Modelowanie zapalenia jelita grubego u myszy z użyciem dekstranu siarczanu sodu (DSS)

Podsumowanie

Dekstran siarczan sodu (DSS) podawany w wodzie pitnej jest uznanym mysim modelem uszkodzenia zapalnego w przebiegu ostrego colitis. Niniejszy protokół opisuje metodę podawania DSS oraz przygotowania tkanek.

Streszczenie

Zapalenie jelita grubego może być wynikiem infekcji wirusowych lub bakteryjnych, niedokrwienia lub schorzeń autoimmunologicznych; najczęściej dotyczy to wrzodziejącego zapalenia jelita grubego oraz postaci jelitowej choroby Crohn – zapalenia jelita grubego w przebiegu choroby Crohn. Ostre zapalenie jelita grubego może objawiać się bólem i wzdęciem brzucha, zaburzeniami wchłaniania, biegunką, krwieniami oraz obecnością śluzu w stolcu. Zaczynamy rozumieć złożone interakcje między środowiskiem, genetyką a dysfunkcją bariery nabłonkowej w nieswoistych zapaleniach jelit, a modele zwierzęce zapalenia jelita grubego okazały się kluczowe dla pogłębienia naszej wiedzy na temat tej choroby. Jeden z popularnych modeli polega na suplementacji wody pitnej myszy niskocząsteczkowym siarczanem dekstranu sodu (DSS), co prowadzi do uszkodzenia nabłonka i silnej odpowiedzi zapalnej w jelicie grubym trwającej kilka dni.¹Warianty tego podejścia można wykorzystać do modelowania ostrego urazu, ostrego urazu z następującym po nim procesem naprawczym oraz powtarzających się cykli podawania DSS przeplatanych okresami rekonwalescencji w celu modelowania przewlekłych chorób zapalnych²Po jednorazowej czterodniowej kuracji 3% DSS w wodzie pitnej u myszy pojawiają się objawy ostrego zapalenia jelita grubego, w tym utrata masy ciała, krwawiste stolce i biegunka. Myszy są uśmiercane po zakończeniu cyklu leczenia, a podczas sekcji wycięte okrężnice są przetwarzane i mogą zostać poddane technice „szwajcarskiego rolowania” (Swiss roll).³aby umożliwić analizę mikroskopową całego jelita grubego lub nasyconą formaliną w formie tzw. „parówek” w celu umożliwienia analizy makroskopowej. Następnie tkankę zatapia się w parafinie, wykonuje skrawki i barwi w celu oceny histologicznej.

Protokół

Część 1: Model zapalenia jelita grubego w cyklu uszkodzenie-naprawa

1. Przed rozpoczęciem podawania DSS należy zmierzyć masę początkową każdej myszy.
2. Przygotować 3% (w/v) roztwór siarczanu dekstranu sodu (DSS) w wodzie i przefiltrować go za pomocą filtra z octanu celulozy o wielkości porów 0,45 μm.
3. W klatkach z myszami zastąpić wodę pitną 3% roztworem DSS na okres czterech dni. Myszy nie powinny mieć dostępu do żadnego innego źródła wody (np. poprzez zastosowanie końcówek blokujących w automatycznych systemach pojenia).
4. W czwartym dniu zastąpić roztwór DSS wodą na kolejne trzy dni, aby umożliwić częściową regenerację nabłonka jelita grubego. W czwartym dniu należy zważyć myszy w celu określenia ogólnoustrojowych następstw zapalenia jelit. Utrata masy ciała jest częsta w przypadku ciężkich uszkodzeń.
5. W siódmym dniu zważyć i poświęcić myszy. Eutanazję myszy można przeprowadzić poprzez przedawkowanie izofluranu drogą wziewną lub za pomocą innych metod zatwierdzonych przez instytucjonalną komisję etyczną (IACUC).

