Badania genetyczne białek naprawy DNA u ludzi z wykorzystaniem drożdży jako systemu modelowego

Podsumowanie

Badania genetyczne na drożdżach mogą być wykorzystywane do badania funkcji molekularnych i komórkowych ludzkich genów w komórkowym metabolizmie DNA. Opisano metody genetycznej charakterystyki produktu ludzkiego genu WRN, którego defekt występuje w zespole Wernera – chorobie objawiającej się przedwczesnym starzeniem się, w funkcjonalnie konserwowanych szlakach, wykorzystując drożdże jako przystępny system modelowy.

Streszczenie

Zrozumienie roli białek naprawy DNA u ludzi w szlakach genetycznych stanowi ogromne wyzwanie dla wielu badaczy. Badania genetyczne w układach ssaków były ograniczone ze względu na brak łatwo dostępnych narzędzi, w tym zdefiniowanych mutantowych linii komórkowych, systemów regulacji ekspresji oraz odpowiednich markerów selekcyjnych. Aby obejść te trudności, modelowe systemy genetyczne u niższych eukariotów stały się atrakcyjnym wyborem do badania funkcjonalnie konserwowanych białek i szlaków naprawy DNA. Opracowaliśmy modelowy układ drożdżowy do badania słabo zdefiniowanych funkcji genetycznych helikazy-nukleazy zespołu Wernera (WRN) w metabolizmie kwasów nukleinowych. Fenotypy komórkowe związane z określonymi tłem genetycznymi mutantów mogą być badane w celu wyjaśnienia funkcji komórkowych i molekularnychWRNpoprzez swoje aktywności katalityczne i oddziaływania białkowe. LudzkiWRNgen i powiązane z nim warianty, sklonowane do plazmidów DNA w celu ekspresji w drożdżach, można poddać kontroli elementu regulacyjnego plazmidu. Następnie konstrukt ekspresyjny można przetransformować do odpowiedniego tła mutacyjnego drożdży, a funkcję genetyczną zbadać za pomocą różnych metodologii. Stosując to podejście, ustaliliśmy, żeWRN, podobnie jak powiązane z nim białka z rodziny RecQ, BLM i Sgs1, działa w ścieżce zależnej od Top3, która prawdopodobnie odgrywa istotną rolę w stabilności genomu. Zostało to opisane w naszej niedawnej publikacji [1] wwww.impactaging.comW niniejszej pracy przedstawiono szczegółowe metody specyficznych testów do badań komplementacji genetycznej w drożdżach.

Protokół

1. Szczepy drożdży

Scharakteryzowano szczepy z dzikim typem SGS1 TOP3 (WT; W303-1A, genotyp MATa ade2-1 canl- 100 his3-11,15 leu2-3,112 trpl-l ura3-1) [2], mutant sgs1 (W1292-3C; genotyp MATa SUP4-o::URA3 sgs1-25 ade2-1 can1-100 his3-11,15 leu2-3,112 trp1-1 ura3-1 rad5-535) oraz mutant sgs1 top3 (W1058-11C, genotyp MATa SUP4-o::URA3 sgs1-25 top3-2::HIS3 ade2-1 can1-100 his3-11,15 leu2-3,112 trp1-1 ura3-1 rad5-535) [3], które zostały uprzejmie udostępnione przez dr. Rodney’a Rothsteina (Columbia University).

2. Konstrukcje plazmidowego DNA

Gen WRN został sklonowany do wektora YEp112SpGAL zgodnie z omówionym schematem.

1. Mutacje ukierunkowane genu WRN (E84A – brak aktywności egzonukleazy, K577M – brak aktywności helikazy, R834C oraz K1016A) w plazmidzie YEp195SpGAL-WRN [4] wprowadzono przy użyciu starterów mutagennych zgodnie ze standardowym protokołem z zestawu Quickchange II XL site-directed mutagenesis kit (Stratagene) w laboratoriach Lofstrand labs (Gaithersburg, MD).
2. Fragmenty DNA kodujące WRN oraz jego warianty zostały oczyszczone z żelu z odpowiednich konstruktów YEp195SpGAL-WRN po podwójnym trawieniu enzymami SalI i MluI.
3. Oczyszczone z żelu fragmenty sklonowano następnie w miejsca cięcia SalI MluI wektora YEp112SpGAL, który jest wielokopiowym plazmidem 2 μm zawierającym marker selekcyjny TRP1 , w celu otrzymania konstruktów YEp112SpGAL WRN lub wariantów WRN pod kontrolą indukowanego galaktozą promotora, jak pokazano na Rysunku 1.
4. Otrzymane w ten sposób konstrukty nazwano YEp112SpGAL-WRN, YEp112SpGAL-WRN E84A, YEp112SpGAL-WRN K577M, YEp112SpGAL-WRN K1016A oraz YEp112SpGAL-WRN R834C.

