Izolacja i hodowla zarodkowych komórek macierzystych myszy

Podsumowanie

Zdolność embrionalnych komórek zarodkowych do różnicowania się w pierwotne komórki płciowe podczas wczesnych etapów rozwoju stanowi idealny model do zweryfikowania naszej hipotezy dotyczącej nowotworów i niepłodności. Niniejszy protokół przedstawia sposób izolacji pierwotnych komórek płciowych z rozwijających się gonad w embrionach myszy w 10,5–11,5 dniu po zapłodnieniu (post coitum).

Streszczenie

Zdolność embrionalnych komórek zarodkowych (EG) do różnicowania się w pierwotne komórki płciowe (PGC) i w późniejszym etapie w gamety podczas wczesnych faz rozwoju stanowi doskonały model do weryfikacji naszej hipotezy dotyczącej nowotworów i niepłodności. Niniejszy protokół przedstawia sposób izolacji pierwotnych komórek płciowych z rozwijających się gonad zarodków myszy w dniach 10,5–11,5 po zapłodnieniu (dpc). Rozwijające się grzebienie gonadalne z embrionów myszy (C57BL6J) poddano dysocjacji poprzez rozbicie mechaniczne z użyciem kolagenazy, a następnie wysiano na warstwę odżywczą z fibroblastów embrionalnych myszy (MEF-CF1), które uprzednio inaktywowano mitotycznie za pomocą mitomycyny C w obecności pożywki knockout, uzupełnionej o czynnik hamujący białaczkę (LIF), podstawowy czynnik wzrostu fibroblastów (bFGF) oraz czynnik komórek macierzystych (SCF). Zastosowanie tych zoptymalizowanych metod identyfikacji, izolacji i ustalenia warunków hodowli PGC umożliwia długoterminową hodowlę komórek EG przez ponad 40 dni. Linie embrionalnych komórek zarodkowych wykazywały fenotyp embrionalny oraz ekspresję powszechnie stosowanych markerów stanu pluripotencjalnego. Izolacja i wyprowadzenie komórek zarodkowych w hodowli stanowią narzędzie pozwalające zrozumieć ich rozwój in vitro oraz dają możliwość monitorowania kumulatywnych uszkodzeń na poziomie genetycznym i epigenetycznym po narażeniu na stres oksydacyjny.

Protokół

Część 1: Laparotomia u ciężarnej myszy

1. uśmiercić za pomocą zwichnięcia szyi ciężarną samicę myszy C57BL6J w 10,5–11,5 dniu po zapłodnieniu (dpc).
2. oczyścić brzuch mydłem przeciwdrobnkowym, a następnie go ogolić.
3. po ogoleniu przemyć brzuch roztworem soli fizjologicznej.
4. następnie osuszyć brzuch sterylną gazą.
5. przykryć mysz nowym jałowym polem operacyjnym.
6. wykonać nacięcie brzuszne za pomocą pęsety i nożyczek sekcyjnych.
7. zidentyfikować i usunąć całą macicę z jamy brzusznej. Zarodki myszy będą widoczne wewnątrz macicy.
8. przenieść macicę do szalki Petriego wypełnionej D-PBS i przechowywać w lodzie.
9. za pomocą sterylnego skalpela i pęsety usunąć łożysko oraz tkanki pozazarodkowe każdego zarodka.
10. przenieść zarodki do nowej szalki Petriego wypełnionej D-PBS.
11. zmierzyć długość zarodków myszy. Stwierdzono, że rozmiary różniły się w zależności od wieku zarodka. Na przykład w 8,5 dpc średnia długość wynosiła 6 mm, w 10,5 dpc średnio 11 mm, a w 12,5 dpc średnio 16 mm.
12. następnie odciąć ogony w celu ekstrakcji DNA.

