Przedstawiono metodę izolacji specyficznych typów komórek z materiału roślinnego. Technika ta wykorzystuje transgeniczne linie markerowe wykazujące ekspresję białek fluorescencyjnych w określonych typach komórek, dysocjację komórkową oraz sortowanie komórek aktywowane fluorescencją (FACS). Dodatkowo opracowano układ hodowlany, który umożliwia poddanie siewek Arabidopsis thaliana obróbce przed sortowaniem komórek.
Artykuł metodologiczny
Sortowanie komórek protoplastów roślinnych metodą fluorescencyjnej aktywacji (FACS)
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Analiza ekspresji genów o wysokiej rozdzielczości, specyficzna dla danego typu komórek, znacznie zwiększa zrozumienie regulacji rozwojowej oraz reakcji na bodźce środowiskowe w każdym organizmie wielokomórkowym. Hybrydyzacja in situ oraz wizualizacja genów reporterowych mogą być w ograniczonym stopniu wykorzystywane w tym celu, jednak w przypadku ilościowego RT-PCR o wysokiej rozdzielczości lub wysokoprzepustowej analizy całego transkryptomu niezbędna jest izolacja RNA z konkretnych typów komórek. Dysocjacja komórkowa tkanki wykazującej ekspresję fluorescencyjnego białka markerowego w specyficznym typie komórek i następująca po niej fluorescencyjna aktywowana sortownia komórek (FACS) umożliwiają zebranie wystarczającej ilości materiału do ekstrakcji RNA, syntezy/amplifikacji cDNA oraz analizy mikromacierzy.
Dla społeczności badawczej roślin dostępny jest szeroki zestaw linii reporterowych fluorescencyjnych specyficznych dla danego typu komórek. W tym przypadku wykorzystano dwie linie markerowe korzenia Arabidopsis thaliana: PSCR::GFP (endodermis i centrum spoczynkowe) oraz PWOX5::GFP (centrum spoczynkowe). Duża liczba (tysiące) siewek jest hodowana hydroponicznie lub na płytkach z agarem, a następnie zbierana w celu uzyskania wystarczającej ilości materiału korzeniowego do dalszych analiz. Dysocjację komórkową materiału roślinnego osiąga się poprzez enzymatyczne trawienie ściany komórkowej. Procedura ta wykorzystuje plazmolizę indukowaną wysoką osmolarnością oraz dostępne komercyjnie celulazy, pektynazy i hemicelulazy w celu uwolnienia protoplastów do roztworu.
FACS komórek GFP-dodatnich wykorzystuje wizualizację widm emisji zielonej względem czerwonej protoplastów wzbudzonych laserem 488 nm. Protoplasty GFP-dodatnie można rozpoznać po zwiększonym stosunku emisji zielonej do czerwonej. Protoplasty są zazwyczaj sortowane bezpośrednio do buforu do ekstrakcji RNA i przechowywane do dalszej obróbki w późniejszym czasie.
Wykazano, że technika ta jest prosta i praktyczna. Ponadto udowodniono, że można ją bez trudności wykorzystać do izolacji wystarczającej liczby komórek do analizy transkryptomu, nawet w przypadku bardzo rzadkich typów komórek (np. komórek centrum spoczynkowego). Na koniec zaprezentowano układ do hodowli siewek Arabidopsis, który umożliwia nieskomplikowaną obróbkę roślin przed sortowaniem komórek (np. do analizy odpowiedzi na stres biotyczny lub abiotyczny specyficznej dla danego typu komórek). Omówiono potencjalne dodatkowe zastosowania FACS dla protoplastów roślinnych.
Protokół
1) Przygotowanie materiału roślinnego
- Protoplasty mogą być pozyskiwane z wielu różnych gatunków i tkanek roślinnych, pod warunkiem zastosowania odpowiedniej mieszaniny enzymów trawiących ścianę komórkową1. Przed przystąpieniem do pełnoskalowego eksperymentu zaleca się przeprowadzenie trawienia materiału w małej skali w celu oceny wydajności izolacji protoplastów z danej tkanki, działania enzymów itp. oraz oszacowania odsetka komórek pozytywnych do sortowania komórek. W niniejszej procedurze wykorzystano protoplasty pochodzące z korzeni siewek Arabidopsis thaliana, które wykazują specyficzną dla typu komórek ekspresję zielonego białka fluorescencyjnego (GFP). Endoderma i centrum spoczynkowe są znakowane markerem PSCR::GFP, a centrum spoczynkowe dodatkowo markerem PWOX5::GFP2,3 (Rysunek 1).