3. Transformacja

Kultury drożdży hodowano zgodnie ze standardowym protokołem, a transformacje przeprowadzono zgodnie z protokołem opartym na octanie litu opracowanym przez Gietz et al [5]. W skrócie wykonano następujące kroki.

1. Kultury wyżej wymienionych szczepów hodowano przez noc w 5 ml pożywki YPD (wyciąg drożdżowy-pepton-dekstroza). Kultury zaszczepiono ponownie w 50 ml pożywki YPD i pozwolono im rosnąć do momentu osiągnięcia OD₆₀₀ na poziomie 1,0 - 1,2.
2. Kultury odwirowano, przemyto 20 ml wody i resuspensowano w 1 ml 100 mM octanu litu (LiAc). Komórki inkubowano w temperaturze 30°C przez 10 min.
3. Osad komórkowy resuspensowano w 100 mM LiAc do objętości końcowej 500 μl, co wystarcza na przeprowadzenie dziesięciu transformacji. Odmierzono aliquoty po 50 μl zawiesiny komórkowej, a osad komórkowy zebrano poprzez wirowanie.
4. Do osadu komórkowego dodano w następującej kolejności: 250 μl 50% glikolu polietylenowego (PEG), 36 μl 1 M LiAc, 25 μl 2 mg/ml ssDNA (DNA z plemników łososia), 5 ml plazmidowego DNA (100 ng - 1000 ng) oraz 50 μl wody. Osad komórkowy mieszano na vortexie przez 1 min.
5. Następnie komórki inkubowano w temperaturze 30°C przez 30 min, po czym zastosowano szok termiczny w 42°C przez 20 min.
6. Komórki zebrano i resuspensowano w 1 ml wody. Ponieważ plazmid YEp112SpGAL zawiera gen trp jako marker selekcyjny, wszystkie szczepy mutanty posiadające konstrukt będą protrofią względem trp. W związku z tym transformanty wyselekcjonowano poprzez wysianie zawiesiny na pożywkę SC (Synthetic complete) z glukozą, pozbawioną Trp, i inkubowanie płytek w 30°C przez 3-4 dni do czasu pojawienia się kolonii.

4. Analiza genetyczna przywrócenia fenotypu powolnego wzrostu w szczepie sgs1 top3 transformowanym genem WRN.

1. Analiza smug:

1. Aby zbadać wpływ ekspresji WRN na wzrost szczepów rodzicielskich typu dzikiego (W303-1A), sgs1 lub sgs1 top3, odpowiednie szczepy z YEp112SpGAL lub YEp112SpGAL-WRN wysiano na płytki SC minus Trp zawierające 2% glukozy (glu) lub 2% galaktozy (gal). Jako kontrolę uwzględniono szczep sgs1 top3/YEp112SpGAL-SGS1. Płytki inkubowano w temperaturze 30°C przez 2 dni.
2. Aby określić zdolność WRN do wpływania na tempo wzrostu szczepu sgs1 top3 przy niższych poziomach ekspresji białka WRN, szczepy sgs1 top3 transformowane YEp112SpGAL, YEp112SpGAL-WRN lub YEp112SpGAL-SGS1 wysiano na płytki SC minus Trp zawierające różne stężenia gal, od 0,005% do 2%. Następnie płytki inkubowano w temperaturze 30°C przez 2 dni.
3. Aby ocenić wymagania funkcjonalne WRN w celu przywrócenia fenotypu powolnego wzrostu w tle sgs1 top3, szczepy sgs1 top3 transformowane YEp112SpGAL-WRN (E84A, K577M, R834C oraz K1016A) wysiano na płytki SC minus Trp zawierające glu lub gal w zaznaczonych stężeniach. Jako kontrole uwzględniono szczep sgs1 top3 transformowany YEp112SpGAL, YEp112SpGAL-WRN lub YEp112Sp GAL-SGS1. Następnie płytki inkubowano w temperaturze 30°C przez 2 dni.