Część 2: Disekccja grzebienia gonadalnego

Pod stereomikroskopem i źródłem światła Schott Fostec

1. Umieść papier filtracyjny w szalce Petriego. Następnie połóż na nim zarodek myszy, aby go osuszyć i unieruchomić przed sekcją.
2. Za pomocą sterylnego skalpela wykonaj cięcie poprzeczne zarodka myszy powyżej miejsca przyczepu pępowiny.
3. Pod stereomikroskopem, używając sterylnej pęsety precyzyjnej i sterylnej igły preparacyjnej, usuń jelita oraz wątrobę tak, aby układ moczowy stał się widoczny.
   Nerki znajdują się bocznie w jamie brzusznej, a pęcherz moczowy znajduje się przyśrodkowo i bardziej ku dołowi w porównaniu do nerek. Zarodek można zidentyfikować jako samca, ponieważ grzebienie gonadalne znajdują się po obu stronach pęcherza. U samicy grzebienie gonadalne są ściśle przytwierdzone do boczno-tylnego końca nerek.
4. Oddziel grzebień gonadalny, przesuwając igłę za niego. Grzebień gonadalny usuwa się poprzez odcięcie tkanek go podtrzymujących.
5. Przenieś grzebienie gonadalne do nowej szalki Petriego wypełnionej świeżym D-PBS.
   Pod mikroskopem męski grzebień gonadalny powinien być gładki, duży i mieć kształt owalny. W przeciwieństwie do niego, żeński grzebień gonadalny powinien być nakrapiany, mieć kształt wydłużony i być mniejszy w porównaniu do męskiego grzebienia gonadalnego.

Część 3: Trawienie grzebienia gonadalnego

Pod stereomikroskopem:

1. Disekcja mezonefryka: Oddziel gonadę od mezonefryka i grzebienia za pomocą cienkiej, ostrej igły.
   • Ważne jest usunięcie mezonefryka z grzebienia gonadalnego, ponieważ jest to tkanka somatyczna, która nadmiernie rozrośnie się w procesie wyprowadzania PGC.
2. Trawienie grzebienia gonadalnego: Zbierz czyste grzebienie gonadalne w kropli 0,5ul świeżego D-PBS. Dodaj 20 ml roztworu kolagenazy/dispazy (stężenie końcowe 1mg/ml).
   • Zarodki należy przetwarzać indywidualnie. Każdy zarodek powinien znajdować się w oddzielnej, oznakowanej szalce Petriego.
3. Siekane grzebienia gonadalnego: Pokrój grzebień gonadalny na małe kawałki, używając sterylnej igły i sterylnej cienkiej pęsety nr 4.
4. Inkubacja: Szalki Petriego przenieś do inkubatora w temperaturze 37°C na 15 minut.
   • Czas inkubacji może się różnić w zależności od tkanki.
5. Pipetowanie: Po 15 minutach tkankę można rozdzielić poprzez pipetowanie. Używając dociąganych szklanych kapilar o średnicy od 40 do 100 mm, rozbij kawałki poprzez wielokrotne pobieranie i wypuszczanie cieczy. Powstaną w ten sposób małe grudki. Przenieś grudki do kropli 0,5ml uprzednio ogrzanego D-PBS w celu końcowego płukania.
6. Po płukaniu przenieś grudki do probótek Eppendorf.
   • Nie wystawiaj tkanki na działanie kolagenazy zbyt długo.
   • Nie twórz zawiesiny pojedynczych komórek. Jest to istotne dla formowania kolonii. W przypadku zawiesiny pojedynczych komórek, PGC mają tendencję do różnicowania i migracji.
   • Proces ten nie powinien trwać dłużej niż 20 minut, w przeciwnym razie komórki utracą żywotność.
7. Wiruj przy 2000 rpm przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
8. Po wirowaniu usuń nadsącz i resuspenduj osad w 0,5 ml suplementowanej pożywki knock out (uprzednio ogrzanej do 37°C).

