Synapsy glutaminergiczne mogą przełączać się z trybu aktywnego w tryb cichy. Wykazujemy, że status aktywności presynaptycznej w dysocjowanej kulturze neuronów gryzoni można zwizualizować, wykorzystując utrwalalną formę barwnika FM1-43 do obrazowania synaps aktywnych oraz immunobarwienie przeciwciałami przeciwko vGluT-1 w celu wizualizacji wszystkich synaps glutaminergicznych.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Badanie presynaptycznie cichych synaps z wykorzystaniem mikroskopii świetlnej
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Plastyczność synaptyczna prawdopodobnie leży u podstaw zdolności układu nerwowego do uczenia się i zapamiętywania, a także może stanowić mechanizm adaptacyjny zapobiegający przekształceniu się potencjalnie szkodliwych czynników w bodźce neurotoksyczne. Badaliśmy formę plastyczności presynaptycznej, która jest interesująca m.in. ze względu na to, że przejawia się jako cyfrowe przełączanie (włączanie i wyłączanie) zdolności terminala presynaptycznego do uwalniania pęcherzyków zawierających neuroprzekaźnik glutaminian. W niniejszej pracy prezentujemy protokół wizualizacji statusu aktywności terminali presynaptycznych w dysocjowanych kulturach komórkowych przygotowanych z hipokampa gryzoni. Metoda opiera się na wykrywaniu aktywnych synaps poprzez barwienie utrwalalną formą barwnika styrylowego FM1-43, powszechnie stosowanego do znakowania pęcherzyków synaptycznych. Profil tego barwienia jest porównywany z immunobarwieniem tych samych terminali przeciwciałem skierowanym przeciwko pęcherzykowemu transporterowi glutaminianu 1 (vGluT-1), który służy do znakowania wszystkich synaps glutaminergicznych, niezależnie od ich statusu aktywacji. Stwierdziliśmy, że bodźce depolaryzujące indukują wyciszenie presynaptyczne. Populacja synaps, która jest nieaktywna w warunkach bazowych, może zostać aktywowana poprzez długotrwałe elektryczne wyciszenie lub poprzez aktywację szlaków sygnalizacyjnych cAMP.
Protokół
Przygotowanie hodowli
- Przygotować dysocjowane kultury komórek hipokampa szczura lub myszy pochodzące od zwierząt w wieku od 0 do 3 dni po urodzeniu1. Nasze neurony przylegają do znajdującej się pod nimi monowarstwy astrocytów, która z kolei przylega do warstwy kolagenu naniesionej na szkiełko nakrywkowe o grubości nr 0. Wysiać neurony z gęstością około 500 komórek na centymetr kwadratowy.
- Kultury inkubować przez 10-14 dni, aby umożliwić rozwój i dojrzewanie synaps. W 4. dniu in vitro potraktować kultury lekiem antymitotycznym AraC w celu zahamowania dalszego wzrostu gleju. W 5. dniu in vitro dokonać połowicznej wymiany pożywki na pożywkę Neurobasal z dodatkiem suplementu B27, aby zwiększyć przeżywalność neuronów.
- W okresie hodowli zastosować zabiegi mające na celu zmianę liczby funkcjonalnie wyciszonych synaps. Stwierdziliśmy, że wygodnym sposobem na wyciszenie dużej części (~80%) synaps glutaminergicznych jest 4-godzinna inkubacja z 30 mM potasu. Dłuższa inkubacja ze słabszymi bodźcami depolaryzującymi indukuje podobne wyciszenie2. W celu aktywacji populacji cichych zakończeń w stanie bazowym można zastosować 4-godzinną stymulację 50 μM forskoliną, która jest aktywatorem cyklaz adenylowych3.
Wizualizacja synaps cichych
- Komórki w 10–14 dniu in vitro powinny mieć stosunkowo niską gęstość i dobrze rozdzielone wypustki neurytowe, aby ułatwić wizualizację poszczególnych terminali synaptycznych za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej.