2. Analiza hodowli ciekłej:

1. W celu oceny wzrostu transformowanych szczepów sgs1 top3 w kulturze płynnej, komórki drożdży hodowano w pożywce SC raf minus Trp w temperaturze 30°C przez noc. Kultury ponownie zaszczepiono w pożywce SC raf minus Trp i inkubowano w temperaturze 30°C do wczesnej fazy logarytmicznej (OD₆₀₀ ok. 0,5). Następnie kultury ponownie zaszczepiono w pożywce SC zawierającej 2% gal przy OD_0.05, a wzrost monitorowano poprzez pomiar absorbancji w określonych odstępach czasu.

5. Analiza genetyczna wrażliwości na hydroksymocznik lub metanosulfonian metylu w szczepach drożdży transformowanych WRN.

1. Aby określić wpływ ekspresji WRN na wrażliwość szczepów sgs1 lub sgs1 top3 na MMS i HU, szczepy transformowane plazmidami YEp112SpGAL lub YEp112SpGAL-WRN hodowano w pożywce SC raf bez Trp w temperaturze 30°C.
2. Kultury przeniesiono do świeżej pożywki SC raf bez Trp i inkubowano w 30°C do wczesnej fazy logarytmicznej (OD₆₀₀ od ~0,6 do 0,8).
3. Przygotowano dziesięciokrotne rozcieńczenia seryjne tych szczepów w pożywce SC bez Trp. Z kultury w fazie wzrostu wykładniczego pobrano 5 x 10⁶ komórek i rozcieńczano seryjnie do 10 000 razy. Cztery mikrolitry każdego rozcieńczenia naniesiono na płytki SC gal bez Trp zawierające wskazane stężenia HU lub MMS. Płytki inkubowano w temperaturze 30°C.
4. W ramach kontroli, w opisany powyżej sposób traktowano szczep rodzicielski typu dzikiego (W303-1A) transformowany YEp112SpGAL lub YEp112SpGAL-WRN, a także szczep sgs1 top3/ YEp112SpGAL-SGS1.

6. Rozkład cyklu komórkowego szczepu sgs1 top3 transformowanego genem WRN.

1. Aby zbadać rozkład cyklu komórkowego szczepu sgs1 top3 przekształconego WRN, kultury sgs1 top3 przekształcone YEp112SpGAL, YEp112SpGAL-WRN lub YEp112SpGAL-SGS1 oraz szczep rodzicielski typu dzikiego przekształcony wektorem (W303-1A) hodowano w pożywce SC raf minus trp w temperaturze 30°C przez noc.
2. Kultury ponownie zaszczepiono przy OD_0.05 i pozostawiono do wzrostu do wczesnej fazy logarytmicznej (OD₆₀₀ od 0.5 do 0.6). Ekspresję WRN indukowano poprzez dodanie galaktozy do stężenia końcowego 2%. Następnie kultury inkubowano w 30°C przez 6 h.
3. Kultury poddano następnie barwieniu DAPI (4', 6-diamidino-2-fenyloindolem).
   1. Kultury zebrano poprzez wirowanie przy 5800 x g przez 10 min w temperaturze pokojowej (RT).
   2. Komórki przemyto raz 1X solą fizjologiczną z buforem fosforanowym (PBS), a następnie utrwalono w 70% etanolu przez 20 min w RT.
   3. Utrwalone komórki przemyto dwukrotnie 1X PBS, a na koniec zawieszono ponownie w 1X PBS.
4. Komórki naniesiono na szkiełko i zamontowano w medium montażowym Vectashield z DAPI (1 μg/ml) (Vector, USA). Komórki analizowano za pomocą mikroskopu Axiovert 200 M (Zeiss; obiektyw 100x) z zastosowaniem kontrastu interferencyjnego (DIC). Obrazy fluorescencyjne analizowano przy użyciu programu AxioVision w wersji 3.0 (Zeiss).

7. Analizy Western blot.

1. Aby określić ekspresję białka WRN lub wariantów WRN w zmodyfikowanych szczepach sgs1 lub sgs1 top3, lizaty przygotowano zgodnie z poniższą metodą, a następnie przeanalizowano białka metodą immunoblottingu.

