Cyfrowa mikroprzepływowość w zautomatyzowanym przetwarzaniu proteomicznym

Podsumowanie

Cyfrowa mikroprzepływność to technika polegająca na manipulowaniu pojedynczymi kroplami (~nL - mL) na macierzy elektrod poprzez przykładanie pól elektrycznych. Jest ona odpowiednia do przeprowadzania szybkich, sekwencyjnych, zminiaturyzowanych zautomatyzowanych analiz biochemicznych. W niniejszej pracy przedstawiamy platformę zdolną do automatyzacji kilku etapów przetwarzania proteomicznego.

Streszczenie

Proteomika kliniczna wyłoniła się jako ważna nowa dyscyplina, obiecująca odkrycie biomarkerów, które będą przydatne w wczesnej diagnostyce i prognozowaniu chorób. Choć metody proteomiczne stosowane w klinice są bardzo zróżnicowane, wspólną cechą jest potrzeba (i) ekstrakcji białek z niezwykle heterogenicznych płynów (np. surowicy, krwi pełnej itp.) oraz (ii) rozległego przetwarzania biochemicznego przed analizą. W niniejszej pracy przedstawiamy nową metodę opartą na cyfrowej mikrofluidyce (DMF), integrującą kilka etapów przetwarzania stosowanych w proteomice klinicznej. Obejmuje ona ekstrakcję białek, resolubilizację, redukcję, alkilację oraz trawienie enzymatyczne. Cyfrowa mikrofluidyka to technika manipulacji płynami w skali mikro, w której kropelki o rozmiarach nanolitrowych i mikrolitrowych są manipulowane na otwartej powierzchni. Kropelki są rozmieszczone nad macierzą elektrod pokrytych warstwą dielektryczną – po przyłożeniu potencjału elektrycznego do kropelki, ładunki gromadzą się po obu stronach dielektryka. Ładunki te służą jako uchwyty elektrostatyczne, które mogą być wykorzystane do kontrolowania pozycji kropelki, a poprzez polaryzację sekwencji elektrod szeregowo, kropelki mogą być dozowane, przemieszczane, łączone, mieszane i dzielone na powierzchni. W związku z tym DMF jest naturalnym rozwiązaniem do przeprowadzania szybkich, sekwencyjnych, wieloetapowych, zminiaturyzowanych zautomatyzowanych analiz biochemicznych. Stanowi to znaczący postęp w stosunku do konwencjonalnych metod (opierających się na manualnym pipetowaniu lub robotach) i ma potencjał, by stać się przydatnym nowym narzędziem w proteomice klinicznej.

Mais J. Jebrail, Vivienne N. Luk i Steve C. C. Shih wnieśli równy wkład w tę pracę.

Obecny adres Sergio L. S. Freire to University of the Sciences w Filadelfii, mieszczący się pod adresem 600 South 43rd Street, Philadelphia, PA 19104.

Protokół

Część 1: Wytwarzanie urządzenia

1. Oczyścić szklane podłoża w roztworze Piranha (3:1 stężony kwas siarkowy:30% nadtlenek wodoru). Pozostawić podłoża w roztworze Piranha na 10 min, często wstrząsając.
2. Po opłukaniu w wodzie dejonizowanej (DI) i osuszeniu podłoży gazem N₂, umieścić podłoża w komorze wiązki elektronowej w celu osadzenia chromu (grubość 250 nm).
3. Aby odwodnić podłoże pokryte chromem, opłukać je izopropanolem, a następnie wypiec na płycie grzejnej przez 5 min w temperaturze 115°C.
4. Osuszyć podłoża i zagruntować heksametylodisylazanem (HMDS) metodą spin-coatingu (30 s, 3000 rpm). Ponownie nanieść metodą spin-coatingu (stosując te same parametry) fotorezyst Shipley S1811.
5. Wstępnie wypiec podłoże na płycie grzejnej (100°C, 2 min), a następnie nałożyć wzór na fotoreziście poprzez naświetlanie promieniowaniem ultrafioletowym (UV) przez 5 s przez fotomaskę.
6. Wywołać naświetlone promieniami UV podłoża w wywoływaczu Shipley MF 321 przez 3 min i przemyć wodą DI. Wypiec po wywoływaniu na płycie grzejnej w temperaturze 100°C przez 1 min.
7. Ztrawić odsłonięty chrom poprzez zanurzenie w trawieniu do chromu na 30 s. Opłukać w wodzie DI, a następnie zanurzyć w stripperze AZ300T na 10 min w celu usunięcia pozostałego fotorezistu. Opłukać w wodzie DI i osuszyć gazem N₂.
8. Osadzić 2-5 μm Parylenu-C (polimeru izolacyjnego) metodą chemicznego osadzania z fazy gazowej na podłożu z naniesionym wzorem z chromu. Osadzić 50 nm Teflon-AF (aby powierzchnia stała się hydrofobowa) poprzez spin-coating roztworu (1% wt/wt w Fluorinert FC-40) przy 2000 rpm przez 60 s. Wypiec po procesie na płycie grzejnej (160 °C, 10 min).
9. Aby utworzyć górną płytkę, pokryć niepodzielone podłoża szklane z tlenkiem indu i cyny (ITO) warstwą 50 nm Teflon-AF, analogicznie jak powyżej.
10. Wypiec oba podłoża po procesie na płycie grzejnej (160 °C, 10 min).

