Oznaczanie stężenia białek w mikroobjętościach za pomocą spektrofotometru NanoDrop 2000c

Podsumowanie

Próbki mikroobjętościowe są oznaczane ilościowo przez system spektrofotometru, który wykorzystuje naturalne napięcie powierzchniowe do zatrzymywania próbek bez użycia kuwet czy kapilarni. Dzięki tej metodzie znacznie zwiększa się dynamiczny zakres stężeń białek i szybkość, z jaką można je zmierzyć.

Streszczenie

Tradycyjna spektrofotometria wymaga umieszczania próbek w kuwetach lub kapilarach. Jest to często niepraktyczne ze względu na ograniczoną objętość próbek, często używanych do analizy białek. Spektrofotometr Thermo Scientific NanoDrop 2000c rozwiązuje ten problem dzięki innowacyjnemu systemowi zatrzymywania próbek, który utrzymuje próbki mikroobjętościowe między dwiema powierzchniami pomiarowymi, wykorzystując właściwości napięcia powierzchniowego cieczy, umożliwiając ilościowe oznaczanie próbek w objętościach już od 0,5 do 2 μl. Eliminacja kuwet lub kapilar umożliwia zmiany długości ścieżki w czasie rzeczywistym, co skraca czas pomiaru, jednocześnie znacznie zwiększając zakres dynamiczny stężeń białek, które można zmierzyć. Wyeliminowano również potrzebę rozcieńczania, a przygotowania do ilościowego oznaczania próbki są stosunkowo łatwe, ponieważ powierzchnie pomiarowe można po prostu przetrzeć chusteczką laboratoryjną. W tym artykule wideo przedstawiono modyfikacje tradycyjnych metod oznaczania stężenia białek w celu ilościowego oznaczania mikroobjętości białka przy użyciu odczytów absorbancji A280 lub testu kolorymetrycznego BCA.

Protokół

I. Spektrofotometr NanoDrop 2000c

Technologia NanoDrop opiera się na innowacyjnym systemie zatrzymywania próbek, który wykorzystuje napięcie powierzchniowe do przechowywania i mierzenia próbek mikroobjętościowych między dwoma optycznymi postumentami bez użycia kuwet czy kapilarni. Spektrofotometr NanoDrop 2000c wykorzystuje tę technologię do szybkiego i łatwego pomiaru kropelek o objętości 0,5-2 μl białek, DNA, RNA i innych biomolekuł. Zdolność ta staje się coraz ważniejsza, ponieważ techniki molekularne stale ewoluują w kierunku wykorzystywania mniejszych ilości materiału do analizy. Spektrofotometr mikroobjętościowy idealny do warunków, w których próbka jest ograniczona. Jednak łatwość obsługi, szybki cykl pomiarowy i szeroki zakres stężeń sprawiają, że spektrofotometr jest również odpowiedni, gdy dostępne są duże ilości próbki. Cykl pomiarowy jest również znacznie skrócony, co pomaga naukowcom zwiększyć wydajność we wszystkich przepływach pracy.

Mikropróbka jest umieszczana bezpośrednio na powierzchni detekcji, a między końcami światłowodów tworzy się kolumna cieczy za pomocą napięcia powierzchniowego. Ta kolumna cieczy tworzy pionową ścieżkę optyczną. Źródłem światła jest ksenonowa lampa błyskowa, a spektrometr wykorzystujący liniowy układ CCD służy do analizy światła przechodzącego przez próbkę.

Usunięcie z systemu tradycyjnych urządzeń zabezpieczających, takich jak kuwety, ma kilka zalet: do pomiaru potrzebne są bardzo małe ilości próbki, czyszczenie wymaga jedynie przetarcia powierzchni optycznych chusteczką laboratoryjną, a długość ścieżki może być zmieniana w czasie rzeczywistym podczas pomiaru.

NanoDrop 2000c automatycznie określa optymalną długość ścieżki (od 1 mm do 0,05 mm), zapewniając najszerszy zakres możliwych pomiarów stężenia białka bez rozcieńczeń. Skracając długość ścieżki, można zmierzyć wyższe stężenia białka. To skutecznie eliminuje potrzebę wykonywania rozcieńczeń dla większości próbek białka. Na przykład NanoDrop 2000c może mierzyć stężenia BSA do 400 mg/ml.

Spektrofotometr NanoDrop 2000c to spektrofotometr o pełnym spektrum do pomiaru absorbancji DNA, RNA, białek i innych biomolekuł. Ten protokół wideo skupi się na pomiarze białek.