- Przygotować roztwór zapasowy FM1-43FX o stężeniu 5 mM w wodzie destylowanej. Roztwór zapasowy należy przechowywać w ciemności w temperaturze 4°C. Wszystkie eksperymenty z użyciem FM1-43FX powinny być również przeprowadzane w ciemności.
- Kultury poddać stymulacji przez 2 minuty chlorkiem potasu 45 mM w roztworze soli fizjologicznej buforowanej HEPES, zawierającym 100 mM chlorku sodu, 2 mM chlorku wapnia, 1 mM chlorku magnezu, 10 mM glukozy i 10 μM FM1-43FX. Roztwór ten powinien zawierać również 1 μM NBQX i 25 μM D-APV w celu zablokowania receptorów postsynaptycznych i zapobiegania sygnalizacji zwrotnej. Stymulacja ta spowoduje oznakowanie terminali synaptycznych zdolnych do egzocytozy i endocytozy. Czas i siła stymulacji są tak dobrane, aby wywołać co najmniej jedną rundę egzocytozy wszystkich dostępnych pęcherzyków w puli recyklingowej4. Stymulacja ta nie jest jednak wystarczająca, aby spowodować dodatkowe wyciszenie terminali.
- Przemyć kulturę tylko przez 3 do 5 sekund, używając tej samej soli fizjologicznej buforowanej HEPES bez chlorku potasu, ale z dodatkiem 500 μM Advasep-7 w celu usunięcia niespecyficznego barwnika5. Należy pamiętać, że czas trwania tego etapu jest krytyczny, ponieważ przedłużone stosowanie Advasep-7 doprowadzi do utraty całego oznakowania FM1-43FX. Następnie przemyć w soli fizjologicznej buforowanej HEPES bez Advasep-7 w pięciu 2-minutowych odstępach.
- Utrwalić komórki w 4% paraformaldehydzie i 0,2% glutaraldehydzie w PBS o pH 7,4 przez 10 minut. Przemyć komórki raz, krótko, w PBS, a następnie inkubować przez 15 minut w roztworze blokującym zawierającym 4% normalnej surowicy koziej i 0,04% Triton X-100 w PBS. Należy pamiętać, że FM1-43FX jest również bardzo wrażliwy na ilość użytego tutaj i w późniejszych etapach Triton X-100. Ogólnie rzecz biorąc, oznakowanie FM1-43FX jest najlepsze w przypadku braku Triton X-100, ale pewna ilość detergentu jest niezbędna do permeabilizacji komórek przed kolejnym immunobarwieniem. Doświadczalnie ustaliliśmy, że stężenie 0,04% Triton X-100 jest optymalne do badania synaps wyciszonych presynaptycznie.
- Rozcieńczyć przeciwciało pierwotne anty-vGluT-1 w roztworie blokującym w stosunku 1:2500. Inkubować komórki w rozcieńczonym przeciwciałku anty-vGluT-1 przez 3 godziny w temperaturze pokojowej przy delikatnym wstrząsaniu/rotacji. Należy pamiętać o przykryciu naczyń z kulturą folią, aby zapobiec blaknięciu barwnika FM1-43FX.
- Przemyć komórki dwukrotnie w PBS, a następnie inkubować je z przeciwciałem anty-guineapeg sprzężonym z fluoroforem o innych charakterystykach widmowych niż FM1-43FX, aby rozróżnić oba barwienia. W naszym eksperymencie zastosujemy przeciwciało anty-guineapeg sprzężone z Alexa 555 w rozcieńczeniu 1:500 w roztworze blokującym. Inkubować komórki z przeciwciałem wtórnym przez 30 minut w temperaturze pokojowej przy wstrząsaniu.
- Przemyć komórki jeszcze cztery razy w PBS, a następnie przymocować szkiełko podstawowe do lamali za pomocą małej kropli Fluoromount-G. Należy upewnić się, że lamela jest zorientowana tak, aby komórki były skierowane w stronę szkiełka. Pozostawić preparaty do wyschnięcia przez noc.