1. Przetransformowane szczepy sgs1 lub sgs1 top3 hodowano w pożywce SC raf minus Trp w temperaturze 30°C przez noc.
2. Kultury ponownie szczepiono i inkubowano w 30°C do wczesnej fazy logarytmicznej (OD₆₀₀ od 0,5 do 0,8), a następnie indukowano poprzez dodanie gal do stężenia końcowego 2%. Kultury pozostawiono do wzrostu w 30°C przez 6 h.
3. Komórki (3 ml) zebrano poprzez wirowanie i przemyto PBS. Osad komórkowy zawieszono w buforze do lizy alkalicznej [50 mM NaOH, pH 10,5, 2 mM EDTA, 1 mM fenylometylosulfonylofluorid (PMSF), 2% SDS, 10% glicerolu, 5% 2-merkaptoetanolu oraz inhibitorów proteaz (Roche Molecular Biochemicals)], gotowano przez 5 min, klarowano przez wirowanie i zneutralizowano 1 M HCl.
4. Białka z równoważnych ilości lizatu komórkowego rozdzielono na żelach poliakryloamidowych SDS o stężeniu 8-16%.

2. Aby określić poziom ekspresji białka WRN pod wpływem różnych stężeń galaktozy, hodowle poddano następującym zabiegom.

1. Przetransformowane szczepy sgs1 top3 hodowano w pożywce SC raf minus Trp w temperaturze 30°C przez noc.
2. Kultury ponownie zaszczepiono i inkubowano w temperaturze 30°C do wczesnej fazy logarytmicznej (OD₆₀₀ od 0,5 do 0,8), a następnie indukowano poprzez dodanie gal do stężenia końcowego 2%. Kultury pozostawiono do wzrostu w temperaturze 30°C przez 6 h.
3. Komórki zebrano poprzez wirowanie i resuspendowano w buforze (50 mM Tris-Cl, pH 7,5, 1% deoksycholan sodu, 1% Triton X-100, 0,1% dodecylosiarczanu sodu [SDS]) zawierającym inhibitory proteaz (0,05% PMSF, 0,05 μg/ml leupeptyny).
4. Do mieszaniny dodano szklane kuleczki (od 425 do 600 μm), a komórki rozbito za pomocą wortexowania.
5. Otrzymany homogenat wirowano przez 5 min przy 15000 x g i zebrano frakcję nadsączu.
6. Zawartość białka we frakcjach lizatu oszacowano metodą Bradforda.
7. Równe stężenia białka z różnych frakcji lizatu rozdzielono na 8-16% żelach poliakryloamidowych SDS.

3. Ekspresję białek WRN lub mutantów WRN określono za pomocą techniki Western blot, wykorzystując mysi przeciwciało monoklonalne przeciwko WRN skierowane przeciwko epitopowi w oczyszczonym fragmencie C-końcowym WRN [6] (1:1000, Spring Valley Labs).

4. Po inkubacji z przeciwciałem pierwotnym przeprowadzono inkubację z przeciwciałem wtórnym (sprzężonym z peroksydazą chrzanową) (1:5000). Bloty opracowano za pomocą systemu detekcji Western ECL Plus zgodnie z protokołem producenta.

5. W przypadku ilościowej analizy Western blot zastosowano zwiększające się stężenia oczyszczonego rekombinowanego pełnowymiarowego białka z etykietą His-tag WRN białka naniesiono na żele w taki sposób, aby po kwantyfikacji blotu można było wygenerować standardową krzywą liniową. Ponadto zastosowano ekstrakt komórkowy z równoważnej liczby komórek lub 20 μg próbki lizatu drożdży naniesiono na żele w celu oszacowania stężenia WRN.

6. Następnie przeprowadzono analizę ImageQuant żeli i wygenerowano standardową krzywą liniową.

7. Stężenie białka WRN przy różnych stężeniach galaktytozy oszacowano przy użyciu powyższej standardowej krzywej liniowej.