II. Oznaczanie stężenia białka w mikroobjętości za pomocą pomiarów absorbancji A280

a. Zasada pomiarów A280

Metoda Białka A280 ma zastosowanie do oczyszczonych białek, które zawierają reszty tryptofanu, tyrozyny, fenyloalaniny lub dwusiarczku cysteiny-cysteiny i wykazują absorbancję przy 280 nm. W metodzie tej wykorzystuje się wartość absorbancji A280 w połączeniu ze współczynnikiem ekstynkcji masowej lub współczynnikiem ekstynkcji molowej w celu obliczenia stężenia oczyszczonego białka. Zaletą bezpośrednich pomiarów A280 jest to, że generowanie krzywej wzorcowej nie jest wymagane do określenia stężenia białka. Jeśli próbka jest niescharakteryzowanym roztworem białkowym, lizatem komórkowym lub surowym ekstraktem białkowym, zaleca się użycie jednej ze wstępnie skonfigurowanych metod kolorymetrycznych dostępnych w NanoDrop 2000/2000c, takich jak testy BCA, Pierce 660 nm, Bradford i Lowry.

b. Pomiary mikroobjętości białka A280 - Uruchomienie

1. Wybierz aplikację Protein A280 z menu głównego.
2. Z listy rozwijanej wybierz typ próbki, która ma zostać zmierzona. Ustawienie domyślne jest zalecane dla większości nieznanych mieszanek białkowych, w których 1 Abs = 1 mg/ml. W przypadku pomiaru wcześniej scharakteryzowanego oczyszczonego białka, można wprowadzić albo współczynnik ekstynkcji masowej, albo molowy współczynnik ekstynkcji i masę cząsteczkową, aby dokładniej określić stężenie białka.
3. Wybierz jednostki stężenia z listy rozwijanej.

c. Pomiary mikroobjętości białka A280 - Blanking

1. Ustanów ślepą próbę za pomocą odpowiedniego bufora. Ważne jest, aby używać buforu, w którym białko jest zawieszone. Zastosowany bufor powinien mieć takie samo pH i podobną siłę jonową jak roztwór próbki. Uwaga: RIPA przyczyniają się do zbyt dużej absorbancji przy 280 nm i dlatego są niezgodne z bezpośrednimi pomiarami białka A280. W przypadku białek zawieszonych w buforze RIPA zaleca się oznaczenie stężenia białka za pomocą testu kolorymetrycznego kompatybilnego z buforem RIPA.
2. Odpipetować 2 μl odpowiedniego roztworu zaślepiającego na dolny cokół, opuścić ramię i kliknąć Blank.
3. Wytrzyj ślepy roztwór z dolnego i górnego cokołu za pomocą suchej chusteczki laboratoryjnej.

d. Pomiary mikroobjętości białka A280 Pomiary

Ważne uwagi: Jednorodność próbki jest niezwykle ważna, ponieważ mierzona jest tak mała objętość. Aby zapewnić jednorodność próbek, należy delikatnie, ale dokładnie wymieszać próbki bezpośrednio przed pobraniem podwielokrotności do pomiaru. Należy unikać wprowadzania pęcherzyków podczas mieszania i pipetowania.

Ze względu na zmienność napięcia powierzchniowego między różnymi białkami, zalecamy załadowanie 2 μL próbek, aby zapewnić prawidłowe tworzenie kolumn. Zawsze używaj końcówek do pipet o niskiej retencji. Aby załadować próbkę, przyłóż końcówkę pipety do dolnej powierzchni podstawy optycznej, jednocześnie usuwając roztwór, aby zapobiec przywieraniu roztworu do zewnętrznej strony końcówki pipety. Wyrzucić mniej niż pełną ilość próbki, aby zapobiec wydmuchiwaniu i wprowadzaniu pęcherzyków do próbki.

