Bezpośrednia obserwacja enzymów replikujących DNA z wykorzystaniem testu rozciągania pojedynczej cząsteczki DNA

Podsumowanie

Opisujemy metodę obserwacji replikacji pojedynczych cząsteczek DNA w czasie rzeczywistym, pośredniczonej przez białka systemu replikacyjnego bakteriofaga.

Streszczenie

Opisujemy metodę obserwacji w czasie rzeczywistym replikacji pojedynczych cząsteczek DNA pośredniczonej przez białka systemu replikacyjnego bakteriofaga. Linearyzowane DNA $\lambda$ zostaje zmodyfikowane w taki sposób, aby na końcu jednej nici znajdowała się biotyna, a na drugim końcu tej samej nici grupa digoksygeniny. Koniec biotylowany zostaje przyłączony do funkcjonalizowanej szkiełka przedmiotowego, a koniec digoksygenylowany do małego koralika. Montaż tych powiązań DNA-koralik na powierzchni komory przepływowej pozwala na zastosowanie przepływu laminarnego w celu wywarcia siły oporu na koralik. W rezultacie DNA zostaje rozciągnięte blisko i równolegle do powierzchni szkiełka pod wpływem siły określonej przez szybkość przepływu (Rycina 1). Długość DNA jest mierzona poprzez monitorowanie pozycji koralika. Różnice w długości między jednoniciowym a dwuniciowym DNA są wykorzystywane do uzyskania informacji w czasie rzeczywistym na temat aktywności białek replikacyjnych w widelcu replikacyjnym. Pomiar pozycji koralika pozwala na precyzyjne określenie szybkości i procesywności rozplatania oraz polimeryzacji DNA (Rycina 2).

Protokół

1. Matryca replikacji DNA

DNA do reakcji to linearyzowany λ DNA zmodyfikowany poprzez przyłączanie oligonukleotydów w celu utworzenia widelca replikacyjnego. Dodatkowo, do końca jednej nici λ DNA przyłączona jest biotyna, a do drugiego końca tej samej nici przyłączona jest grupa digoksygeniny¹.

Materiały: DNA bakteriofaga λ, oligonukleotydy: biotynilowane ramię widełki (A: 5'-biotin-AAAAAAAAAAAAAAAAGTACTGTACGATCTAGCATCAATCACAGGGTCAGGTTCGTTATTGTCCAACTTGCTGTCC-3'), ramię widełki komplementarne do λ (B: 5'-GGGCGACCTGGACAGCAAGTTG GACAATCTCGTTCTATCACTAATTCACTAATGCAGGGAGGATTTCAGATGGCA-3'), primer widełki (C: 5'-TGCCATCTGAAATCCTCCCTGC-3'), koniec z digoksigeniną komplementarny do λ (D: 5'-AGGTCG CCGCCCAAAAAAAAAAAA-digoxigenin-3'), ligaza DNA T4, polinukleotydowa kinaza T4, blok grzejny.

1. Przeprowadź fosforylację końców 5' oligonukleotydów B i D przy użyciu kinazy polinukleotydowej T4.
2. Hybrydyzuj oligonukleotydy A, B i C z λ DNA w jednym kroku, dodając 10-krotny nadmiar oligonukleotydów A i B oraz 10-krotny nadmiar oligonukleotydu C w buforze ligazy DNA T4.
3. Ogrzej mieszaninę do 65 °C w bloku grzewczym. Po osiągnięciu tej temperatury wyłącz blok i pozwól na powolne chłodzenie, aby zapewnić prawidłową hybrydyzację oligonukleotydów.
4. Dodaj do mieszaniny ligazę DNA T4 i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 2 godziny. Ligaza DNA T4 skatalizuje prawidłowe połączenie oligonukleotydów A i B z λ DNA.
5. Na koniec hybrydyzuj oligonukleotyd D z matrycą replikacji DNA, dodając 10-krotny nadmiar oligonukleotydu D w stosunku do l DNA w buforze ligazy DNA T4.
6. Inkubuj mieszaninę w temperaturze 45 °C przez 30 min w bloku grzewczym, a następnie powoli schładzaj do temperatury pokojowej, wyłączając blok grzewczy.
7. Gotowa matryca replikacji DNA jest teraz przygotowana do użycia. Przechowujemy matrycę w stężeniu 1.4 nM w temperaturze 4 °C przez kilka tygodni.

2. Kuleczki

Kuleczki są funkcjonalizowane fragmentem Fab wykazującym swoistość wobec digoksigeniny. Następnie mogą one zostać przyłączone do matrycy replikacji DNA².

Materiały: Kulek aktywowanych tosylą, fragment Fab α-digoksygeniny, Bufor A: 0,1 M H3BO3 pH 9,5, Bufor B: 0,1 M PBS pH 7,4, 0,1% w/v BSA, Bufor C: 0,2 M Tris-HCl pH 8,5 (25 °C), 0,1% w/v BSA, separator magnetyczny, rotator.