Część 4: Hodowla pierwotnych komórek zarodkowych

"Kolejne kroki należy wykonać szybko, aby zachować żywotność PGC do izolacji i pochodzenia.

1. Na 24 godziny przed rozpoczęciem tego procesu należy przygotować mitotycznie inaktywowaną warstwę karmioną MEF-CF1 zgodnie z protokołem Zhang J. et al 2008.
   • Przygotuj 20 naczyń dla jednej ciężarnej myszy (6-8 embrionów).
   • MEF tracą zdolność do pełnienia funkcji warstwy karmionej (stymulowania wzrostu i zapobiegania różnicowaniu) po 5-6 pasażach.
   • Nie należy używać komórek MEF starszych niż 48 godzin.
2. Bezpośrednio przed wysianiem PGC należy powoli usunąć pożywkę MEF z warstwy karmionej MEF.
3. Następnie do warstwy karmionej MEF należy dodać 0.5 ml/studzienkę uprzednio ogrzanej, uzupełnionej pożywki knockout.
   • Pożywki MEF zawierają płodowe serum bydlęce, które indukuje różnicowanie PGC.
   • Pożywkę knockout należy uzupełnić o gatunkowo swoiste czynniki wzrostu bezpośrednio przed użyciem, aby zapewnić aktywność czynnika wzrostu.
4. Wysiej PGC na warstwę karmioną MEF, zachowując symetryczny rozkład.
   • Jeśli fragmenty znajdują się zbyt blisko siebie, mają tendencję do agregowania i tworzenia gęstych kolonii, które słabo przylegają lub zaczynają się różnicować.
   • Naczynia hodowlane muszą być opisane nazwą linii embrionalnych komórek zarodkowych, numerem pasażu i datą.
5. Ostrożnie przenieś naczynia hodowlane do inkubatora w temperaturze 37°C i 5% CO₂.
6. Monitoruj komórki co 24 godziny.
7. Po 48 godzinach usuń 250 ml pożywki z samej góry hodowli, aby uniknąć naruszenia przylegania kolonii. Następnie dodaj 250 ml świeżej uzupełnionej pożywki knockout (uprzednio ogrzanej do 37°C).
8. Po kroku 7 odczekaj kolejne 48 godzin, a następnie całkowicie usuń całą pożywkę i zastąp ją świeżą uzupełnioną pożywką knockout (uprzednio ogrzaną do 37°C). Powtarzaj tę czynność co 2 dni przez 8-10 dni, aż do czasu uformowania się kolonii PGC.

Część 5: Zarodkowe komórki linii zarodkowej

1. Po 10 dniach izolacji PGC tworzą się kolonie embrionalnych komórek zarodkowych.
2. Linie embrionalnych komórek zarodkowych utrzymuje się przy życiu poprzez manualne pasażowanie co 8-10 dni. Zachowują one niezróżnicowaną morfologię i wykazują ekspresję markerów pluripotencji, takich jak fosfataza alkaliczna, Oct-4, SSEA-1 oraz SOX-2.

Uwagi

• W pomieszczeniu hodowlanym niezbędne jest zachowanie warunków sterylnych/aseptycznych.
• Podczas izolacji i hodowli PGC są przetwarzane w komorze z laminarnym przepływem powietrza klasy II.
• Inkubacje odbywają się w inkubatorze z nawilżaniem w temperaturze 37°C i przy 5% CO₂.
• Wszystkie pożywki i odczynniki przed użyciem są filtrowane przez filtr 0,2 µm, przechowywane w temperaturze 4°C i wstępnie ogrzewane do 37°C.
• Podczas etapów sekcji wszystkie embriony i tkanki muszą być utrzymywane w lodzie.
• Wszystkie kolby z odczynnikami są odkażane etanolem przed umieszczeniem w komorze.
• Obowiązkowe jest stosowanie rękawiczek, fartuchów laboratoryjnych i czepek.