- Siewki są hodowane hydroponicznie w tacekach fitacyjnych (Sigma; Rysunek 2a) na filtrze nylonowym (siatka 250 μm; NITEX), który umożliwia przerastanie korzeni do pożywki wzrostowej (0,22% w/v podstawowa pożywka Murashige i Skoog [Sigma], 1% w/v sacharozy, 0,05% w/v MES [kwas 2-(N-morfolino)etanosulfonowy], pH 5,7 skorygowane KOH). Alternatywnie rośliny można hodować na powierzchni filtra nylonowego (siatka 100 μm) na pionowo ustawionych płytkach z 1% agarem (Rysunek 2b).
- Zastosowanie wyżej wymienionych filtrów nie tylko ułatwia zbiór korzeni, ale także umożliwia łatwe przeprowadzenie dodatkowych zabiegów z siewkami, jeśli jest to wymagane. Filtry pozwalają na transfer siewek en masse do nowych tacek fitacyjnych lub na płytki z agarem uzupełnione o interesujący badacza katalizator. Przykładowo, system z tackami fitacyjnymi był wykorzystywany do specyficznej dla typu komórek analizy odpowiedzi transkrypcyjnej na traktowanie azotem u siewek Arabidopsis4.
- Należy mikroskopowo upewnić się, że marker fluorescencyjny jest prawidłowo ekspresowany (szczególnie w przypadku stosowania traktowania, ponieważ same markery specyficzne dla typu komórek mogą być pod wpływem zabiegu). W tym przypadku siewki są oglądane pod mikroskopem fluorescencyjnym (Nikon; Rysunek 1). Należy pamiętać, że linie z fluorescencyjnymi markerami specyficznymi dla typu komórek powinny zostać wstępnie scharakteryzowane pod mikroskopem konfokalnym, aby dokładnie określić, które typy komórek są znakowane oraz ustalić zmienność w ekspresji.
2) Przygotowanie roztworu do protoplastyzacji
- Rozpuścić 1,25% w/v Celulazy (Yakult), 0,3% w/v Macerozymu (Yakult), 0,4 M D-mannitolu, 20 mM MES oraz 20 mM KCl (z roztworu stokowego 1 M) w wodzie zdemineralizowanej i dostosować pH do 5,7 za pomocą 1 M Tris/HCl pH 7,5. Roztwór ten będzie lekko mętny.
- Podgrzać roztwór do 55° C przez 10 minut (roztwór stanie się klarowny) i pozwolić mu ostygnąć do temperatury pokojowej przed dodaniem 0,1% w/v BSA (albuminy surowicy bydlęcej), 10 mM CaCl2 oraz 5 mM β-merkaptoetanolu.
3) Zbiór i protoplastyzacja materiału roślinnego
- Korzenie są zbierane poprzez zeskrobanie ich ze skalpela z nylonowej siatki i przeniesione do kolby zawierającej roztwór do protoplastowania. Zazwyczaj na 1500 korzeni siewek stosuje się 10 ml roztworu do protoplastowania.
- Kolby należy delikatnie wstrząsać (75 rpm) w temperaturze pokojowej przez jedną godzinę. Dłuższy czas inkubacji może zwiększyć wydajność protoplastów, ale wzmocni również wpływ samego procesu protoplastowania na ekspresję genów.
- Roztwór protoplastów należy przefiltrować przez sitko komórkowe 40 μm (BD Falcon) i rozdzielić do stożkowych probówek 15 ml (BD Falcon).
- Probówki wiruje się w wirówce z koszykiem wahadłowym przez 10 minut przy 500 G. Należy pamiętać, że prędkość wirowania zależy od rodzaju użytych protoplastów, ich delikatności oraz ilości debris komórkowego powstałego podczas obróbki enzymatycznej.
- Należy usunąć większość supernatantu, resuspender protoplasty w pozostałym roztworze i ocenić je mikroskopowo (Rysunek 3).
- Używa się komory countingowej (hemocytometru) do oszacowania liczby i gęstości protoplastów. Gęstość komórek określi prędkość wstrzykiwania próbki, liczbę zdarzeń na sekundę, a tym samym całkowity czas potrzebny do sortowania komórek w systemie FACS (patrz również sekcja 4.3).