8. Reprezentatywne wyniki

Wszystkie szczepy użyte w niniejszym badaniu są aukstrofami Trp. W związku z tym szczepy sgs1, sgs1 top3 oraz szczep typu dzikiego W303-1A przekształcone za pomocą YEp112SpGAL lub YEp112SpGAL-WRN selekcjonowano na podstawie ich zdolności do wzrostu w obecności pożywki SC minus Trp. Aby zbadać wpływ ekspresji WRN na wzrost przekształconych komórek mutanta sgs1 top3, kultury wysiano na płytki zawierające pożywkę SC minus Trp z 2% gal w celu indukcji ekspresji WRN. Top3 rozplata splecione cząsteczki DNA generowane przez helikazę Sgs1 podczas replikacji [1, 2]; zatem w przypadku braku Top3 naprężenia skrętne nie są niwelowane, co skutkuje spowolnionym wzrostem i hiperrekombinacją. Funkcją genetyczną sgs1 jest supresja fenotypu spowolnionego wzrostu mutanta top3. Gdyby WRN mógł zastąpić SGS1 w interakcji genetycznej z Top3, należałoby spodziewać się przywrócenia fenotypu spowolnionego wzrostu top3 u sgs1 top3.

Jak pokazano na Rysunku 2A, szczep sgs1 top3 transformowany genem WRN rósł znacznie wolniej w porównaniu do szczepu sgs1 top3 transformowanego wektorem. Jako kontrolę pozytywną uwzględniono szczep sgs1 top3 transformowany plazmidem YEp112SpGAL-SGS1 (Rysunek 2A), co wykazało, że Sgs1 typu dzikiego wyrażony w mutancie sgs1 top3 był w stanie genetycznie skompensować fenotyp wzrostu. Transformowane szczepy sgs1 top3 rosły podobnie w obecności gal przez okres 2 dni (Rysunek 2A). Ekspresja WRN nie miała wpływu na wzrost szczepów rodzicielskich typu dzikiego (W3031A) ani szczepów sgs1 (Rysunek 2B), co wskazuje, że wpływ WRN na wzrost komórek był specyficzny dla efektu obserwowanego w tle mutanta sgs1 top3 . Badania genetyczne przeprowadzone z użyciem wariantów WRN wykazały, że do przywrócenia fenotypu wzrostu top3 niezbędna była aktywność helikazowa, a nie egzonukleazowa WRN (Rysunek 3B). Naturalnie występujący polimorfizm missense w genie WRN, który zakłóca aktywność helikazy, znosił zdolność do przywrócenia fenotypu powolnego wzrostu top3.

top3 szczepy mutantowe wykazują opóźnienie w późnej fazie S/G2 cyklu komórkowego [1], co może wyjaśniać ich wolny wzrost. Mutacja genu SGS1 w tle top3 znosi opóźnienie w fazie S/G2 cyklu komórkowego. Gdyby ekspresja WRN była w stanie przywrócić opóźnienie w fazie S/G2 cyklu komórkowego w szczepie sgs1 top3, w przypadku komórek mutantów sgs1 top3 wykazujących ekspresję WRN należałoby spodziewać się zwiększonej populacji dużych komórek z pączkami i niepodzielonymi jądrami. Jak pokazano na Rysunku 4, odsetek dużych komórek z pączkami był wyższy dla sgs1 top3/WRN niż dla sgs1 top3/vector, co sugeruje przywrócenie opóźnienia w fazie S/G2 charakterystycznego dla top3.

The sgs1 top3 podwójny mutant wykazuje mniejszą wrażliwość na MMS lub HU niż top3 pojedynczy mutant [2]. Ponieważ WRN wpłynęło na wzrost komórek sgs1 top3następnie zbadaliśmy jego wpływ na wrażliwość na metylometanosulfonian (MMS, czynnik alkilujący) oraz hydroksymocznik (HU, inhibitor replikacji). sgs1 top3 / WRN wykazały wrażliwość na oba leki porównywalną do sgs1 top3/ SGS1 (rycina 5). Analiza genetyczna WRN warianty ujawniły, że WRN helikaza /ATPase, ale nie WRN aktywność egzonukleazy była niezbędna do wywołania efektu w zakresie wrażliwości na MMS i HU.

Rysunek 1. Schemat klonowania WRN / wariantów WRN w wektorze YEp112SpGAL. Prosimy kliknąć tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję rysunku 1.

