydatny do skutecznego usuwania niepożądanych zanieczys...