Method Article

Modelowanie mysiego zapalenia jelita grubego przy użyciu siarczanu dekstranu sodu (DSS)

DOI:

10.3791/1652

⸱

January 19th, 2010

 ,  , 
1Department of Cancer Biology, Vanderbilt University, 2Departments of Medicine and Cancer Biology, Vanderbilt University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Siarczan dekstranu sodu (DSS) podawany w wodzie pitnej jest uznanym modelem mysiego zapalenia zapalenia ostrego zapalenia jelita grubego. Protokół ten określa metodę leczenia DSS i przygotowania tkanek.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
Zapalenie jelita grubego może wystąpić w wyniku infekcji wirusowych lub bakteryjnych, uszkodzenia niedokrwiennego lub zaburzeń autoimmunologicznych; w szczególności wrzodziejące zapalenie jelita grubego i okrężnica odmiana choroby Leśniowskiego-Crohna - zapalenie jelita grubego-Crohna. Ostre zapalenie jelita grubego może objawiać się bólem brzucha i wzdęciami, złym wchłanianiem, biegunką, krwią i śluzem w stolcu. Zaczynamy rozumieć złożone interakcje między środowiskiem, genetyką i dysfunkcją bariery nabłonkowej w nieswoistym zapaleniu jelit, a zwierzęce modele zapalenia jelita grubego były niezbędne do pogłębienia naszego zrozumienia tej choroby. Jeden z popularnych modeli polega na uzupełnianiu wody pitnej myszy niskocząsteczkowym siarczanem sodu dekstranu (DSS), co powoduje uszkodzenie nabłonka i silną reakcję zapalną w okrężnicy trwającą kilka dni 1. Warianty tego podejścia można wykorzystać do modelowania ostrego urazu, ostrego urazu, po którym następuje naprawa, oraz powtarzających się cykli DSS przeplatanych modelowaniem powrotu do zdrowia w przewlekłych chorobach zapalnych 2. Po pojedynczym czterodniowym leczeniu 3% DSS w wodzie pitnej myszy wykazują oznaki ostrego zapalenia jelita grubego, w tym utratę wagi, krwawe stolce i biegunkę. Myszy są poddawane eutanazji po zakończeniu cyklu leczenia, a podczas sekcji zwłok wypreparowane okrężnice są przetwarzane i mogą być "zwijane po szwajcarsku" 3, aby umożliwić analizę mikroskopową całej okrężnicy lub podawane z formaliną jako "kiełbasy", aby umożliwić analizę makroskopową. Tkanka jest następnie zanurzana w parafinie, cięta i barwiona w celu przeglądu histologicznego.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Część 1: Model leczenia zapalenia jelita grubego

  1. Początkową masę ciała należy uzyskać dla każdej myszy przed rozpoczęciem leczenia DSS.
  2. Przygotować 3% (w/v) roztwór soli sodowej siarczanu dekstranu w wodzie i przefiltrować filtrem z octanu celulozy 0,45 μm.
  3. Zastąp wodę pitną w klatce dla myszy 3% roztworem DSS na cztery dni. Myszy nie powinny mieć dostępu do żadnego innego źródła wody (tj. końcówek wykluczających umieszczonych w automatycznych systemach pojenia).
  4. Czwartego dnia zastąp roztwór DSS wodą na dodatkowe trzy dni, co pozwoli na pewną regenerację nabłonka okrężnicy. Myszy należy zważyć w czwartym dniu w celu ilościowego określenia ogólnoustrojowych konsekwencji zapalenia jelita grubego. Utrata masy ciała jest powszechna w przypadku poważnych obrażeń.
  5. W 7 dniu zważ i poświęć myszy. Myszy mogą zostać poddane eutanazji przez wziewne przedawkowanie izofluranu lub inne metody zatwierdzone przez IACUC.