Część 2: Konfiguracja urządzenia i automatyzacja

1. W cyfrowych urządzeniach mikroprzepływowych pracujących w konfiguracji „dwupłytkowej”,¹ krople są umieszczone pomiędzy podłożem dolnym (z naniesionymi elektrodami) a podłożem górnym (z jedną ciągłą, przezroczystą elektrodą, zazwyczaj wykonaną z ITO).
2. Aby przygotować urządzenie, należy usunąć powłoki polimerowe z pól kontaktowych podłoża dolnego, delikatnie zdrapując je skalpelem. Połącz odsłonięte pola podłoża dolnego z 40-pinowymi złączami (Rysunek 1a).
3. Włącz komputer z zainstalowanym programem LabView (National Instruments, Austin, TX), własnoręcznie zbudowaną skrzynkę sterującą (zawierającą macierz przekaźników wysokiego napięcia sterowanych sygnałami z modułu National Instruments DaqPad), generator funkcji oraz wzmacniacz. Komputer i skrzynka sterująca umożliwiają użytkownikowi sterowanie przyłożeniem sygnałów 100 V_RMS/18 kHz do urządzenia za pośrednictwem 40-pinowych złączy.
4. Zmontuj urządzenie, umieszczając dwa kawałki dwustronnej taśmy klejącej (całkowita grubość 140 μm) na krawędziach podłoża dolnego, a następnie dołącz niestrukturyzowane płytki ITO (płyta górna).
5. Aby zainicjować system sterowania, uruchom program kalibracyjny LabView (opracowany wewnętrznie) w celu skalibrowania sterowania sprzężeniem zwrotnym.
6. Wprowadź próbkę i odczynniki do odpowiednich zbiorników (patrz sekcja 3 poniżej) i zamknij je pod podłożem górnym (stroną pokrytą Teflonem do dołu). Podłącz złącze uziemiające do podłoża górnego.
7. Wgraj kod sterujący w programie LabView (opracowany wewnętrznie) i uruchom program, aby zainicjować manipulację kroplami.

Część 3: Przygotowanie próbek i odczynników

1. Przygotować bufor roboczy (WB): 100 mM TrisHCl (pH 7.8) oraz 0,08% Pluronic F127 w/v.
2. Rozpuścić analizowane białka w buforze WB i pipetować próbkę do zbiornika 1 (R-1) na urządzeniu, zgodnie z rysunkiem 1b.
3. Przygotować czynnik wytrącający: 20% kwas trójchlorooctowy (TCA) w wodzie dejonizowanej (DI) i pipetować do R-2.
4. Przygotować bufor płuczący: chloroform/acetonitryl (ACN) w stosunku 70/30 i pipetować do R-4.
5. Przygotować bufor do resolubilizacji: 100 mM wodorowęglan amonu (pH 8.0) oraz 0,08% Pluronic F127 w/v i pipetować do R-5.
6. Rozpuścić reduktor, tris(2-karboksyetylo)fosfinę (TCEP), w stężeniu 10 mM w buforze WB i pipetować do R-6.
7. Rozpuścić czynnik alkilujący, jod acetamid (IAM), w stężeniu 12 mM w buforze WB i pipetować do R-7.
8. Rozpuścić trypsynę w buforze WB w stężeniu równym 1/5 stężenia całkowitej próbki białka (patrz pkt 3.1 powyżej) i pipetować do R-8.

Część 4: Cyfrowe mikrofluidyczne przetwarzanie próbek

1. Poniższa procedura jest realizowana automatycznie za pomocą wewnętrznego kodu LabView. Objętość kropel dozowanych z rezerwuarów jest określona przez wymiary elektrod (w tym przypadku dozowane krople mają objętość ~600nL).
2. Dozować kroplę próbki zawierającej białko z R-1 oraz kroplę czynnika wytrącającego z R-2 (Rysunek 2, Klatka 1). Połączyć obie krople i inkubować połączoną kroplę przez 5 min, co doprowadzi do wytrącenia białek na powierzchni (Rysunek 2, Klatki 2-3). Przesunąć nadfiltr z wytrąconego białka do rezerwuaru na odpady R-3 (Rysunek 2, Klatka 4).
3. Dozować trzy krople buforu piorącego z R-4 i przemieszczać je przez miejsce wytrąconego białka do rezerwuaru na odpady R-3 (Rysunek 2, Klatka 5).
4. Pozostawić osad do wyschnięcia, a następnie dozować kroplę buforu rozpuszczającego z R-5 na białko. Inkubować bufor przez 20 min, aż osad się rozpuści (Rysunek 2, Klatka 6).
5. Dozować kroplę reduktora z R-6 i połączyć ją z kroplą próbki. Wymieszać połączoną kroplę, przemieszczając ją po 6 elektrodach po okręgu. Inkubować kroplę przez 1 h w temperaturze pokojowej w komorze nawilżanej (Rysunek 3, Klatki 1-2).
6. Dozować kroplę czynnika alkilującego z R-7 i połączyć ją z kroplą próbki, a następnie wymieszać (podobnie jak w punkcie 4.5). Inkubować kroplę przez 15 min w temperaturze pokojowej w komorze nawilżanej, chroniąc ją przed światłem (Rysunek 3, Klatki 2-3).
7. Dozować kroplę trypsyny z R-8 i połączyć ją z kroplą próbki, a następnie wymieszać (podobnie jak w punkcie 4.5). Inkubować kroplę przez 3 h w temperaturze 37°C w komorze nawilżanej na płycie grzejnej (Rysunek 3, Klatki 3-4).