Część 2: Nekropsja i pobieranie okrężnicy

1. Odsłoń stronę brzuszną myszy i unieruchom kończyny, aby zapewnić niezakłócony dostęp do jamy brzusznej. Całkowicie zwilż brzuch 70% etanolem.
2. Chwyć linię pośrodkową brzucha pęsetą anatomiczną i pociągnij ku górze, napinając skórę. Używając nożyczek z cienkimi końcówkami, wykonaj nacięcie brzucha, odsłaniając jego zawartość. Przedłuż nacięcie do konca wyrostka mieczowatego w linii pośrodkowej, a następnie wzdłuż dolnej krawędzi łuków żebrowych obustronnie.
3. Zidentyfikuj jelito cienkie, kątnicę oraz jelito grube. Ostrożnie oddziel jelito grube od otaczającej je krezki. Przetnij jelito grube głęboko w miednicy, aby uwolnić końcowy odcinek jelita grubego i odbytnicę. Przetnij jelito grube na granicy kątniczo-okrężniczej, aby uwolnić proksymalny odcinek jelita grubego. Podczas tego procesu należy zachować szczególną ostrożność, aby nie uszkodzić jelita grubego, ponieważ w przypadku perforacji oczyszczanie jelita będzie problematyczne.
4. Używając igły do karmienia 20G i strzykawki 10 ml, wprowadź kaniulę i przepłucz jelito grube lodowatym PBS, aż eluat będzie całkowicie wolny od treści kałowej.
5. Na tym etapie, jeśli planowana jest analiza makroskopowa z użyciem mikroskopu sekcyjnego, jelita grube można utrwalić w formie „kiełbasek”. Jeśli wymagana jest wyłącznie analiza histologiczna, przejdź do Części 4 „Przygotowanie Swiss Rolls do analizy histologicznej ostrego zapalenia jelita grubego”.

Część 3: Przetwarzanie w formie „parówek” do analizy makroskopowej całego okrężnicy

1. Ważne jest zachowanie prawidłowej orientacji okrężnicy, dlatego należy trzymać jej koniec dystalny najbliżej operatora. Odciąć dwa kawałki nici niewchłanialnej (SP116 1.5 metric braided silk), jeden o długości około 1 cala, a drugi 2 cale.
2. Użyć 2-calowego kawałka nici, aby podwiązać koniec dystalny jak najbliżej marginesu, zachowując przy tym szczelność.
3. Wprowadzić igłę do karmienia 20G zawierającą 5 ml 10% buforowanego formaliny fosforanu do końca proksymalnego okrężnicy. Luźno zawiązać pozostały kawałek nici bezpośrednio proksymalnie względem kolby igły. Mocno chwycić okrężnicę w miejscu kolby igły i wstrzykiwać formalinę, aż okrężnica zostanie rozszerzona. Zaciągnąć węzeł nici podczas wycofywania igły, pozostawiając w ten sposób wypełnioną i rozszerzoną okrężnicę w formie „parówki”.
4. Napełnić stożkową probówkę 15 ml 10% buforowanym formaliny fosforanem i umieścić w niej okrężnicę. Fixować przez 24 godziny.
5. Odlać formalinę i zastąpić ją 70% EtOH na kolejne 24 godziny. (Okrężnice mogą być przechowywane w 70% EtOH w temperaturze pokojowej bezterminowo).
6. Wyjąć okrężnicę z probówki stożkowej i przeciąć nici na obu końcach skalpelem, uważając, aby nie uszkodzić tkanki. Należy pamiętać, że koniec dystalny ma najdłuższy kawałek nici. Przeciąć okrężnicę wzdłużnie od końca dystalnego do proksymalnego, tak aby utworzyła długi płat. Na tym etapie okrężnicę można oglądać pod mikroskopem stereoskopowym.

Część 4: Przygotowanie rolek szwajcarskich do analizy histologicznej ostrego zapalenia jelita grubego

1. Ważne jest zachowanie prawidłowej orientacji okrężnicy, dlatego należy umieścić jej koniec dystalny najbliżej operatora.
2. Zmierz długość jelita grubego. Parametr ten jest kolejnym wskaźnikiem ciężkości urazu. Zapalenie jelita grubego zwiększa obrzęk i skraca całkowitą długość jelita grubego.
3. Za pomocą nożyczek z cienkimi końcówkami wykonaj nacięcie wzdłużne od końca dystalnego do proksymalnego jelita grubego. Używając pęsety z cienkimi końcówkami, chwyć oba brzegi nacięcia i rozchyl je bocznie, przesuwając się w kierunku dystalnym.>proksymalnie, rozkładając w ten sposób okrężnicę w formie płaskiego arkusza.
4. Rolowanie okrężnicy wymaga użycia pary pincet oraz techniki dwuręcznej. Za pomocą pincety należy chwycić jedną z krawędzi marginesu dystalnego. Następnie należy sekwencyjnie rolować okrężnicę poprzez obracanie i puszczanie pincety, kierując się w stronę marginesu proksymalnego. W ten sposób powstanie spirala z trzecim wymiarem, tzw. „Swiss Roll” (rolada szwajcarska). Aby utrzymać formę zwiniętą, należy mocno chwycić rulon pincetą i przeciąć go igłą 27G 1/2. Igłę należy zabezpieczyć, zaginając ją w miejscu wyjścia z rulonu.
5. Umieść zwitek w odpowiednio oznakowanej kasecie do tkanek, a następnie przełóż go do słoika z 10% buforowanym formalorem fosforanowym w temperaturze pokojowej na 24 godziny, aby zapewnić utrwalenie tkanki.
6. Odlać formalinę i zastąpić ją 70% EtOH na kolejne 24 h. (Jelita grubie mogą być przechowywane w 70% EtOH w temperaturze pokojowej bezterminowo).
7. Po utrwaleniu próbkę można zalać parafiną, wykroić jej przekroje i nanieść na szkiełka przedmiotowe do analizy histologicznej.

