Presynaptycznie ciche synapsy badane za pomocą mikroskopii świetlnej

Summary

Synapsy glutaminergiczne mogą przełączać się z trybu aktywnego na tryb cichy. Wykazujemy, że stan aktywności presynaptycznej w zdysocjowanej hodowli neuronów gryzoni jest wizualizowany za pomocą utrwalanej formy barwnika FM1-43 do wizualizacji aktywnych synaps i barwienia immunologicznego przeciwciałem vGluT-1 w celu wizualizacji wszystkich synaps glutaminianu.

Abstract

Plastyczność synaptyczna prawdopodobnie leży u podstaw zdolności układu nerwowego do uczenia się i zapamiętywania, a także może reprezentować zdolność adaptacyjną, która zapobiega neurotoksyczności szkodliwych w inny sposób zniewag. Badaliśmy formę plastyczności presynaptycznej, która jest interesująca po części dlatego, że wyraża się jako cyfrowe włączanie i wyłączanie zdolności terminala presynaptycznego do uwalniania pęcherzyków zawierających neuroprzekaźnik glutaminian. Tutaj demonstrujemy protokół wizualizacji stanu aktywności zakończeń presynaptycznych w zdysocjowanych kulturach komórkowych przygotowanych z hipokampa gryzoni. Metoda polega na wykrywaniu aktywnych synaps za pomocą barwienia utrwalającą się formą barwnika styrylowego FM1-43, powszechnie używanego do znakowania pęcherzyków synaptycznych. Ten profil barwienia jest porównywany z barwieniem immunologicznym tych samych końców przeciwciałem skierowanym przeciwko pęcherzykowemu transporterowi glutaminianu 1 (vGluT-1), barwieniu przeznaczonemu do znakowania wszystkich synaps glutaminianu niezależnie od statusu aktywacji. Odkryliśmy, że bodźce depolaryzujące indukują wyciszenie presynaptyczne. Populacja synaps, która jest cicha w warunkach wyjściowych, może być aktywowana przez przedłużone wyciszenie elektryczne lub przez aktywację szlaków sygnałowych cAMP.

Protocol

Przygotowanie kultury

1. Przygotuj zdysocjowane hodowle komórkowe komórek hipokampa szczura lub myszy od dnia pourodzeniowego 0 do 3 zwierząt¹. Nasze neurony przylegają do leżącej pod spodem monowarstwy astrocytów, która z kolei przylega do warstwy kolagenu rozłożonej na szkiełku nakrywkowym o grubości 0. Ułóż neurony w gęstości około 500 komórek na centymetr kwadratowy.
2. Pozwól kulturom rosnąć przez 10-14 dni, aby umożliwić rozwój i dojrzewanie synaptyczne. Potraktuj kultury w dniu in vitro 4 antymitotycznym AraC, aby zatrzymać dalszy wzrost gleju. Nakarm je w dniu in vitro 5 z połową pożywki z pożywką Neurobasal i suplementem B27, aby zwiększyć przeżywalność neuronów.
3. W okresie hodowli należy wprowadzić zabiegi mające na celu zmianę liczby funkcjonalnie wyciszonych synaps. Odkryliśmy, że jednym z wygodnych sposobów na wyciszenie dużego procentu (~80%) synaps glutaminianu jest 4-godzinna kuracja 30 mM potasu. Dłuższe inkubacje ze słabszymi bodźcami depolaryzującymi indukują podobne wyciszenie². 4-godzinna stymulacja forskoliną 50 μM, aktywatorem cyklaz adenylowych, może być wykorzystana do obudzenia populacji cichych końcówek na linii³.