- Jesteśmy teraz gotowi do pozyskania obrazów synaps aktywnych i nieaktywnych. Przygotować obiektyw olejowy 60x z aperturą numeryczną 1,4 w konfokalnym skaningowym mikroskopie laserowym. Umieścić preparat na stoliku, upewniając się, że strona z lamelą jest skierowana w stronę obiektywu. Po ustawieniu ostrości znaleźć pole neurytów, które nie jest zbyt gęste. Zaleca się również unikanie obrazowania w pobliżu somy komórkowej, ponieważ mogą tam pozostać resztki barwnika FM1-43FX nawet po intensywnym płukaniu. W naszych obrazach eksperymentalnych zazwyczaj powiększamy obraz do pola o rozmiarze 51 x 51 mikronów.
- Pozyskać stos z-stack danego pola obejmujący głębokość 7,8 mikrona w 27 krokach po 0,3 mikrona. Zakres ten jest wystarczający, aby pokryć grubość neurytów w naszej kulturze. Dla każdego kroku w stosie z-stack najpierw skanować światłem lasera wzbudzającym immunofluorescencję przeciwciała anty-vGluT-1, aby zidentyfikować wszystkie synapsy glutaminergiczne w polu widzenia mikroskopu. To samo pole jest ponownie skanowane w każdym kroku pod kątem fluorescencji FM1-43FX. Ustawić filtry gęstości neutralnej i wzmocnienie fotopowielacza w sposób spójny dla wszystkich lamel w danym eksperymencie, unikając nasycenia sygnału. Zazwyczaj pozyskujemy ≥5 pól na warunek dla każdego eksperymentu.
- Za pomocą oprogramowania analitycznego przekształcić stos z-stack w kompozytowy obraz jednopłaszczyznowy. Proces konwersji, którego używamy, generuje obraz oparty na maksymalnej intensywności z dowolnej płaszczyzny dla każdego piksela. Obraz kompozytowy jest poddawany progowaniu (thresholding), a terminale vGluT-1 są identyfikowane do analizy bez odniesienia do barwienia FM1-43FX. Obszary zabarwione, nazywane punktami (puncta), są oznaczane jako obszary zainteresowania (ROI). Zazwyczaj wybieramy 10 punktów na pole. Następnie poddawany jest progowaniu kanał FM1-43FX i nakładane są obszary zainteresowania. Oprogramowanie analityczne służy do ilościowego określenia intensywności fluorescencji każdego sygnału oraz powierzchni każdego punktu. Aby odróżnić synapsy aktywne od nieaktywnych, można zastosować absolutne kryterium pikselowe lub kryterium procentowe.
Reprezentatywne wyniki
- W naszych kulturach stwierdzamy, że 70-80% synaps glutaminergicznych, zdefiniowanych za pomocą barwienia vGluT-1, wykazuje wykrywalne barwienie FM1-432, 6-8. Na nałożonych obrazach zielonej fluorescencji FM1-43 i czerwonego barwienia vGluT-1 objawia się to obfitością żółtych punktów: synaps z kolokalizacją markerów. Są one wskazane strzałkami.
- Około 20-30% (czerwonych) punktów dodatnich dla vGluT-1 nie będzie wykazywać (zielonej) fluorescencji FM1-43 powyżej poziomu bazowego. Są to nieaktywne terminale presynaptyczne; przykład wskazano grotem strzałki.