- 3.7) Można przejść bezpośrednio do FACS lub przemyć i resuspender protoplasty w roztworze inkubacyjnym, takim jak W5 (154 mM NaCl, 125 mM CaCl2, 5 mM KCl, 5 mM MES, pH dostosowane do 5,7 za pomocą KOH) lub w roztworze do protoplastowania bez dodatku enzymów. Szczególnie przy badaniu zmian transkrypcyjnych ważne jest zminimalizowanie ekspozycji próbek na warunki, które mogą wpływać na ekspresję genów, takie jak zmiana buforu, w którym przechowywane są protoplasty. Zaleca się zatem utrzymywanie protoplastów w roztworze do protoplastowania i jak najszybsze przystąpienie do FACS.
4) Sortowanie protoplastów za pomocą fluorescencyjnie aktywowanego sortowania komórek (FACS)
- Włącz i przygotuj sorter komórkowy. W tym przypadku użyto urządzenia FACSAria (BD).
- Ustaw strumień przepływu z dyszą 100 μm i ciśnieniem osłonki 20 psi.
- Gęstość komórek i prędkość wtryskiwania próbki można dostosować do konkretnego eksperymentu w zależności od tego, czy pożądana jest maksymalna wydajność, czy najszybsza możliwa prędkość. Pomyślnie przeprowadzono sortowanie przy gęstościach do 10 000 000 komórek/ml.
- Użyj opcji mieszania próbki w FACS, aby zapobiec sedymentacji protoplastów. Jeśli wystąpi problem z zatykaniem urządzenia FACS, można podjąć trzy kroki naprawcze: 1. Wykonaj płukanie wsteczne linii próbki. 2. Rozcieńcz zawiesinę protoplastów, aby zmniejszyć gęstość. 3. Oczyść roztwór protoplastów, powtarzając etap filtracji (3.3) po wirowaniu i resuspensji.
- Przygotuj aparat do pomiaru rozproszenia przedniego (FSC), rozproszenia bocznego (SSC) oraz emisji przy 530/30 nm dla GFP i 610/20 nm dla autofluorescencji widma czerwonego (RSA) po wzbudzeniu laserem 488 nm. Są to w zasadzie jedyne parametry używane do izolacji protoplastów GFP-dodatnich. W tym przypadku ustawienia napięcia były następujące: FSC – 60V, SSC – 250V, GFP – 350V oraz RSA – 335V. Należy pamiętać, że optymalne ustawienia napięcia będą się różnić dla każdego urządzenia FACS i będą wymagały korekty w całym okresie eksploatacji sortera komórkowego.
- Zacznij od ustawienia wykresu kropkowego (dot plot) dla rozproszenia przedniego względem rozproszenia bocznego. Zastosuj ustawienia napięcia tak, aby mierzone zdarzenia znajdowały się w centrum wykresu.
- Następnie utwórz wykres kropkowy sygnałów fluorescencji zielonej względem czerwonej. Zastosuj ustawienia napięcia tak, aby w przypadku zawiesiny protoplastów typu dzikiego (non-GFP) mierzone zdarzenia tworzyły centryczną populację diagonalną na wykresie. Zawiesina protoplastów pochodząca z linii markerowej GFP wykaże wyraźną populację zdarzeń fluorescencyjnych w kolorze zielonym, których nigdy nie obserwuje się w próbkach typu dzikiego.
- Ustaw parametry kompensacji, aby skorygować nakładanie się widm GFP i RSA. Odpowiednie ustawienia kompensacji pozwolą na lepszą separację protoplastów GFP-dodatnich od protoplastów non-GFP oraz debris. Zastosowano następujące wartości kompensacji: RSA, minus 17,91% GFP.
- Ustaw bramkę (gate) w celu identyfikacji zdarzeń GFP-dodatnich; do pomocy w zdefiniowaniu granic bramki należy użyć kontroli negatywnej z protoplastami non-GFP (Rycina 4).
- Wprowadź odcięcie (cutoff) dla rozproszenia przedniego, aby wykluczyć drobne debris z analizy. Zwizualizuj zdarzenia GFP-dodatnie na wykresie FSC vs. SSC, aby pomóc w określeniu miejsca odcięcia. W tym przypadku odcięcie ustawiono na 5 000. Należy pamiętać, że FACS zlicza debris jako zdarzenia sortowane, a próbka o wysokim poziomie debris może wykazać inny procent zdarzeń GFP-dodatnich niż oczekiwano. Niekoniecznie jest to problem, jednak im więcej debris w próbce, tym dłużej potrwa sortowanie.
