W niniejszym materiale przedstawiamy sposób wykonywania iniekcji do zatoki nadoczodołowej u dorosłych rybek zebrafish.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Iniekcja zaoczna u dorosłych danio pręgowanych
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Leczenie farmakologiczne całych organizmów jest niezbędnym narzędziem w każdym systemie modelowym wykorzystywanym w badaniach farmakologicznych i chemicznej genetyce. Wtryskiwanie dożylne (IV) jest często najskuteczniejszą i najmniej inwazyjną formą podawania interesującego związku. U danio przeżebrowanego (Danio rerio), wstrzykiwanie leków dożylnie (IV) od dawna stanowiło wyzwanie ze względu na małą średnicę naczyń. Okazało się to również istotną przeszkodą w przypadku wstrzykiwania komórek podczas transplantacji hematopoetycznych komórek macierzystych. Historycznie wstrzyknięcia do krwiobiegu wykonywano bezpośrednio przez serce. Jednak ta procedura wewnątrzsercowa wiąże się z bardzo wysokim wskaźnikiem śmiertelności, ponieważ podczas wstrzykiwania często dochodzi do przebicia serca, co naraża ryby na infekcje, masową utratę krwi lub śmiertelne uszkodzenie organów. Korzystając z naszego doświadczenia z myszami, opracowaliśmy nową procedurę wstrzykiwania u danio-zebry, w której miejsce iniekcji znajduje się za okiem, w zatoki żylne zaocznej. Ta technika wstrzykiwania zaocznego (RO) została z sukcesem zastosowana zarówno do podawania leków dorosłym rybom, jak i do transplantacji całych komórek szpiku nerkowego. Wstrzykiwanie RO charakteryzuje się znacznie niższą śmiertelnością niż tradycyjne wstrzykiwanie wewnątrzsercowe. Ryby poddane iniekcji zaocznej wykazują tendencję do mniejszych krwawień po zabiegu i są znacznie mniej narażone na uszkodzenie kluczowych organów, takich jak serce. Co więcej, przy prawidłowym wykonaniu, wstrzyknięte komórki i/lub leki szybko przedostają się do krwiobiegu, co pozwala związkom wywierać działanie na cały organizm ryby, a komórkom nerkowym na łatwe dotarcie do ich niszy. Tym samym ta nowa technika wstrzykiwania minimalizuje śmiertelność, umożliwiając jednocześnie efektywne dostarczanie materiału do krwiobiegu dorosłych ryb. W niniejszej pracy demonstrujemy tę technikę poprzez wstrzyknięcie zaoczne Tg(globinakomórki (GFP) do osobników dorosłychcasperryb, jak również wstrzyknięcie czerwonego barwnika fluorescencyjnego (dekstran, Texas Red ) w osobników dorosłychcasperryb. Następnie wizualizujemy udane wstrzyknięcia za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej całego organizmu.
Protokół
Część 1. Przygotowanie materiału do wstrzyknięcia
- Komórki Tg(globin:GFP):
- Pobierz krew z dorosłych ryb dawców, używając końcówki pipety 10ul pokrytej heparyną (1unit/ul), nakłuwając rybę za skrzela.
- Odessaj erytrocyty i przenieś je do buforu komórkowego (0,9X PBS + 5% FBS + 1% Pen/Strep).
- Przefiltruj zawiesinę komórkową przez sito 40uM i wyznacz stężenie komórek za pomocą komory licznikowej, zgodnie z wcześniejszym opisem LeBlanc i wsp.
- Odwiruj i resuspenderuj w buforze komórkowym do pożądanego stężenia, tak aby końcowa objętość iniekcji nie przekraczała 5ul. W tej procedurze wstrzykujemy 1,5-2 miliona komórek na rybę biorcę.
- W przypadku dekstranu Texas Red®, rozpuść barwnik w DPBS, aby uzyskać końcowe stężenie iniekcyjne 10-12 mg/mL. Zaplanuj wstrzyknięcie 4 uL na rybę.
Część 2. Iniekcja
- Zanurzyć ryby w roztworze trikainy w celu znieczulenia (4,2 ml (4 mg/ml) trikainy/100 ml wody dla ryb).
- Przed iniekcją przemyć strzykawkę Hamiltona 3-4 razy 70% etanolem. Następnie przepłukać 3-4 razy 0,9X DPBS.
- Umieścić rybę na wilgotnej gąbce grzbietem do góry, skierowaną prawą stroną.
- Trzymać strzykawkę Hamiltona w prawej ręce, opierając palec wskazujący na tłoku. Delikatnie ustabilizować ciało ryby lewą ręką.
- Ustawić igłę ściętym końcem do góry w taki sposób, aby – przyjmując oko ryby za tarczę zegara – igła wskazywała godzinę 7:00 i była ustawiona pod kątem 45 stopni względem ryby (rycina 1).
- Delikatnie wprowadzić igłę na głębokość 1-2 mm w pozycji godziny 7:00 i powoli nacisnąć tłok.
- Pozostawić rybę do regeneracji w świeżej wodzie E3.
- Między iniekcjami różnych odczynników przemyć igłę zgodnie z powyższym opisem.
- Co kilka minut delikatnie potrząsnąć zawiesiną komórkową w celu resuspensji komórek i zapobiegania ich agregacji.
- Przez 1 tydzień utrzymywać ryby poza przepływem, dokonując codziennych podmian wody, aby uniknąć infekcji. W tym okresie ryby utrzymujemy w wodzie ICU (10 mL Stress coat + 5 mL pemafix + 5 mL melafix na 38 litrów wody E3).