Część 5: Przygotowanie próbek do obróbki końcowej

1. Usunąć górny substrat i przerwać reakcję trawienia, dodając 0,6 mL 2,5% kwasu trifluorooctowego w wodzie.
2. Oczyścić produkt przerwanej reakcji, wykorzystując ZipTips C18 (Millipore, Billerica, MA) zgodnie z instrukcjami producenta.
3. Rozcieńczyć oczyszczoną próbkę w wodzie DI do końcowej objętości 100 mL.

Część 6: Spektrometria mas

1. Przeanalizuj przetworzoną próbkę za pomocą nano-HPLC połączonego z tandemowym spektrometrem mas. Zastosowany tutaj system HPLC pochodzi od firmy Eksigent Technologies i jest wyposażony w kolumnę pułapkującą (kule C18 o średnicy 3 mm, 150 μm ID x 2,5 cm) oraz kolumnę separacyjną do chromatografii przeciwprądowej (kule C18 o średnicy 3 μm, 75 μm ID x 15 cm). Wykorzystany spektrometr mas to model LTQ firmy Thermo-Fisher Scientific.
2. Nanieś 2 μL próbki na kolumnę pułapkującą z przepływem 5μL/min w fazie ruchomej składającej się z 5% acetonitrylu w wodzie. Rozdziel próbkę na kolumnie przeciwprądowej z przepływem 0,5μL/min, stosując gradient liniowy od 20% acetonitrylu do 80% acetonitrylu w czasie 25 min. Kontynuuj pomiar przy 80% acetonitrylu przez kolejne 10 min.
3. Przeanalizuj pasma eluowane z kolumny za pomocą tandemowej spektrometrii mas. W opisanym tutaj badaniu eluent jest wprowadzany do spektrometru mas za pomocą emitera nanoelektrospray (20 μm ID zwężającego się do 10 μm ID) firmy NewObjective.
4. Zidentyfikuj białka w próbce, korzystając z programu do przeszukiwania baz danych, takiego jak SEQUEST. W niniejszej pracy zastosowano wersję programu SEQUEST zintegrowaną z Bioworks v3.01 (Thermo-Fisher Scientific); zidentyfikowane białka posiadały wartości prawdopodobieństwa mniejsze niż 1.0E-03 (odpowiadające przedziałowi ufności 99,9%) oraz pokrycie sekwencji na poziomie co najmniej 30% (Rysunek 4).

Rycina 1. (a) Zdjęcie urządzenia DMF połączonego z konektorami 40-pinowymi do zautomatyzowanego sterowania kroplami. (b) Schemat urządzenia przedstawiający rozmieszczenie próbki i odczynników wymaganych do analizy proteomicznej.

Rysunek 2. Kadry z filmu przedstawiające zautomatyzowaną ekstrakcję i oczyszczanie BSA w 20% TCA (czynnik wytrącający) oraz w 70/30% chloroformie/acetonitrylu (roztwór płuczący). Na kadrze 6 wytrącone białko zostaje ponownie rozpuszczone w kropli 100 mM wodorowęglanu amonu.

Rysunek 3. Kadry z filmu ilustrujące sekwencyjną redukcję, alkilowanie i trawienie kropli resolubilizowanego białka. Na tym rysunku odczynniki są zabarwione barwnikami dla przejrzystości; w praktyce odczynniki nie są barwione.

Rysunek 4. Chromatogram MS próbki albuminy surowicy bydlęcej przetworzonej za pomocą cyfrowej mikrofluidyki. Zidentyfikowano 25 odrębnych peptydów (przedział ufności 99,9%), co odpowiada 44% pokrycia sekwencji.

Dyskusja

Brak standaryzacji w zakresie przygotowania i przetwarzania próbek w proteomice stanowi istotne ograniczenie dla tej dziedziny. Ponadto tradycyjne przetwarzanie próbek w skali makro wiąże się z użyciem wielu naczyń i wielokrotnym przenoszeniem roztworów, co może prowadzić do utraty próbki oraz kontaminacji. Potencjalnym rozwiązaniem tych problemów jest tworzenie zintegrowanych systemów do przetwarzania próbek opartych na cyfrowej mikrofluidyce¹ (DMF). W poprzednich pracach wykazano, że DMF jest użytecznym narz...