Część 5: Reprezentatywne wyniki

Model DSS w ostrym zapaleniu jelita grubego umożliwia badaczowi pobranie, utrwalenie i analizę jelita grubego modelującego ten proces. Jeśli procedura „Swiss roll” zostanie wykonana prawidłowo, po rozcięciu i zamontowaniu próbki powinna ona tworzyć reprezentatywny przekrój całego jelita grubego (Rycina 1). Zamontowany zwój można barwić metodą H&E, aby określić zakres uszkodzeń jelita grubego, od końca dystalnego (wewnętrznego) do proksymalnego (zewnętrznego) (Rycina 2). Na preparacie „Swiss roll” można również przeprowadzić immunohistochemię w celu identyfikacji i ilościowego określenia nacieków zapalnych. Jeśli metoda „sausage” została wykonana prawidłowo, utrwalone jelito grubego będzie rozszerzone, a całą powierzchnię śluzówki będzie można łatwo manipulować i oglądać pod mikroskopem stereoskopowym (Rycina 3).

Rysunek 1. Poprawnie wykonana technika „szwajcarskiej rolki”. (A) Okrężnicę zwijano od końca dystalnego do proksymalnego, przecinano igłą i zabezpieczano poprzez zagięcie końcówki igły. Następnie umieszczano ją w kasecie tkankowej w celu utrwalenia. (B) Przekrój o grubości 5 μm barwiony H&E z „szwajcarskiej rolki” wykonanej z okrężnicy myszy traktowanej DSS (d= okrężnica dystalna p= okrężnica proksymalna).

Rycina 2. Jelita grube traktowane DSS wykazują oznaki ostrego zapalenia jelit. W porównaniu z kontrolą traktowaną wodą, w jelicie grubym traktowanym DSS widoczne są stan zapalny oraz uszkodzenia krypt.

Rycina 3. Przykład „kiełbaski”. Kiełbaska nasycona formaliną i całkowicie rozszerzona. Wystąpi niewielki kąt wynikający z naturalnego zakrzywienia okrężnicy. Rozcięta kiełbaska powinna leżeć płasko.

Dyskusja

Niniejszy protokół można zmodyfikować w celu modelowania procesów ostrego uszkodzenia, naprawy po uszkodzeniu lub przewlekłego uszkodzenia okólniczego.

Modyfikacja ostrego urazu:

leczenie DSS ad lib przez 4-6 dni, a następnie natychmiastowe uśmiercenie zwierząt

Modyfikacja procesu uszkodzenia i naprawy:

Wywołanie urazu poprzez podawanie DSS przez 4-6 dni, po czym następuje okres rekonwalescencji trwający 3-4 dni ...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Siarczan dekstranu sodowy	USB Corp., Affymetrix	9011-18-1	masa cząsteczkowa 40,000-50,000
10% buforowana formalina fosforanowa	Fisher Scientific	SF100-4
Izofluran, USP	Phoenix Pharmaceuticals, Inc.	NDC 57319-474-06
Kasety TISSUE PATH Macrosette	Fisher Scientific	15182706
Strzykawka BD 10 ml	BD Biosciences	309604
Alkohol etylowy	Pharmco-AAPER	E190	Rozcieńczyć do 70% wodą destylowaną
Prosta igła do żywienia 20G	VWR international	20068-612
Igła PrecisionGlide 27G1/2	BD Biosciences	305109
Nożyczki do sekcji z ostrym/tępym końcem	VWR international	82027-588
Pinceta Waugha	VWR international	82027-428
Niewchłanialna nić chirurgiczna	LOOK Surgical	SP116
Papier filtracyjny Whatman do blotowania	VWR international	28298-020	Dociąć według potrzeb
Filtr z octanu celulozy bez surfaktantów (SFCA) Nalgene	Cole-Parmer	EW-06731-2
Cyfrowy suwmiarka z kompozytu z włókna węglowego	Fisher Scientific	15-007-958