Część 3. Reprezentatywne wyniki
Przy prawidłowym wykonaniu możliwe jest zwizualizowanie wstrzykniętego materiału, jeśli został on w jakiś sposób znakowany. Na przykład, krwinki czerwone Tg(globin:GFP) powinny być widoczne pod fluorescencyjnym mikroskopem sekcyjnym, krążące w układzie naczyniowym ryb biorców casper wkrótce po wstrzyknięciu, jak pokazano na rysunku 2. Podobnie, wstrzyknięcie dekstranu 70kDa, sprzężonego z Texas Red®, może być zwizualizowane w układzie naczyniowym przezroczystych ryb bezpośrednio po wstrzyknięciu zaocznojemiołkowym (rysunek 3). Fluorescencyjne komórki nerek od ryb dawców Tg(β-actin:GFP) mogą być również wstrzykiwane zaocznojemiołkowo do napromieniowanych ryb biorców casper. Komórki te z czasem zlokalizują się w szpiku biorcy (rysunek 4a), a następnie mogą repopulować nerki po kilku tygodniach (rysunek 4b).
Jeśli wstrzyknięcie jest zbyt płytkie lub kąt wprowadzenia igły omija jamę zatoki żylnej okołogałkowej, wstrzyknięty materiał może gromadzić się wokół oka lub wypływać z niego. Z kolei, jeśli wstrzyknięcie jest zbyt głębokie, u ryb może dojść do uszkodzenia tkanek lub nadmiernego krwawienia, choć mogą one nadal przeżyć. Przy prawidłowym wykonaniu, śmiertelność po wstrzyknięciu okołogałkowym powinna wynosić mniej niż 5% wszystkich wstrzykniętych ryb, a skuteczność wprowadzenia substancji do krwiobiegu powinna przekraczać 90% wszystkich wstrzykniętych ryb.
Rycina 1: Ilustracja techniki wstrzykiwania za gałkę oczną. Prawe oko ryby przedstawiono jako zegar analogowy, w którym pozycja godziny siódmej odpowiada właściwemu miejscu wstrzyknięcia.
Rycina 2: Krwinki czerwone Tg(globin:GFP) krążące w naczyniach krwionośnych ogona dorosłej ryby casper trzy dni po iniekcji zaocznej.
Rycina 3: Pomyślna iniekcja dekstranu 70kDa sprzężonego z Texas Red® używanego jako barwnik pozwala na uzyskanie fluorescencyjnego układu naczyniowego u przezroczystej dorosłej ryby casper , co jest łatwo widoczne przy użyciu standardowej mikroskopii fluorescencyjnej całego organizmu.
Rysunek 4a: Trzy dni po wstrzyknięciu do zatoki okołogałkowej pełnych komórek szpiku nerkowego od ryb dawców Tg(β-actin:GFP), można zaobserwować migrację komórek do szpiku nerkowego napromieniowanych dorosłych ryb biorców casper.
Rycina 4b: Cztery tygodnie po wtryśnięciu do przestrzeni zakrwawnej za gałką oczną komórek szpiku całej nerki od ryb dawców Tg(β-actin:GFP), repopulacja nerki biorcy zielonymi komórkami szpiku całej nerki dawcy może być zwizualizowana u napromieniowanych dorosłych ryb biorców casper.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Wstrzykiwanie do przestrzeni zaocznej u dorosłych danio pręgowanych zapewnia najwyższą wydajność dostarczania wstrzykniętego materiału do krwiobiegu przy najniższym wskaźniku śmiertelności. Ze względu na charakter miejsca wkłucia, punkt nakłucia goi się szybko, co zmniejsza ryzyko infekcji oraz ilość utraconej krwi. W tym samym miejscu można przeprowadzać wielokrotne iniekcje w krótkich odstępach czasu, na przykład w celu codziennego podawania leków.
Tradycyjne metody leczenia dorosłych ryb, ...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Podziękowania
Niniejsza praca jest wspierana przez Howard Hughes Medical Institute oraz grant z NIH na badanie hematopoezy embrionalnej.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Sól sodowa heparyny z błony śluzowej jelita świni | Sigma-Aldrich | 2106 | Zważona fiolka zawierająca 300 jednostek USP |
| Tricaine-S | Western Chemical | MS-222 | |
| Dulbecco’bufor fosforanowy (PBS) | Invitrogen | 14190-144 | |
| Dekstran, Texas Red® | Molecular Probes, Life Technologies | D1830 | |
| E3 | 5mM NaCl 0,17 mM KCl 0,33 mM CaCl22 0,33 mM MgSO₄2 | ||
| Strzykawka mikrolitrowa | Hamilton Co | 80300 | 701N 10uL SYR (26s/2”/2) |
Bibliografia
- Steel, C. D., Stephens, A. L., Hahto, S. M., Singletary, S. J., Ciavarra, R. P. Comparison of the lateral tail vein and the retro-orbital venous sinus as route of intravenous drug delivery in a transgenic mouse model. Lab Animal. 37, 26-32 (2008).
- Pinkerton, W., Webber, M. A method of injecting small laboratory animals by the ophthalmic plexus route. Proc. Soc. Exp. Bio. Med. 116, 959-961 (1964).
- White, R. M., Sessa, A. S., Burke, C., Bowman, T., LeBlanc, J., Ceol, C., Bourque, C., Dovey, M., Goessling, W., Burns, C. E., Zon, L. I. Transparent adult zebrafish as a tool for in vivo transplantation analysis. Cell Stem Cell. 2, 183-189 (2008).
- LeBlanc, J., Bowman, T. V., Zon, L. I. Transplantation of whole kidney marrow in adult zebrafish. J. Vis. Exp. , (2007).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