- W zależności od eksperymentu i liczebności analizowanego typu komórek, ustaw tryb precyzji FACS na optymalną wydajność lub optymalną czystość sortowanych komórek.
- Do ekstrakcji RNA przygotuj probówki do zbierania (probówki mikrocentryfugowe 1,5 ml) z odpowiednią ilością buforu do ekstrakcji RNA. Przy tej konfiguracji 20 000 zdarzeń sortowanych da łączną objętość około 100 μl, które zostały zsortowane do 350 μl buforu ekstrakcyjnego (RNeasy micro kit, QIAGEN). Wymieszaj próbki po zakończeniu sortowania, ponieważ zawiesina komórkowa może gromadzić się u góry.
- Przechowuj próbki lub przejdź bezpośrednio do ekstrakcji RNA. Pomyślne analizy mikroarray przeprowadzono z RNA wyekstrahowanym z zaledwie 500 posortowanych zdarzeń. W tym przypadku użyto zestawu do mikroekstrakcji RNeasy (QIAGEN), systemu amplifikacji RNA WT-Ovation Pico oraz modułu cDNA Biotin V2 FL-Ovation (NuGEN).
Reprezentatywne wyniki
Jedna taca z około 1 500 tygodniowymi siewkami PSCR::GFP dostarczyła około 60 000 protoplastów (zliczonych za pomocą hemacytometru). Za GFP-dodatnie uznano i posortowano 2,6% z 65 000 zdarzeń przetworzonych przez FACS (Rycina 4b).
Osiem płytek, z których każda zawierała około 1 500 czterodniowych siewek PWOX5::GFP (łącznie 12 000), dostarczyło około 30 000 000 protoplastów (zmierzone za pomocą hemacytometru). 0,063% z 16 000 000 zdarzeń analizowanych metodą FACS zdefiniowano jako GFP-dodatnie i poddano sortowaniu (Rycina 4c).
Do ekstrakcji RNA zazwyczaj wykorzystuje się 10 000 posortowanych zdarzeń, co może przynieść od 20 do 140 ng całkowitego RNA (Rysunek 5).
Rycina 1. Linie markerowe GFP specyficzne dla typów komórek w korzeniu Arabidopsis. Obrazy z mikroskopii fluorescencyjnej wykonano przy użyciu kontrastu różnicowego (DIC) oraz filtra GFP na mikroskopie Eclipse 90i (Nikon) z oprogramowaniem Metamorph (Molecular Devices). Obrazy DIC i GFP nałożono na siebie w celu wizualizacji. Przedstawiono dwie linie markerowe wykorzystane w tym doświadczeniu wizualnym: a) PSCR::GFP oraz b) PWOX5::GFP.
Rycina 2. Warunki wzrostu roślin. Siewki były hodowane w komorze klimatycznej hydroponicznie w tacy do hodowli roślin (a) lub na pionowo ustawionych szalkach z agarem (b).
Rysunek 3. Protoplasty roślinne wykazujące ekspresję GFP. Obrazy z mikroskopii fluorescencyjnej wykonano przy użyciu kontrastu interferencyjnego (DIC) i filtra GFP na mikroskopie Eclipse 90i (Nikon) z wykorzystaniem oprogramowania Metamorph (Molecular Devices). Obrazy DIC i GFP zostały nałożone na siebie w celu wizualizacji. Strzałki wskazują pękniętą komórkę, debris komórkowy oraz protoplast dodatni pod kątem GFP. Odległość między dwiema białymi liniami wynosi 50 μm.
Rycina 4. Sortowanie komórek aktywowane fluorescencją protoplastów pozytywnych pod kątem GFP. Protoplasty pochodzące z typu dzikiego (a), linii markerowej PSCR::GFP (b) lub PWOX5::GFP (c) zostały przeanalizowane i posortowane za pomocą urządzenia FACSAria (BD) z wykorzystaniem bram definiowanych na wykresie kropkowym fluorescencji zielonej (530/30 nm; oś x) względem czerwonej (610/20 nm; oś y). Na każdym wykresie przedstawiono 100 000 zdarzeń. Zdarzenia mieszczące się w bramie sortowania GFP są wyróżnione na zielono.