Podsumowanie

Przygotowaliśmy film instruktażowy przedstawiający sposób izolacji, wyprowadzenia i hodowli embrionalnych komórek linii zarodkowej z grzebieni gonadalnych zarodków myszy w wieku 10,5–11,5 dpc. Powtarzalna izolacja i długoterminowa hodowla linii embrionalnych komórek linii zarodkowej stanowią kluczową podstawę do badania wczesnego rozwoju embrionalnego, genetycznych i epigenetycznych wzorców linii zarodkowej, formowania gonad, wpływu środowiskowego sąsiednich organów podczas procesu gametogenezy u zarodków męskich i żeńskich oraz określania ścieżek prowadzących do nowotworów i niepłodności.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Ciężarna samica myszy szczepu C57BL6J w 10,5–11,5 dniu po kopulacji (dpc), skrzyżowana z samcem o tym samym tle genetycznym.
Fibroblasty mysie MEF-CF1 ATCC		SCRC-1040
Dulbecco’bufor fosforanowy (D-PBS)	Invitrogen	14190/086
Roztwór kolagenazy/dispazy	Grupa Roche	269638
Żelatyna	Sigma-Aldrich	G1890
Mitomycyna C	Sigma-Aldrich	M4287
Trypsyna EDTA	Invitrogen	25200-072
Pożywka MEF: Dulbecco's Modified Eagle Medium (D-MEM) z GLUTAMAX, wysoka zawartość glukozy	Invitrogen	10566024
10% płodowa surowica bydlęca	Invitrogen	16000/044
1% antybiotyku-antymykotyku	Invitrogen	15420/096
Poziom Knockout: 80% knockout D-MEM	Invitrogen	10829/018
20% serum Knockout Invitrogen nr kat. 1028/028, 200 mM L-glutamina Invitrogen		25130/081	z β-merkapto–etanol Sigma numer katalogowy: M7522
1X roztwór aminokwasów nieessentialnych	Invitrogen	11140/050
1% antybiotyk-antymykotyk	Invitrogen	15420/096	suplementowane czynnikiem wzrostu w postaci 2500 j. czynnika hamującego białaczkę (mLIF-ESGRO), Millipore numer katalogowy: ESG1106
40 ng/ml rekombinowanego czynnika komórek macierzystych myszy (SCF) ReproTech		250-03
20 ng/ml podstawowego czynnika wzrostu fibroblastów (bFGF)	Invitrogen	13256-029
Szalka hodowlana z wgłębieniem środkowym Corning 60 mm	Fisher Scientific	07-200-79	probówka typu Eppendorf 1,5 ml oraz probówki typu Falcon 15 ml
Pincety nr 14 i 15, skalpel 35 mm, nożyczki do dyssekcji, podkłady chirurgiczne, mydło przeciwbakteryjne, roztwór soli fizjologicznej 0,9%, gaza, styropianowe pojemniki z lodem, żyletka, skalpel 35 mm, pincety precyzyjne nr 4 i 5, precyzyjna igła do separacji z uchwytem, arkusze papieru filtracyjnego oraz wyciągane pipety szklane. Sprzęt: stereomikroskop sekcyjny, źródło światła Schott Fostec, mikroskop odwrócony, mikropipety 10 i 200 µl, wirówka, komora z laminarnym przepływem powietrza.
Sprzęt: stereomikroskop sekcyjny, źródło światła Schott Fostec, mikroskop odwrócony, mikropipety 10 i 200 µl, wirówka, komora z laminarnym przepływem powietrza.
Sprzęt: stereomikroskop sekcyjny, źródło światła Schott Fostec, mikroskop odwrócony, mikropipety 10 i 200 µl, wirówka, komora bezpieczeństwa biologicznego.
Sprzęt: stereomikroskop sekcyjny, źródło światła Schott Fostec, mikroskop odwrócony, mikropipety 10 i 200 μl, wirówka, komora z laminarnym przepływem powietrza.