Oznaczanie stężenia białek w mikroobjętościach z wykorzystaniem spektrofotometru NanoDrop 2000c

Podsumowanie

Próbki o mikroobjętości są kwantyfikowane za pomocą systemu spektrofotometrycznego, który wykorzystuje naturalne napięcie powierzchniowe do utrzymania próbek bez użycia kuwet lub kapilar. Zakres dynamiczny stężeń białek oraz szybkość ich pomiaru są znacznie zwiększone dzięki zastosowaniu tej metody.

Streszczenie

Tradycyjna spektrofotometria wymaga umieszczania próbek w kuwetach lub kapilarach. Jest to często niepraktyczne ze względu na ograniczone objętości próbek, często stosowane w analizie białek. Spektrofotometr Thermo Scientific NanoDrop 2000c rozwiązuje ten problem dzięki innowacyjnemu systemowi zatrzymywania próbek, który utrzymuje mikroobjętościowe próbki między dwiema powierzchniami pomiarowymi, wykorzystując właściwości napięcia powierzchniowego cieczy, co umożliwia kwantyfikację próbek w objętościach tak niskich jak 0,5-2 μL. Wyeliminowanie kuwet lub kapilar pozwala na zmiany długości drogi optycznej w czasie rzeczywistym, co skraca czas pomiaru, jednocześnie znacznie zwiększając zakres dynamiczny mierzonych stężeń białek. Wyeliminowano również konieczność rozcieńczania, a przygotowanie do kwantyfikacji próbek jest stosunkowo proste, ponieważ powierzchnie pomiarowe można po prostu przetrzeć chusteczką laboratoryjną. Niniejszy artykuł wideo przedstawia modyfikacje tradycyjnych metod oznaczania stężenia białek w celu kwantyfikacji mikroobjętości białek z wykorzystaniem odczytów absorbancji A280 lub kolorymetrycznego testu BCA.

Protokół

I. Spektrofotometr NanoDrop 2000c

Technologia NanoDrop opiera się na innowacyjnym systemie utrzymywania próbki, który wykorzystuje napięcie powierzchniowe do stabilizacji i pomiaru mikroobjętości próbek pomiędzy dwoma podstawkami optycznymi bez użycia kuwet lub kapilar. Spektrofotometr NanoDrop 2000c wykorzystuje tę technologię do szybkiego i łatwego pomiaru kropel o objętości 0,5-2 μL białek, DNA, RNA oraz innych biomolekuł. Możliwość ta staje się coraz bardziej istotna w obliczu ciągłego rozwoju technik molekularnych, które pozwalają na wykorzystanie mniejszych ilości materiału do analizy. Spektrofotometr mikroobjętościowy jest idealny w warunkach, w których ilość próbki jest ograniczona. Jednak łatwość obsługi, szybki cykl pomiarowy oraz szeroki zakres stężeń sprawiają, że urządzenie to jest odpowiednie również w sytuacjach, gdy dysponujemy dużą ilością próbki. Cykl pomiarowy został również znacznie skrócony, co pomaga naukowcom zwiększyć efektywność ich pracy.

Mikropróbka jest umieszczana bezpośrednio na powierzchni detekcyjnej, a dzięki napięciu powierzchniowemu między końcami światłowodów tworzy się kolumna cieczy. Kolumna ta tworzy pionową drogę optyczną. Źródłem światła jest ksenonowa lampa błyskowa, a do analizy światła przechodzącego przez próbkę wykorzystuje się spektrometr z liniową matrycą CCD.

Usunięcie z systemu tradycyjnych urządzeń pomiarowych, takich jak kuwety, niesie ze sobą szereg zalet: do pomiaru potrzebne są bardzo małe ilości próbki, czyszczenie polega jedynie na przetarciu powierzchni optycznych chusteczką laboratoryjną, a długość drogi optycznej może być zmieniana w czasie rzeczywistym podczas pomiaru.

NanoDrop 2000c automatycznie wyznacza optymalną długość drogi optycznej (od 1 mm do 0,05 mm), co zapewnia najszerszy możliwy zakres pomiarów stężeń białek bez konieczności ich rozcieńczania. Skrócenie drogi optycznej umożliwia pomiar wyższych stężeń białka. Dzięki temu w przypadku większości próbek białkowych można uniknąć wykonywania rozcieńczeń. Na przykład NanoDrop 2000c pozwala na pomiar stężeń BSA sięgających 400 mg/mL.

Spektrofotometr NanoDrop 2000c jest spektrofotometrem pełnego spektrum służącym do pomiaru absorbancji DNA, RNA, białek oraz innych biomolekuł. Niniejszy protokół wideo koncentruje się na pomiarze białek.

