Przedstawiono metodę izolacji specyficznych typów komórek z materiału roślinnego. Technika ta wykorzystuje transgeniczne linie markerowe wykazujące ekspresję białek fluorescencyjnych w określonych typach komórek, dysocjację komórkową oraz sortowanie komórek aktywowane fluorescencją (FACS). Dodatkowo opracowano układ hodowlany, który umożliwia poddanie siewek Arabidopsis thaliana obróbce przed sortowaniem komórek.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Sortowanie komórek protoplastów roślinnych metodą fluorescencyjnej aktywacji (FACS)
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Analiza ekspresji genów o wysokiej rozdzielczości, specyficzna dla danego typu komórek, znacznie zwiększa zrozumienie regulacji rozwojowej oraz reakcji na bodźce środowiskowe w każdym organizmie wielokomórkowym. Hybrydyzacja in situ oraz wizualizacja genów reporterowych mogą być w ograniczonym stopniu wykorzystywane w tym celu, jednak w przypadku ilościowego RT-PCR o wysokiej rozdzielczości lub wysokoprzepustowej analizy całego transkryptomu niezbędna jest izolacja RNA z konkretnych typów komórek. Dysocjacja komórkowa tkanki wykazującej ekspresję fluorescencyjnego białka markerowego w specyficznym typie komórek i następująca po niej fluorescencyjna aktywowana sortownia komórek (FACS) umożliwiają zebranie wystarczającej ilości materiału do ekstrakcji RNA, syntezy/amplifikacji cDNA oraz analizy mikromacierzy.
Dla społeczności badawczej roślin dostępny jest szeroki zestaw linii reporterowych fluorescencyjnych specyficznych dla danego typu komórek. W tym przypadku wykorzystano dwie linie markerowe korzenia Arabidopsis thaliana: PSCR::GFP (endodermis i centrum spoczynkowe) oraz PWOX5::GFP (centrum spoczynkowe). Duża liczba (tysiące) siewek jest hodowana hydroponicznie lub na płytkach z agarem, a następnie zbierana w celu uzyskania wystarczającej ilości materiału korzeniowego do dalszych analiz. Dysocjację komórkową materiału roślinnego osiąga się poprzez enzymatyczne trawienie ściany komórkowej. Procedura ta wykorzystuje plazmolizę indukowaną wysoką osmolarnością oraz dostępne komercyjnie celulazy, pektynazy i hemicelulazy w celu uwolnienia protoplastów do roztworu.
FACS komórek GFP-dodatnich wykorzystuje wizualizację widm emisji zielonej względem czerwonej protoplastów wzbudzonych laserem 488 nm. Protoplasty GFP-dodatnie można rozpoznać po zwiększonym stosunku emisji zielonej do czerwonej. Protoplasty są zazwyczaj sortowane bezpośrednio do buforu do ekstrakcji RNA i przechowywane do dalszej obróbki w późniejszym czasie.
Wykazano, że technika ta jest prosta i praktyczna. Ponadto udowodniono, że można ją bez trudności wykorzystać do izolacji wystarczającej liczby komórek do analizy transkryptomu, nawet w przypadku bardzo rzadkich typów komórek (np. komórek centrum spoczynkowego). Na koniec zaprezentowano układ do hodowli siewek Arabidopsis, który umożliwia nieskomplikowaną obróbkę roślin przed sortowaniem komórek (np. do analizy odpowiedzi na stres biotyczny lub abiotyczny specyficznej dla danego typu komórek). Omówiono potencjalne dodatkowe zastosowania FACS dla protoplastów roślinnych.
Protokół
1) Przygotowanie materiału roślinnego
- Protoplasty mogą być pozyskiwane z wielu różnych gatunków i tkanek roślinnych, pod warunkiem zastosowania odpowiedniej mieszaniny enzymów trawiących ścianę komórkową1. Przed przystąpieniem do pełnoskalowego eksperymentu zaleca się przeprowadzenie trawienia materiału w małej skali w celu oceny wydajności izolacji protoplastów z danej tkanki, działania enzymów itp. oraz oszacowania odsetka komórek pozytywnych do sortowania komórek. W niniejszej procedurze wykorzystano protoplasty pochodzące z korzeni siewek Arabidopsis thaliana, które wykazują specyficzną dla typu komórek ekspresję zielonego białk....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Protoplasty mogą, w zasadzie, być pozyskiwane z różnych tkanek roślinnych; optymalizacja sprzyjających warunków znacznie poprawi jakość i ilość RNA. Aspekt ten będzie zależał zarówno od zastosowanego roztworu do izolacji protoplastów, jak i od wybranego buforu inkubacyjnego.
W zależności od możliwości zastosowanego systemu FACS można użyć wielu różnych białek fluorescencyjnych, np. GFP, RFP, YFP, CFP lub ich licznych wariantów i pochodnych. Ekspresja markerów może być sterowana nie t.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Podziękowania
Praca ta była wspierana przez National Science Foundation (grant nr DBI 0519984) oraz National Institutes of Health (grant nr 5R01GM078279)..
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| 250 μsiatka nylonowa m | Filtracja Sefar | NITEX 03-250/50 | |
| 100 μsiatka nylonowa m | Filtracja Sefar | NITEX 03-100/47 | |
| Kwadratowe szalki Petriego | Fisher Scientific | 08-757-10k | |
| Phytatacki | Sigma-Aldrich | P1552 | |
| Podłoże podstawowe Murashige i Skooga (MS) | Sigma-Aldrich | M5519 | |
| sacharoza | Fisher Scientific | S5-3 | |
| MES | Sigma-Aldrich | M2933 | |
| KOH | Sigma-Aldrich | P1767 | stężenie zapasowe 10 M |
| mikroskop Eclipse 90i | Nikon Instruments | ||
| Celulaza R-10 | Yakult Pharmaceutical | ||
| Macerozyme R-10 | Yakult Pharmaceutical | ||
| D-mannitol | Sigma-Aldrich | M9546 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P8041 | roztwór stokowy 1 M |
| BSA | Sigma-Aldrich | A3912 | |
| β-merkapto–etanol | Calbiochem | 444203 | |
| CaCl22 | Sigma-Aldrich | C2536 | roztwór zapasowy 1 M |
| inkubator wytrząsowy | Instrumenty Labline | ||
| 40 μsitko do komórek m | BD Biosciences | 352340 | |
| probówki stożkowe 15 ml | BD Biosciences | 352196 | |
| wirówka stołowa | Sorvall, Thermo Scientific | Legenda RT | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S3014 | |
| FACSAria | BD Biosciences | ||
| probówki do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml | VWR international | 20170-38 | |
| zestaw RNeasy micro | Qiagen | 74004 | |
| System amplifikacji RNA WT-Ovation Pico | NuGEN | 3300_12 | |
| Moduł biotynowania cDNA FL-Ovation cDNA Biotin Module V2 | NuGEN | 4200_12 |
Bibliografia
- Sheen, J. Signal transduction in maize and Arabidopsis mesophyll protoplasts. Plant Physiol. 127, 1466-1475 (2001).
- Wysocka-Diller, J. W., Helariutta, Y., Fukaki, H., Malamy, J. E., Benfey, P. N. Molecular analysis of SCARECROW function reveals a r....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