1. Wprowadź identyfikator próbki w odpowiednim polu, załaduj 2 μl pierwszej próbki zgodnie z opisem dla ślepej próby i kliknij przycisk Zmierz. Do każdego pomiaru należy użyć świeżej podwielokrotności 2 μl próbki.
2. Usunąć próbkę z dolnego i górnego cokołu za pomocą suchej chusteczki laboratoryjnej.

e. Pomiary mikroobjętości białka A280 Czyszczenie

Zwykła, niestrzępiąca się, laboratoryjna chusteczka często wystarcza do czyszczenia postumentów optycznych między pomiarami.

f. Wykonywanie pomiarów białka A280 Regeneracja

Roztwory i odczynniki zawierające środki powierzchniowo czynne mogą z czasem zdekondycjonować powierzchnie cokołu pomiarowego, zapobiegając tworzeniu się kolumny cieczy próbki. Spłaszczenie kropli na dolnym cokole wskazuje na to, że powierzchnia optyczna staje się nieuwarunkowana. Jeśli właściwości powierzchni zostały naruszone, regeneracja cokołów jest ważna, aby zapewnić uformowanie kolumny próbki. W takim przypadku energicznie wypoleruj powierzchnie optyczne chusteczką laboratoryjną lub użyj środka do regeneracji cokołu NanoDrop (PR-1) zgodnie z zaleceniami.

III. Oznaczanie stężenia białka w mikroobjętości za pomocą testów kolorymetrycznych

a. Zasada detekcji kolorymetrycznej

Spektrofotometr NanoDrop 2000c może być również używany do pomiaru niescharakteryzowanych roztworów białkowych, lizatów komórkowych i surowych ekstraktów białkowych za pomocą testów kolorymetrycznych.

Metody kolorymetryczne to metody pośrednie, które polegają na interakcji barwnika z białkiem próbki w celu wytworzenia nowego kompleksu, który pochłania światło w zakresie widzialnym.

Spektrofotometr NanoDrop 2000c posiada kilka wstępnie skonfigurowanych testów kolorymetrycznych, w tym metody BCA, Pierce'a 660, Bradforda i Lowry'ego. Test BCA zostanie zademonstrowany jako przykładowy test kolorymetryczny przy użyciu spektrofotometru mikroobjętościowego. (zrzut ekranu)

Test BCA (kwas bicinchoninowy) jest powszechną metodą kolorymetryczną, często stosowaną do rozcieńczania roztworów białek i białek w obecności składników o znacznej absorbancji UV (280 nm). W przeciwieństwie do metody Protein A280, metoda Protein BCA wymaga wygenerowania krzywej standardowej przed pomiarem stężeń białek w próbce.

Metoda wykorzystuje kwas bicinchoninowy (BCA) jako odczynnik do wykrywania. Chelat Cu-BCA powstający w obecności białka mierzy się przy 562 nm i normalizuje przy 750 nm.

b. Pomiary mikroobjętościowe BCA Przygotowanie testu BCA

1. Wymagane odczynniki znajdują się w zestawie kompatybilnym ze środkiem redukującym (Thermo Scientific Pierce nr kat. 23250): odczynnik BCA A, odczynnik BCA B, odczynnik zgodności, bufor do rekonstytucji i wzorce albuminy (BSA).
2. Zrównoważ wszystkie nieznane białka i wzorce białek do temperatury pokojowej i dokładnie wymieszaj.
3. Przygotować wystarczającą ilość świeżego odczynnika roboczego dla wzorców i próbek, które mają być mierzone, stosując odczynnik A:B w stosunku 50:1
4. Do testu mikro należy użyć stosunku 1:1 odczynnika roboczego do próbki. Dodać 10 μl odczynnika roboczego do każdej probówki z wystarczającą ilością probówek, aby pokryć wszystkie próbki i wzorce. W przypadku testu wysokiego zakresu należy użyć stosunku odczynnika roboczego do próbki 20:1. Dodaj 190 μl odczynnika roboczego do każdej probówki z wystarczającą ilością probówek, aby pokryć wszystkie próbki i wzorce. Zapoznaj się z literaturą zestawu Pierce BCA, aby określić, jaki stosunek jest odpowiedni dla Twoich próbek.
5. Dodać 10 μl wzorca lub próbki do każdej probówki zawierającej odczynnik. Dobrze wymieszaj, delikatnie wirując.
6. Inkubować probówki w temperaturze 37 °C przez 30 minut.
7. Pozwól, aby reakcje zrównoważyły się do temperatury pokojowej (~10 minut).