Wizualizacja cichych synaps

1. Komórki powinny mieć stosunkowo niską gęstość z dobrze oddzielonymi procesami neurytycznymi w dniu in vitro 10-14, aby ułatwić wizualizację dyskretnych zakończeń synaptycznych za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej.
2. Przygotować roztwór podstawowy 5 mM FM1-43FX w wodzie destylowanej. Wywar należy przechowywać w ciemności w temperaturze 4°C. Wszystkie eksperymenty z użyciem FM1-43FX powinny być również wykonywane w ciemności.
3. Badaj kultury przez 2 minuty 45 mM chlorku potasu w buforowanym przez HEPES roztworze soli zawierającym 100 mM chlorku sodu, 2 mM chlorku wapnia, 1 mM chlorku magnezu, 10 mM glukozy i 10 μM FM1-43FX. Roztwór ten powinien również zawierać 1 μM NBQX i 25 μM D-APV, aby blokować receptory postsynaptyczne i zapobiegać nawrotom sygnalizacji. To wyzwanie oznaczy zakończenia synaptyczne, które są zdolne do egzocytozy i endocytozy. Czas i siła wyzwania są zaprojektowane tak, aby wywołać co najmniej jedną rundę egzocytozy wszystkich dostępnych pęcherzyków w puli recyklingu⁴. Wyzwanie nie jest jednak wystarczające, aby spowodować dodatkowe wyciszenie terminali.
4. Myć kulturę tylko przez 3 do 5 sekund, używając tego samego soli fizjologicznej buforowanej przez HEPS bez chlorku potasu, ale z 500 μM Advasep-7 w celu usunięcia niespecyficznego barwnika⁵. Należy pamiętać, że czas wykonania tego kroku ma kluczowe znaczenie, ponieważ długotrwałe stosowanie Advasep-7 spowoduje utratę wszystkich etykiet FM1-43FX. Następnie przemyj solą fizjologiczną buforowaną przez HEPS bez Advasep-7 przez pięć 2-minutowych odstępów.
5. Utrwal komórki za pomocą 4% paraformaldehydu i 0,2% aldehydu glutarowego w PBS, pH 7,4 przez 10 minut. Przemyć komórki raz krótko PBS, a następnie inkubować przez 15 minut w roztworze blokującym zawierającym 4% normalnej surowicy koziej i 0,04% Triton X-100 w PBS. Należy pamiętać, że FM1-43FX jest również bardzo wrażliwy na ilość Triton X-100 użytą tutaj i w późniejszych krokach. Ogólnie rzecz biorąc, znakowanie FM1-43FX jest najlepsze w przypadku braku Triton X-100, ale do przepuszczalności komórek w celu późniejszego barwienia immunologicznego niezbędna jest pewna ilość detergentu. Ustaliliśmy empirycznie, że 0,04% Triton X-100 jest optymalny do badania presynaptycznie cichych synaps.
6. Rozcieńczyć pierwszorzędowe przeciwciało vGluT-1 w roztworze blokującym w stężeniu 1:2500. Inkubować komórki, delikatnie wstrząsając/obracając w rozcieńczonym przeciwciałie vGluT-1 przez 3 godziny w temperaturze pokojowej. Pamiętaj, aby przykryć naczynia hodowlane folią, aby zapobiec wybielaniu barwnika FM1-43FX.
7. Umyj komórki dwukrotnie w PBS, a następnie inkubuj komórki z przeciwciałem anty-świnki morskiej sprzężonym z fluoroforem o różnych charakterystykach widmowych od FM1-43FX, aby odróżnić dwie barwienia. W naszym eksperymencie użyjemy przeciwciała anty-świnki morskiej sprzężonego z Alexa 555 w stosunku 1:500 w roztworze blokującym. Inkubować komórki z przeciwciałem drugorzędowym, wstrząsając przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
8. Umyj ogniwa jeszcze cztery razy w PBS, a następnie zamontuj szkiełko nakrywkowe na szkiełku podstawowym za pomocą małej kropli Fluoromount-G. Pamiętaj, aby ustawić szkiełko nakrywkowe tak, aby komórki były skierowane w stronę szkiełka. Pozostaw szkiełka do wyschnięcia na noc.
9. Jesteśmy teraz gotowi do pozyskiwania obrazów aktywnych i nieaktywnych synaps. Przygotuj obiektyw olejowy 60 x z aperturą numeryczną 1,4 na konfokalnym laserowym mikroskopie skaningowym. Umieść szkiełko na stoliku, upewniając się, że strona szkiełka nakrywkowego jest skierowana w stronę obiektywu. Po ustawieniu ostrości szkiełka znajdź pole neurytów, które nie jest zbyt gęste. Zaleca się również unikanie obrazowania w pobliżu somy komórkowej, ponieważ resztki barwnika FM1-43FX mogą tam pozostać nawet po intensywnym myciu. W przypadku naszych obrazów eksperymentalnych zazwyczaj powiększamy pole o rozmiarze 51 51 mikronów.
10. Uzyskaj z-stos danego pola obejmujący głębokość 7,8 mikrona z 27 krokami po 0,3 mikrona. Ten zakres jest wystarczający, aby pokryć grubość neurytów w naszej kulturze. Dla każdego kroku w stosie Z należy najpierw zeskanować światło laserowe, które pobudza immunofluorescencję przeciwciała vGluT-1, aby zidentyfikować wszystkie synapsy glutaminergiczne w polu mikroskopowym. To samo pole jest ponownie skanowane na każdym etapie pod kątem fluorescencji FM1-43FX. Ustaw filtrowanie o neutralnej gęstości i zyski fotopowielacza konsekwentnie wśród wszystkich szkiełek nakrywkowych dla danego eksperymentu, unikając nasycenia sygnału. Zazwyczaj uzyskujemy ≥5 pól na warunek dla każdego eksperymentu.
11. Korzystając z oprogramowania analitycznego, przekształć stos z w złożony obraz jednopłaszczyznowy. Proces, którego używamy do tej konwersji, tworzy obraz oparty na maksymalnej intensywności z dowolnej płaszczyzny w każdym pikselu. Obraz złożony jest progowy, a końce vGluT-1 są identyfikowane do analizy, bez odniesienia do barwienia FM1-43FX. Poplamione obszary, określane jako puncta, są oznaczane jako obszary zainteresowania. Zazwyczaj wybieramy 10 puncta na pole. Następnie kanał FM1-43FX jest wyznaczany z progami, a obszary zainteresowania są nakładane. Oprogramowanie analityczne służy do ilościowego określania intensywności fluorescencji każdego sygnału, a także obszaru każdego punktu. Kryterium bezwzględnej liczby pikseli lub kryterium procentowej liczby pikseli może być użyte do odróżnienia aktywnych i nieaktywnych synaps.