- Zaobserwowana zostanie również trzecia populacja synaps. Są one dodatnie pod kątem (zielonej) fluorescencji FM1-43, ale pozbawione (czerwonego) barwienia vGluT-1. Są to aktywne synapsy GABAergiczne, a przykład wskazano gwiazdką. Są one wykluczone z większości naszych analiz, ale mogą być bezpośrednio badane przy użyciu przeciwciała przeciwko pęcherzykowemu transporterowi GABA zamiast przeciwciała vGluT-1.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Znaczenie
- Zazwyczaj uważa się, że synapsy działają poprzez uwalnianie transmitera z mierzalnym prawdopodobieństwem. Prace nasze oraz innych badaczy wykazują, że niektóre synapsy są oporne na uwalnianie neurotransmitera, pomimo pełnego zestawu pęcherzykowego transportera neurotransmitera oraz innych kluczowych markerów presynaptycznych2, 6-8. Wykazaliśmy wcześniej, że podstawowa aktywność sieciowa neuronów jest krytyczna dla utrzymania tej populacji nieaktywnych synaps.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Podziękowania
Niniejsza praca była finansowana z grantów NIH DA018109 i MH78823 oraz grantu NIH Neuroscience Blueprint Core Grant P30NS057105 przyznanego Washington University.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| FM1-43FX | Invitrogen | F-35355 | Dostępny jest również przesunięty w stronę czerwieni FM4-64FX, jednak nie okazał się on tak odpowiedni do analiz wyciszania presynaptycznego. |
| Advasep-7 | CyDex | AR-0A7-001 | |
| vGluT-1 | EMD Millipore | AB5905 | |
| Przeciwciało anty-GP sprzężone z Alexa 647 | Invitrogen | A-21450 | |
| Fluoromount-G | SouthernBiotech | 0100-01 |
Bibliografia
- Mennerick, S., Que, J., Benz, A., Zorumski, C. F. Passive and synaptic properties of hippocampal neurons grown in microcultures and in mass cultures. J. Neurophysiol. 73, 320-332 (1995).
- Moulder, K. L., Jiang, X., Taylor, A. A., Olney, J. W., Mennerick, S. Physiological activity depresses synaptic function through an effect on vesicle priming. J. Neurosci. 26, 6618-6626 (2006).
- Moulder, K. L., Jiang, X., Chang, C., Taylor, A. A., Benz, A. M., Conti, A. C., Muglia, L. J., Mennerick, S. A specific role for Ca2+-dependent adenylyl cyclases in recovery from adaptive presynaptic silencing. J. Neurosci. 28, 5159-5168 (2008).
- Sara, Y., Mozhayeva, M. G., Liu, X., Kavalali, E. T. Fast vesicle recycling supports neurotransmission during sustained stimulation at hippocampal synapses. J. Neurosci. 22, 1608-1617 (2002).
- Kay, A. R., Alfonso, A., Alford, S., Cline, H. T., Holgado, A. M., Sakmann, B., Snitsarev, V. A., Stricker, T. P., Takahashi, M., Wu, L. G. Imaging synaptic activity in intact brain and slices with FM1-43 in C. elegans, lamprey, and rat. Neuron. 24, 809-817 (1999).
- Rosenmund, C., Sigler, A., Augustin, I., Reim, K., Brose, N., Rhee, J. S. Differential control of vesicle priming and short-term plasticity by Munc13 isoforms. Neuron. 33, 411-424 (2002).
- Altrock, W. D., tom Dieck, S., Sokolov, M., Meyer, A. C., Sigler, A., Brakebusch, C., Fassler, R., Richter, K., Boeckers, T. M., Potschka, H., Brandt, C., Loscher, W., Grimberg, D., Dresbach, T., Hempelmann, A., Hassan, H., Balschun, D., Frey, J. U., Brandstatter, J. H., Garner, C. C., Rosenmund, C., Gundelfinger, E. D. Functional inactivation of a fraction of excitatory synapses in mice deficient for the active zone protein bassoon. Neuron. 37, 787-800 (2003).
- Ting, J. T., Kelley, B. G., Lambert, T. J., Cook, D. G., Sullivan, J. M. Amyloid precursor protein overexpression depresses excitatory transmission through both presynaptic and postsynaptic mechanisms. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 104, 353-348 (2007).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