Rysunek 5. Reprezentatywne ekstrakcje RNA z 10 000 posortowanych komórek. Komórki sortowano bezpośrednio do buforu do ekstrakcji RNA (QIAGEN), a następnie oczyszczono RNA i sprawdzono jego stężenie, czystość oraz integralność za pomocą analizatora 2100 Bioanalyzer (Agilent). Przedstawiono trzy powtórzenia dla obu linii markerowych.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Protoplasty mogą, w zasadzie, być pozyskiwane z różnych tkanek roślinnych; optymalizacja sprzyjających warunków znacznie poprawi jakość i ilość RNA. Aspekt ten będzie zależał zarówno od zastosowanego roztworu do izolacji protoplastów, jak i od wybranego buforu inkubacyjnego.
W zależności od możliwości zastosowanego systemu FACS można użyć wielu różnych białek fluorescencyjnych, np. GFP, RFP, YFP, CFP lub ich licznych wariantów i pochodnych. Ekspresja markerów może być sterowana nie t...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Podziękowania
Praca ta była wspierana przez National Science Foundation (grant nr DBI 0519984) oraz National Institutes of Health (grant nr 5R01GM078279)..
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| 250 μsiatka nylonowa m | Filtracja Sefar | NITEX 03-250/50 | |
| 100 μsiatka nylonowa m | Filtracja Sefar | NITEX 03-100/47 | |
| Kwadratowe szalki Petriego | Fisher Scientific | 08-757-10k | |
| Phytatacki | Sigma-Aldrich | P1552 | |
| Podłoże podstawowe Murashige i Skooga (MS) | Sigma-Aldrich | M5519 | |
| sacharoza | Fisher Scientific | S5-3 | |
| MES | Sigma-Aldrich | M2933 | |
| KOH | Sigma-Aldrich | P1767 | stężenie zapasowe 10 M |
| mikroskop Eclipse 90i | Nikon Instruments | ||
| Celulaza R-10 | Yakult Pharmaceutical | ||
| Macerozyme R-10 | Yakult Pharmaceutical | ||
| D-mannitol | Sigma-Aldrich | M9546 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P8041 | roztwór stokowy 1 M |
| BSA | Sigma-Aldrich | A3912 | |
| β-merkapto–etanol | Calbiochem | 444203 | |
| CaCl22 | Sigma-Aldrich | C2536 | roztwór zapasowy 1 M |
| inkubator wytrząsowy | Instrumenty Labline | ||
| 40 μsitko do komórek m | BD Biosciences | 352340 | |
| probówki stożkowe 15 ml | BD Biosciences | 352196 | |
| wirówka stołowa | Sorvall, Thermo Scientific | Legenda RT | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S3014 | |
| FACSAria | BD Biosciences | ||
| probówki do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml | VWR international | 20170-38 | |
| zestaw RNeasy micro | Qiagen | 74004 | |
| System amplifikacji RNA WT-Ovation Pico | NuGEN | 3300_12 | |
| Moduł biotynowania cDNA FL-Ovation cDNA Biotin Module V2 | NuGEN | 4200_12 |
Bibliografia
- Sheen, J. Signal transduction in maize and Arabidopsis mesophyll protoplasts. Plant Physiol. 127, 1466-1475 (2001).
- Wysocka-Diller, J. W., Helariutta, Y., Fukaki, H., Malamy, J. E., Benfey, P. N. Molecular analysis of SCARECROW function reveals a radial patterning mechanism common to root and shoot. Development. 127, 595-603 (2000).
- Blilou, I., Xu, J., Wildwater, M., Willemsen, V., Paponov, I., Friml, J., Heidstra, R., Aida, M., Palme, K., Scheres, B. The PIN auxin efflux facilitator network controls growth and patterning in Arabidopsis roots. Nature. 433, 39-44 (2005).
- Gifford, M. L., Dean, A., Gutierrez, R. A., Coruzzi, G. M., Birnbaum, K. D. Cell-specific nitrogen responses mediate developmental plasticity. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 803-808 (2008).
- Bargmann, B. O. R., Birnbaum, K. D. Positive fluorescent selection permits precise, rapid, and in-depth overexpression analysis in plant protoplasts. Plant Physiol. 149, 1231-1239 (2009).
- Petersson, S. V., Johansson, A. I., Kowalczyk, M., Makoveychuk, A., Wang, J. Y., Moritz, T., Grebe, M., Benfey, P. N., Sandberg, G., Ljung, K. An Auxin Gradient and Maximum in the Arabidopsis Root Apex Shown by High-Resolution Cell-Specific Analysis of IAA Distribution and Synthesis. Plant Cell. 21, 1659-1668 (2009).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE
Poproś o pozwolenie