Rysunek 2. WRN ekspresja w sgs1 top3 przywraca fenotyp spowolnionego wzrostu u top3. Panel A, sgs1 top3 szczep transformowany plazmidem YEp112SpGAL lub YEp112SpGAL WRN wykreślono na płytkach SC-Trp zawierających 2% glukozy lub 2% galaktozy. Jako kontrolę Sgs1 Top3 szczep transformowany plazmidem YEp112SpGAL SGS1 wymazano na obu płytkach. Płytki inkubowano w temperaturze 30°C przez 2 dni, a następnie sfotografowano. Panel B, szczep rodzicielski typu dzikiego W303-1A lub sgs1 szczep transformowany plazmidem YEp112SpGAL lub YEp112SpGAL WRN wykreślono na płytkach SC-Trp zawierających 2% glukozy lub 2% galaktozy. Płytki inkubowano w 30°C przez 4 dni, a następnie sfotografowano. Skład płytek był zgodny z Panel A i Panel B odpowiednio. Proszę kliknij tutaj aby zobaczyć powiększoną wersję rysunku 2.

Rysunek 3. Aktywność ATPase/helikazy, a nie egzonukleazy białka WRN, jest wymagana do przywrócenia fenotypu powolnego wzrostu top3 w tle sgs1 top3. Szczep sgs1 top3 transformowany wariantem pozbawionym aktywności ATPase/helikazy (YEp195SpGAL WRN K577M), pozbawionym aktywności egzonukleazy (YEp195SpGAL-WRN E84A), mutantem RQC (YEp195SpGAL-WRN K1016A) lub mutantem polimorficznym (YEp195SpGAL-WRN R834C) został wysiany na płytki SC-Trp zawierające 2% glu (Panel C) lub 2% gal (Panel B). Płytki inkubowano w temperaturze 30°C przez 2 dni, a następnie sfotografowano. Skład płytek był taki sam jak w Panelu A. Prosimy kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję rysunku 3.

Rycina 4. Ekspresja WRN indukuje zatrzymanie cyklu w fazie S/G2 w komórkach sgs1 top3. Kultury szczepu sgs1 top3 w fazie wzrostu logarytmicznego, transformowane wektorami YEp112SpGAL, YEp112SpGAL WRN lub YEp112SpGAL SGS1, a także szczep rodzicielski typu dzikiego transformowany samym wektorem, poddano indukcji przy stężeniu galaktozy 2% przez 6 h. Kultury zebrano i poddano barwieniu DAPI zgodnie z opisem w sekcji Materiały i metody, a następnie analizowano przy użyciu mikroskopu Axiovert 200 M (Zeiss; obiektyw 100x). Przedstawiono barwienie DAPI komórek sgs1 top3 transformowanych YEp112SpGAL (lewa góra) oraz YEp112SpGAL WRN (prawa góra). Strzałki wskazują komórki z niepodzielonymi jądrami. Rozkład komórek w fazie G1 (komórki pojedyncze) i S/G2 (komórki z pączkami) pokazano w dolnym panelu. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję ryciny 4.

Rysunek 5. Wpływ ekspresji WRN na wrażliwość szczepu sgs1 top3 na MMS i HU. Kultury szczepu sgs1 top3 w fazie wzrostu logarytmicznego, przekształcone wektorami YEp112SpGAL, YEp112SpGAL WRN, mutantem z nieaktywną egzonukleazą (YEp112SpGAL-WRN E84A), mutantem z nieaktywną ATPazą/helikazą (YEp112SpGAL WRN K577M), mutantem RQC (YEp112SpGAL-WRN K1016A), mutantem polimorficznym (YEp112SpGAL-WRN R834C), YEp112SpGAL SGS1 oraz szczepy rodzicielskie typu dzikiego przekształcone wektorem, naniesiono w formie dziesięciokrotnych rozcieńczeń szeregowych na płytki SC-Trp zawierające glu lub gal oraz MMS lub HU w indicated stężeniach. Płytki inkubowano w 30°C przez 2 dni (płytki kontrolne) i 4 dni (płytki z MMS i HU), a następnie sfotografowano. Prosimy kliknąć tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję rysunku 5.

Dyskusja

Jedną z zalet wykorzystania drożdży jako systemu modelowego jest dostępność mutantów w zdefiniowanych szlakach replikacji i naprawy DNA, które są konserwowane między drożdżami a ludźmi. Dalsza selekcja transformantów zawierających specyficzne geny jest łatwa i niezawodna, ponieważ szczepy laboratoryjne są mutantami auksotroficznymi, a wektory z markerami auksotroficznymi są łatwo dostępne. Przy użyciu tych wektorów ekspresję produktów genów można regulować, umieszczając je pod kontrolą promotora indukowalnego (np. promot...