Część 2: Sekcja zwłok i pozyskiwanie jelita grubego

  1. Odsłoń brzuszną stronę myszy i zabezpiecz nogi, aby zapewnić swobodny dostęp do brzucha. Całkowicie zwilż brzuch 70% etanolem.
  2. Chwyć linię środkową brzucha kleszczami tkankowymi i wyciągnij do góry, napinając w ten sposób skórę. Użyj nożyczek z cienką końcówką, aby naciąć brzuch, odsłaniając w ten sposób zawartość brzucha. Przedłuż nacięcie do czubka wyrostka ksyloidalnego na linii środkowej, a następnie rozciągnij wzdłuż dolnej części brzegów żebrowych obustronnie.
  3. Zidentyfikuj jelito cienkie, jelito ślepe i okrężnicę. Ostrożnie wypreparuj/drażnij okrężnicę z otaczającej krezki. Przeciąć okrężnicę głęboko w miednicy, aby uwolnić dystalną okrężnicę i odbytnicę. Przeciąć okrężnicę na brzegu okrężnicy okrężnicy, aby uwolnić okrężnicę proksymalną. Podczas tego procesu należy zachować ostrożność, aby nie uszkodzić okrężnicy, ponieważ czyszczenie okrężnicy będzie problematyczne, jeśli dojdzie do perforacji.
  4. Używając igły do karmienia 20G i strzykawki o pojemności 10 ml, zaintubuj i przepłucz okrężnicę lodowatym PBS, aż eluat zostanie całkowicie usunięty ze stolca.
  5. W tym momencie, jeśli pożądana jest analiza makroskopowa za pomocą mikroskopu preparacyjnego, okrężnice można utrwalić jako "kiełbasy". Jeśli pożądana jest tylko analiza histologiczna, przejdź do części 4 "Wytwarzanie szwajcarskich bułek do analizy histologicznej ostrego zapalenia jelita grubego".

Część 3: Przetwarzanie jako "kiełbasy" do makroskopowej analizy całego jelita grubego

  1. Ważne jest, aby utrzymać prawidłową orientację jelita grubego, dlatego dystalny koniec okrężnicy powinien znajdować się najbliżej operatora. Wytnij dwa kawałki niewchłanialnego szwu (SP116 1,5 metrycznego plecionego jedwabiu), jeden o długości około 1 cala, drugi o długości 2 cali.
  2. Użyj 2-calowego kawałka szwu, aby związać dystalny koniec jak najbliżej brzegu, zachowując przy tym dobre uszczelnienie.
  3. Umieść igłę do karmienia o pojemności 20 g zawierającą 5 ml 10% buforowanego fosforanu formaliny w bliższym końcu okrężnicy. Luźno przywiąż pozostały kawałek szwu bezpośrednio proksymalnie do gruszki igły do karmienia. Chwyć mocno okrężnicę za gruszkę igły do karmienia i wlej formalinę, aż okrężnica się rozszerzy. Zaciśnij węzeł w szwie, wyjmując igłę do karmienia, pozostawiając w ten sposób zaparzoną, rozszerzoną okrężnicę jako "kiełbasę".
  4. Napełnij stożkową probówkę o pojemności 15 ml 10% buforowanym fosforanem formaliny i umieść okrężnicę w probówce. Napraw na 24 godziny.
  5. Odlej formalinę i zastąp 70% EtOH na dodatkowe 24 godziny. (Okrężnice mogą być przechowywane w 70% EtOH przez czas nieokreślony w temperaturze pokojowej.)
  6. Wyjmij okrężnicę ze stożkowej rurki i przetnij sznurki na każdym końcu skalpelem, uważając, aby nie uszkodzić okrężnicy. Pamiętaj, że dystalny koniec ma najdłuższy kawałek sznurka. Przeciąć wzdłużnie od dystalnego do bliższego końca okrężnicy, tak aby tworzyła długi arkusz. W tym momencie okrężnica może być oglądana pod mikroskopem preparacyjnym.