II. Oznaczanie stężenia białka w mikroobjętościach za pomocą pomiarów absorbancji przy A280

a. Zasada pomiarów A280

Metoda Protein A280 jest stosowana do oczyszczonych białek zawierających reszty tryptofanu, tyrozyny, fenyloalaniny lub mostki dwusiarczkowe cysteiny-cysteiny i wykazujących absorbancję przy 280 nm. Metoda ta wykorzystuje wartość absorbancji A280 w połączeniu z masowym współczynnikiem wymarcia lub molowym współczynnikiem wymarcia do obliczenia stężenia oczyszczonego białka. Zaletą bezpośrednich pomiarów A280 jest brak konieczności tworzenia krzywej wzorcowej w celu oznaczenia stężenia białka. W przypadku, gdy próbka stanowi niecharakteryzowany roztwór białka, lizat komórkowy lub surowy ekstrakt białkowy, zaleca się zastosowanie jednej z prekonfigurowanych metod kolorymetrycznych dostępnych w urządzeniu NanoDrop 2000/2000c, takich jak testy BCA, Pierce 660 nm, Bradforda oraz Lowry'ego.

b. Pomiary białek w mikroobjętości A280 – uruchamianie

1. Wybierz aplikację Protein A280 z menu głównego.
2. Z listy rozwijanej wybierz typ próbki do pomiaru. Dla większości nieznanych mieszanin białek zaleca się ustawienie domyślne, w którym 1 Abs = 1 mg/mL. W przypadku pomiaru wcześniej scharakteryzowanego białka oczyszczonego można wprowadzić współczynnik ekstynkcji masowej lub molarny współczynnik ekstynkcji oraz masę cząsteczkową, aby dokładniej określić stężenie białka.
3. Wybierz jednostki stężenia z listy rozwijanej.

c. Pomiary mikroobjętościowe białka A280 - zerowanie

1. Przygotuj próbę ślepą, używając odpowiedniego buforu. Ważne jest, aby zastosować bufor, w którym zawieszone jest białko. Użyty bufor powinien mieć to samo pH i zbliżoną siłę jonową co roztwór próbki. Uwaga: bufory RIPA wykazują zbyt wysoką absorbancję przy 280 nm, przez co nie nadają się do bezpośrednich pomiarów białka metodą A280. W przypadku białek zawieszonych w buforze RIPA zaleca się oznaczenie stężenia białka przy użyciu kolorymetrycznego testu kompatybilnego z buforem RIPA.
2. Nanieś pipetą 2 μL odpowiedniego roztworu ślepego na dolny piedestał, opuść ramię i kliknij Blank.
3. Wytrzyj roztwór ślepy z dolnego i górnego piedestału za pomocą suchej chusteczki laboratoryjnej.

d. Mikrowolumetryczne pomiary białka A280 Pomiar

Ważne uwagi: Homogeniczność próbki jest niezwykle istotna, ponieważ mierzone są bardzo małe objętości. Aby zapewnić homogeniczność próbek, należy je delikatnie, lecz dokładnie wymieszać bezpośrednio przed pobraniem aliquoty do pomiaru. Należy unikać wprowadzania pęcherzyków powietrza podczas mieszania i pipetowania.

Ze względu na zmienność napięcia powierzchniowego różnych białek, zalecamy nakładanie 2 μL próbek, aby zapewnić prawidłowe utworzenie kolumny. Zawsze należy używać końcówek do pipet o niskiej retencji. Aby nałożyć próbkę, należy dotknąć końcówką pipety dolnej powierzchni postumentu optycznego podczas wydmuchiwania roztworu, co zapobiegnie przywieraniu cieczy do zewnętrznej strony końcówki. Należy wydmuchać nieco mniej niż pełną objętość próbki, aby zapobiec gwałtownemu wyrzutowi i wprowadzeniu pęcherzyków powietrza do próbki.