Reprezentatywne wyniki

1. W naszych kulturach stwierdzamy, że 70-80% synaps glutaminianu, zdefiniowanych przez barwienie vGluT-1, wykazuje wykrywalne barwienie FM1-43^{2, 6-8}. Na nałożonych obrazach zielonej fluorescencji FM1-43 i czerwonego barwienia vGluT-1 znajduje to odzwierciedlenie jako obfitość żółtych puncta: synaps z kolokalizowanymi markerami. Są one oznaczone strzałkami.
2. Około 20-30% (czerwonej) dodatniej punkcji vGluT-1 nie będzie miało (zielonej) fluorescencji FM1-43 powyżej linii podstawowej. Są to nieaktywne zakończenia presynaptyczne, a przykład jest wskazywany przez grot strzałki.
3. Zaobserwowana zostanie również trzecia populacja synaps. Są one dodatnie dla (zielonej) fluorescencji FM1-43, ale pozbawione (czerwonego) barwienia vGluT-1. Są to aktywne synapsy GABA-ergiczne, a przykład jest oznaczony gwiazdką. Są one wykluczone z większości naszych analiz, ale można je jednoznacznie zbadać przy użyciu pęcherzykowego przeciwciała transportującego GABA zamiast przeciwciała vGluT-1.

Discussion

Znaczenie

1. Zazwyczaj uważa się, że synapsy działają poprzez uwolnienie nadajnika z mierzalnym prawdopodobieństwem. Praca nasza i innych pokazuje, że niektóre synapsy są oporne na uwalnianie neuroprzekaźnika, pomimo pełnego zestawu pęcherzykowego transportera neuroprzekaźników i innych kluczowych markerów presynaptycznych^{2, 6-8}. Wykazaliśmy wcześniej, że podstawowa aktywność sieci w neuronach ma kluczowe znaczenie dla utrzymania tej populacji nieaktywnych synaps.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
FM1-43FX	Invitrogen	F-35355	Dostępny jest również FM4-64FX z przesunięciem ku czerwieni, ale nie okazał się podatny na testy wyciszania presynaptycznego.
Advasep-7	CyDex	AR-0A7-001
vGluT-1	EMD Millipore	AB5905
Alexa 647-sprzężony anty-GP	Invitrogen	A-21450
Fluoromount-G	SouthernBiotech	0100-01