Część 4: Przygotowanie szwajcarskich bułeczek do analizy histologicznej ostrego zapalenia jelita grubego

  1. Ważne jest, aby utrzymać prawidłową orientację jelita grubego, dlatego dystalny koniec okrężnicy powinien znajdować się najbliżej operatora.
  2. Zmierz długość dwukropka. Ta metryka jest kolejnym wskaźnikiem ciężkości urazu. Zapalenie jelita grubego zwiększa obrzęk i skraca całkowitą długość jelita grubego.
  3. Za pomocą nożyczek z cienką końcówką naciąć wzdłużnie od dystalnego do bliższego końca okrężnicy. Użyj kleszczyków z cienką końcówką, aby chwycić dowolną krawędź nacięcia i otworzyć na boki, przesuwając się dystalnie >proksymalnie, wyświetlając w ten sposób okrężnicę jako płaski arkusz.
  4. Zwijanie okrężnicy wymaga pary kleszczy i techniki oburęcznej. Chwyć dowolną krawędź dystalnego brzegu za pomocą kleszczy. Przystąp do sekwencyjnego zwijania okrężnicy, obracając i zwalniając kleszcze idąc do bliższego brzegu. W ten sposób generowana jest spirala z trzecim wymiarem lub "Swiss Roll". Aby utrzymać zwiniętą formę, chwyć mocno rolkę kleszczami i przetnij ją igłą 27G1/2. Zabezpiecz igłę, zginając igłę podczas wychodzenia z rolki.
  5. Umieść rolkę w odpowiednio oznakowanej kasecie na chusteczki i umieść w słoiku z 10% buforowanym fosforanem formaliny w temperaturze pokojowej na 24 godziny, aby zapewnić utrwalenie tkanek.
  6. Odlej formalinę i zastąp 70% EtOH na dodatkowe 24 godziny. (Okrężnice mogą być przechowywane w 70% EtOH przez czas nieokreślony w temperaturze pokojowej.)
  7. Po utrwaleniu próbki można ją zatopić w parafinie, podzielić na sekcje i zamontować na szkiełkach w celu analizy histologicznej.

Część 5: Reprezentatywne wyniki

Model DSS dla ostrego zapalenia jelita grubego pozwala badaczowi uzyskać, naprawić i przeanalizować okrężnicę, która modeluje ostre zapalenie jelita grubego. Kiedy szwajcarska bułka jest cięta i montowana, powinna tworzyć reprezentatywny wycinek całej okrężnicy, jeśli jest prawidłowo zwinięta (ryc. 1). Zamontowaną rolkę można wybarwić środkiem H&E w celu określenia zakresu uszkodzenia jelita grubego, od dystalnego (wewnętrznego) końca do bliższego (zewnętrznego) końca (ryc. 2). Immunohistochemię można również przeprowadzić na szwajcarskiej rolce w celu identyfikacji i ilościowego określenia nacieków zapalnych. Jeśli metoda kiełbasy została wykonana prawidłowo, nieruchoma okrężnica zostanie rozszerzona, a cała powierzchnia błony śluzowej może być łatwo manipulowana i oglądana pod mikroskopem preparacyjnym (ryc. 3).

figure-protocol-1
Rysunek 1. Prawidłowo wykonana "szwajcarska bułka". (A) Okrężnica jest zwijana od dystalnego do bliższego końca, przecięta igłą i zabezpieczona przez zgięcie końca igły. Następnie umieszcza się go w kasecie na tkanki w celu utrwalenia. (B) H&E barwiony 5 μm odcinek szwajcarskiej rolki wykonanej z okrężnicy myszy leczonej DSS (d = dystalna okrężnica p = bliższa okrężnica).

figure-protocol-2
Rysunek 2. Okrężnice leczone DSS wykazują oznaki ostrego zapalenia jelita grubego. Stan zapalny i uszkodzenie krypty są widoczne w okrężnicy leczonej DSS w porównaniu z kontrolą traktowaną wodą.

figure-protocol-3
Rysunek 3. Przykład "kiełbasy". Kiełbasa nasączona formaliną i całkowicie rozprężona. Niewielki kąt będzie obecny wtórnie do naturalnej krzywizny okrężnicy. Otwarta kiełbasa powinna leżeć płasko.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół ten można zmodyfikować w celu modelowania procesów ostrego urazu, naprawy urazów lub przewlekłych uszkodzeń okrężnicy.