1. Wpisz identyfikator próbki w odpowiednim polu, nanieś 2 μL pierwszej próbki zgodnie z opisem dla próbki ślepej i kliknij Measure. Do każdego pomiaru należy użyć nowej alykwooty 2 μL próbki.
2. Usuń próbkę z dolnego i górnego wspornika za pomocą suchej chusteczki laboratoryjnej.

e. Pomiary mikroobjętościowe białka A280 – Czyszczenie

Do czyszczenia podstaw optycznych pomiędzy pomiarami zazwyczaj wystarcza zwykła, beztuszowa chusteczka laboratoryjna.

f. Wykonywanie pomiarów absorbancji białka przy 280 nm – Rekondycjonowanie

Roztwory i odczynniki zawierające surfaktanty mogą z czasem zmieniać właściwości powierzchni podstawki pomiarowej, co uniemożliwia uformowanie się kolumny cieczy z próbki. Spływanie kropli na dolnej podstawce świadczy o utracie właściwości powierzchni optycznej. Jeśli właściwości powierzchni zostały naruszone, konieczne jest ponowne przygotowanie podstawki, aby zapewnić utworzenie się kolumny próbki. W takim przypadku należy energicznie wypolerować powierzchnie optyczne za pomocą chusteczki laboratoryjnej lub zastosować preparat do regeneracji podstawki NanoDrop Pedestal Reconditioning Compound (PR-1) zgodnie z instrukcją.

III. Wyznaczanie stężenia białek w mikroobjętościach z wykorzystaniem testów kolorymetrycznych

a. Zasada detekcji kolorymetrycznej

Spektrofotometr NanoDrop 2000c może być również wykorzystywany do pomiaru nieoznaczonych roztworów białek, lizatów komórkowych oraz surowych ekstraktów białkowych przy użyciu testów kolorymetrycznych.

Metody kolorymetryczne są metodami pośrednimi, które polegają na oddziaływaniu barwnika z komponentem białkowym próbki w celu wytworzenia nowego kompleksu absorbującego światło w zakresie widzialnym.

Spektrofotometr NanoDrop 2000c posiada kilka prekonfigurowanych testów kolorymetrycznych, w tym metody BCA, Pierce 660, Bradforda oraz Lowry'ego. Test BCA zostanie zaprezentowany jako przykładowy test kolorymetryczny z wykorzystaniem mikroobjętościowego spektrofotometru. (zrzut ekranu)

Metoda BCA (kwas biczninkoninowy) to powszechnie stosowana metoda kolorymetryczna, często wykorzystywana do rozcieńczonych roztworów białek oraz białek w obecności składników wykazujących znaczną absorbancję w UV (280 nm). W przeciwieństwie do metody Protein A280, metoda Protein BCA wymaga wyznaczenia krzywej wzorcowej przed pomiarem stężeń białek w próbkach.

Metoda ta wykorzystuje kwas bicinchonininowy (BCA) jako odczynnik detekcyjny. Powstający w obecności białek chelat Cu-BCA jest mierzony przy 562 nm i normalizowany przy 750 nm.

b. Pomiary w mikroobjętościowym teście BCA Przygotowanie testu BCA

1. Wymagane odczynniki znajdują się w zestawie kompatybilnym z czynnikami redukującymi (Thermo Scientific Pierce kat. nr 23250): odczynnik BCA A, odczynnik BCA B, odczynnik do sprawdzania kompatybilności (Compatibility reagent), bufor do reconstitucji oraz standardy albuminy (BSA).
2. Doprowadzić wszystkie nieznane białka oraz standardy białkowe do temperatury pokojowej i dokładnie wymieszać.
3. Przygotować wystarczającą ilość świeżego odczynnika roboczego dla standardów i próbek do pomiaru, stosując stosunek odczynnika A do B wynoszący 50:1.
4. W przypadku mikroanalizy (micro assay) zastosować stosunek odczynnika roboczego do próbki 1:1. Dodać 10 μL odczynnika roboczego do każdej probówki, przygotowując wystarczającą liczbę probówek dla wszystkich próbek i standardów. W przypadku analizy o szerokim zakresie (high-range assay) zastosować stosunek odczynnika roboczego do próbki 20:1. Dodać 190 μL odczynnika roboczego do każdej probówki, przygotowując wystarczającą liczbę probówek dla wszystkich próbek i standardów. Należy zapoznać się z dokumentacją zestawu Pierce BCA, aby ustalić, który stosunek jest odpowiedni dla danych próbek.
5. Dodać 10 μL standardu lub próbki do każdej probówki zawierającej odczynnik. Dobrze wymieszać, delikatnie wstrząsając na wortexie.
6. Inkubować probówki w temperaturze 37 °C przez 30 minut.
7. Pozostawić reakcje do wyrównania temperatury do temperatury pokojowej (~10 minut).