c. Pomiary mikroobjętościowe BCA generujące krzywą standardową

1. Wybierz metodę Białko BCA z menu głównego. Jeśli pojawi się okno weryfikacji długości fali, upewnij się, że ramię jest opuszczone.
2. Wprowadź wartości dla każdego standardowego stężenia w tabeli w prawym okienku. Oprogramowanie pozwala na odniesienie i do 7 dodatkowych standardów. Wzorzec i/lub wzorce powinny być mierzone w kontrpróbach.
   Uwaga: Minimalnym wymogiem dla wygenerowania krzywej standardowej jest pomiar dwóch wzorców lub pomiar odniesienia zerowego i co najmniej jednego wzorca. Zaleca się włączenie dodatkowych norm, jeśli jest to konieczne, w celu pokrycia oczekiwanego zakresu stężeń testu.
3. Ustal puste miejsce. Ślepa próba do testów kolorymetrycznych jest na ogół dejonizowana_H2O.
4. Odpipetować 2 μl dH₂O na dolny cokół, opuścić ramię i kliknąć Blank. Tylko jedna ślepa próba jest potrzebna do pokrycia wszystkich kolejnych pomiarów odniesienia i wzorców.
5. Ustalić odniesienie poprzez odpipetowanie 2 μl podwielokrotności zawierającej tylko odczynnik roboczy i bufor bez białka na dolny cokół. Opuść ramię i kliknij przycisk Zmierz.
6. Na karcie Wzorce zaznacz żądany wzorzec i odpipetuj 2 μl żądanego wzorca na dolną podstawę. Opuść ramię i kliknij przycisk Zmierz. Powtórz ten proces dla wszystkich standardów. Pamiętaj, aby zmierzyć wszystkie normy przed pomiarem próbek. Aby wyświetlić krzywą standardową, kliknij przycisk Wyświetl krzywą standardową.

d. Pomiary mikroobjętościowe BCA 2 μL Pomiary białek

1. Po zmierzeniu wszystkich wzorców kliknij przycisk Próbki. Wprowadź identyfikator próbki. Załaduj 2 μl próbki na dolny cokół i kliknij przycisk Zmierz. Do każdego pomiaru należy użyć świeżej podwielokrotności 2 μl próbki.
2. Wytrzyj próbkę z dolnego i górnego cokołu za pomocą suchej chusteczki laboratoryjnej.

e. Mikroobjętość BCA Pomiary Czyszczenie i regeneracja

Wykonaj czyszczenie i regenerację zgodnie z opisem w bezpośrednich pomiarach absorbancji A280.

Reprezentatywne wyniki:

Określenie stężenia białka w mikroobjętości odbywa się za pomocą bezpośredniego pomiaru A280 lub pośredniego testu kolorymetrycznego. Przykład pomiaru A280 określa stężenie białka na podstawie współczynnika ekstynkcji białka będącego przedmiotem zainteresowania. Przykład testu kolorymetrycznego BCA określa stężenie białka na podstawie krzywej standardowej znanych stężeń białek.

Dyskusja

Kwantyfikacja mikroobjętościowa wykorzystuje wewnętrzne właściwości napięcia powierzchniowego próbki w celu utworzenia kolumny cieczy między dwiema powierzchniami pomiarowymi. Brak urządzenia zabezpieczającego pozwala na zmianę długości ścieżki w czasie rzeczywistym, zasadniczo eliminując potrzebę wykonywania rozcieńczeń. Ta zdolność znacznie zwiększa dynamiczny zakres stężeń białek, a także szybkość pomiaru. Dzięki użyciu minimalnych ilości próbek, duża liczba próbek może być analizowana szybko i dokładnie, co pozwala naukowcom na wykonanie większej liczby pomiarów i osiągnięcie lepszej kontroli jakości. Ponadto, w razie potrzeby, po wykonaniu pomiaru można odzyskać cenne próbki. Podczas pomiaru tak małych objętości jednorodność próbki jest niezwykle ważna, aby uniknąć błędów w pobieraniu próbek. Do ładowania próbek należy zawsze używać końcówek do pipet o niskiej retencji, a końcówki należy wymieniać między powtórzeniami próbek. Powierzchnie cokołów muszą być odpowiednio oczyszczone i kondycjonowane, aby zapewnić najdokładniejsze wyniki. Wreszcie, spektrofotometr mikroobjętościowy jest idealny, gdy próbka jest ograniczona, jednak łatwość obsługi, szybkość i szeroki zakres dynamiczny spektrometru sprawiają, że jest odpowiedni, gdy próbki są obfite.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Spektrofotometr NanoDrop 2000c	Thermo Fisher Scientific, Inc.
Chusteczki laboratoryjne
Pierce BCA Zestaw do oznaczania białek	Thermo Fisher Scientific, Inc.	23250	PR-1 kompatybilny ze środkiem redukującym
	Thermo Fisher Scientific, Inc.