Modyfikacja ostrego urazu:

Leczenie DSS ad lib przez 4-6 dni, po którym następuje natychmiastowa ofiara

Modyfikacja naprawy urazów:

Uraz po 4-6 dniach leczenia DSS, po którym następuje okres rekonwalescencji trwający 3-4 dni i poświęcenie (jak opisano w powyższym protokole).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Eksperymenty na zwierzętach przeprowadzono zgodnie z wytycznymi i przepisami określonymi przez Vanderbilt IACUC.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Finansowanie zapewnione przez NIH (1 K08 DK080221-01) i fundusze rozwoju instytucjonalnego Vanderbilt.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Siarczan dekstranu Sól sodowaUSB Corp., Affymetrix9011-18-1mol wt 40 000-50 000
10% buforowany fosforan formalinyFisher ScientificSF100-4
Isofluran, USPPhoenix Pharmaceuticals, Inc.NDC 57319-474-06
ŚCIEŻKA TKANKOWA Kasety makrosetteFisher Scientific 15182706
BD 10 ml StrzykawkaBD Biosciences309604
Alkohol etylowyPharmco-AAPERE190Rozcieńczony do 70% wodą destylowaną
Igła prosta 20GVWR international20068-612
Igła PrecisionGlide 27G1/2BD Biosciences305109
Nożyczki preparacyjne Ostra/końcówkaVWR international82027-588
Kleszcze WaughVWR international82027-428
Niewchłanialny szew LOOK SurgicalSP116
Whatman Bibuła do bibułyVWR international28298-020Wytnij w razie potrzeby
Bez środków powierzchniowo czynnych Nalgene Filtr z octanu celulozy (SFCA)Cole-ParmerEW-06731-2
Suwmiarka cyfrowa z kompozytów z włókna węglowegoFisher Scientific15-007-958

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Okayasu, I. A novel method in the induction of reliable experimental acute and chronic ulcerative colitis in mice. Gastroenterology. 98 (3), 694-702 (1990).
  2. Martinez, J. A. Deletion of Mtgr1 sensitizes the colonic epithelium to dextran sodium sulfate-induced colitis. Gastroenterology. 131 (2), 579-588 (2006).
  3. Moolenbeek, C., Ruitenberg, E. J. The "Swiss roll": a simple technique for histological studies of the rodent intestine. Lab Anim. 15 (1), 57-59 (1981).
  4. Mahler, M. Differential susceptibility of inbred mouse strains to dextran sulfate sodium-induced colitis. Am J Physiol. 274, G544-551 (1998).
  5. Aharoni, R. Immunomodulatory therapeutic effect of glatiramer acetate on several murine models of inflammatory bowel disease. J Pharmacol Exp Ther. 318 (1), 68-78 (2006).
  6. Hahm, K. B. Loss of transforming growth factor beta signalling in the intestine contributes to tissue injury in inflammatory bowel disease. Gut. 49 (2), 190-198 (2001).
  7. Green, B. T. Adrenergic modulation of Escherichia coli O157:H7 adherence to the colonic mucosa. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 287 (6), G1238-1246 (2004).
  8. Dieleman, L. A. Chronic experimental colitis induced by dextran sulphate sodium (DSS) is characterized by Th1 and Th2 cytokines. Clin Exp Immunol. 114 (3), 385-391 (1998).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Dextran Sulfate SodiumMurine Colitis ModelColon HarvestingSwiss Roll TechniqueSausage PreparationFormalin FixationParaffin EmbeddingHistologic AnalysisMacroscopic AnalysisWeight Loss Measurement

Related Articles