c. Pomiary mikroobjętościowym testem BCA Tworzenie krzywej wzorcowej

1. Wybierz metodę BCA białka z menu głównego. Jeśli pojawi się okno weryfikacji długości fali, upewnij się, że ramię jest opuszczone.
2. Wprowadź wartości dla każdego stężenia standardu w tabeli w prawym panelu. Oprogramowanie umożliwia pomiar referencji oraz do 7 dodatkowych standardów. Referencję i/lub standardy należy mierzyć w powtórzeniach.
   Uwaga: Minimalnym wymogiem dla wygenerowania krzywej wzorcowej jest pomiar dwóch standardów lub pomiar referencji zero oraz co najmniej jednego standardu. Zaleca się dołączenie dodatkowych standardów, jeśli jest to konieczne, aby objąć przewidywany zakres stężeń analizy.
3. Ustal próbę ślepą. Próbą ślepą w analizach kolorymetrycznych jest zazwyczaj dejonizowana H₂O.
4. Napiperetuj 2 μL dH₂O na dolny piedestał, opuść ramię i kliknij Blank. Do wszystkich kolejnych pomiarów referencji i standardów wystarczy jedna próba ślepa.
5. Ustal referencję, pipetując 2 μL aliquotu zawierającego tylko odczynnik roboczy i bufor bez białka na dolny piedestał. Opuść ramię i kliknij Measure.
6. W karcie Standards zaznacz odpowiedni standard i napiperetuj 2 μL wybranego standardu na dolny piedestał. Opuść ramię i kliknij Measure. Powtórz proces dla wszystkich standardów. Przed pomiarem próbek należy zmierzyć wszystkie standardy. Aby wyświetlić krzywą wzorcową, kliknij View Standard Curve.

d. Pomiary mikroobjętościowe testu BCA Pomiary 2 μL białka

1. Po zmierzeniu wszystkich standardów należy kliknąć przycisk Samples. Wprowadź identyfikator próbki. Nanieś 2 μL próbki na dolny postument i kliknij Measure. Do każdego pomiaru należy użyć świeżej alikwoty 2 μL próbki.
2. Wytrzyj próbkę z dolnego i górnego postumentu, używając suchej chusteczki laboratoryjnej.

e. Pomiary mikroobjętościowym testem BCA – czyszczenie i renowacja

Przeprowadź czyszczenie i renowację zgodnie z opisem w sekcji pomiarów bezpośredniej absorbancji przy 280 nm.

Reprezentatywne wyniki:

Oznaczanie stężenia białka w mikroobjętościach przeprowadza się za pomocą bezpośredniego pomiaru A280 lub pośredniego testu kolorymetrycznego. Przykład pomiaru A280 określa stężenie białka na podstawie współczynnika ekstynkcji badanego białka. Przykład kolorymetrycznego testu BCA określa stężenie białka na podstawie krzywej wzorcowej znanych stężeń białka.

Dyskusja

Oznaczanie ilościowe w mikroobjętości wykorzystuje naturalne właściwości napięcia powierzchniowego próbki do utworzenia słupa cieczy pomiędzy dwiema powierzchniami pomiarowymi. Brak urządzenia ograniczającego pozwala na zmianę długości drogi optycznej w czasie rzeczywistym, co w zasadzie eliminuje konieczność wykonywania rozcieńczeń. Możliwość ta drastycznie zwiększa zakres dynamiczny stężeń białek, a także szybkość pomiaru. Dzięki zastosowaniu minimalnych ilości próbki można szybko i dokładnie przeanalizować dużą liczbę próbek, co pozwala naukowcom na wykonanie większej liczby pomiarów i uzyskanie lepszej kontroli jakości. Dodatkowo, w razie potrzeby, cenne próbki można odzyskać po wykonaniu pomiaru. Podczas pomiaru tak małych objętości niezwykle ważna jest homogeniczność próbki, aby uniknąć błędów pobierania. Do nakładania próbek należy zawsze używać końcówek do pipet o niskiej retencji, a końcówki powinny być wymieniane pomiędzy powtórzeniami próbek. Powierzchnie podstawy muszą być odpowiednio oczyszczone i przygotowane, aby zapewnić najdokładniejsze wyniki. Wreszcie, spektrofotometr mikroobjętościowy jest idealny w przypadku ograniczonej ilości próbki, jednak łatwość obsługi, szybkość i rozległy zakres dynamiczny spektrometru sprawiają, że jest on odpowiedni również wtedy, gdy próbki jest pod dostatkiem.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Spektrofotometr NanoDrop 2000c	Thermo Fisher Scientific, Inc.
Chusteczki laboratoryjne
Zestaw do analizy białek Pierce BCA	Thermo Fisher Scientific, Inc.	23250	Kompatybilny z czynnikami redukującymi
Zestaw do regeneracji PR-1	Thermo Fisher Scientific, Inc.