1. Resuspendować roztwór zapasowy kulek i przenieść małą alikwot do probówki typu Eppendorf. Umieścić probówkę w gnieździe separatora magnetycznego i inkubować do momentu, aż roztwór stanie się klarowny, a następnie usunąć supernatant za pomocą pipety.
2. Dodać bufor A, który aktywuje grupy tosylowe w celu sprzęgania przeciwciał. Delikatnie wymieszać poprzez pipetowanie i usunąć bufor za pomocą separatora magnetycznego.
3. Dodać fragment Fab i ponownie resuspendować kulki w buforze A, dokładnie wymieszać i inkubować przez 16-24 godziny w temperaturze 37 °C przy użyciu rotatora. Po inkubacji oddzielić kulki za pomocą separatora magnetycznego i usunąć bufor.
4. Przemyć kulki, dodając bufor B, i inkubować w temperaturze 4 °C przez 5 min. Usunąć bufor za pomocą separatora magnetycznego. Powtórzyć proces płukania dwukrotnie.
5. Dodać bufor C i inkubować w temperaturze 37 °C przez 4 godziny w celu zablokowania wolnych grup tosylowych. Oddzielić kulki za pomocą separatora magnetycznego i usunąć bufor.
6. Przemyć dwukrotnie w buforze B i rozdzielić na alikwoty do późniejszego użycia. Kulki można przechowywać w temperaturze 4 °C przez rok lub dłużej bez znaczącej utraty jakości (nasz roztwór zapasowy zawiera 1- 2x10⁹ kulek/ml).

3. Funkcjonalizowane szkiełka nakrywkowe

Aby umożliwić przyłączenie DNA do szkiełka podstawowego, szkło jest najpierw funkcjonalizowane aminosilanem, który następnie zostaje sprzężony z biotynilowanymi cząsteczkami PEG. Powłoka ta pomaga ograniczyć niespecyficzne oddziaływania DNA oraz białek replikacyjnych z powierzchnią^3,4.

Materiały: szkiełka nakrywki, naczynia do barwienia, 3-aminopropyltrietoksysilan, Methoxy-PEG5k-NHS ester, Biotin-PEG5k-NHSester, aceton, 1M KOH, etanol, piekarnik, myjka ultradźwiękowa

1. Dokładnie oczyścić szklane przykrywki, umieszczając je w naczyniach do barwienia i napełniając naczynia etanolem. Poddać działaniu ultradźwięków przez 30 minut, wypłukać naczynia i napełnić 1 M KOH. Powtórzyć oba etapy mycia.
2. Przed pierwszą reakcją funkcjonalizacji należy usunąć wszystkie ślady wody. Napełnić naczynia acetonem i poddać działaniu ultradźwięków przez 10 min. Opróżnić i ponownie napełnić acetonem.
3. Przygotować 2 % v/v roztwór odczynnika silanowego w acetonie. Dodać do naczyń do barwienia i mieszać przez 2 minuty. Reakcja ta łączy grupę alkoksylową aminosilanu ze szkłem, pozostawiając reaktywną grupę aminową dla następnego etapu sprzęgania. Przerwać reakcję, dodając nadmiar wody.
4. Osuszyć przykrywki, wygrzewając je w piekarniku w temperaturze 10 °C przez 30 minut.
5. Przygotować mieszaninę metoksy- i biotynowanego PEG w stosunku 50:1 w 10 mM NaHCO₃ pH 8,2. Dążyć do uzyskania stężenia biotynowanego PEG na poziomie około 0,2 % w/v.
6. Napipetować 10 μL mieszaniny PEG na suchą, silanizowaną przykrywkę i położyć na niej drugą przykrywkę. Zastosowanie szklanego dystansera umożliwi późniejsze oddzielenie przykrywek.
7. Inkubować przykrywki w roztworze PEG przez 3 godziny, następnie rozdzielić każdą parę przykrywek i dokładnie wypłukać wodą. Należy pamiętać, aby trzymać przykrywki stroną funkcjonalizowaną do góry, ponieważ tylko jedna strona zostanie pokryta PEG.
8. Osuszyć przykrywki powietrzem i przechowywać w próżni w eksykatorze. Powierzchnie pozostają stabilne przez co najmniej miesiąc, co pozwala na przygotowanie kilkudziesięciu przykrywek w jednej partii i wykorzystywanie ich w razie potrzeby.

4. Przygotowanie komory przepływowej

Eksperyment przeprowadza się przy użyciu prostej komory przepływowej wykonanej z funkcjonalizowanej szkiełka nakrywkowego, dwustronnej taśmy, płytki kwarcowej i rurek. Dla każdego eksperymentu z pojedynczymi cząsteczkami przygotowuje się jedną komorę przepływową^2,4.

Materiały: Taśma dwustronna, żyletka, szkiełko kwarcowe z otworami na rurki, szybkoutwardzalna żywica epoksydowa, funkcjonalizowane szkiełko nakrywkowe, roztwór streptawidyny (25 μL w stężeniu 1 mg/mL w PBS), rurki, bufor blokujący (5X: 20 mM Tris pH 7.5, 2 mM EDTA, 50 mM NaCl, 0.2 mg/mL BSA, 0.05% Tween-20), bufor roboczy (1X: 20 mM Tris-HCl pH 7.5, 2 mM EDTA, 50 mM NaCl).

1. Zacznij od zmieszania i umieszczenia 5 mL buforu blokującego oraz 20 ml buforu roboczego w deskrypcatorze, aby usunąć pęcherzyki powietrza potrzebne do kolejnych etapów.
2. Pobierz szkiełko podstawowe funkcjonalizowane PEG i rozprowadź na jego powierzchni 125 µL roztworu streptawidyny rozcieńczonej w PBS. Pozostaw do inkubacji na 20 minut w temperaturze pokojowej podczas przygotowywania pozostałych elementów komory, aby umożliwić związanie streptawidyny z biotynami na powierzchni.
3. Odetnij kawałek taśmy dwustronnej dopasowany do rozmiaru płytki kwarcowej. Zaznacz na taśmie pozycje otworów na rurki, tak aby można było narysować na niej obrys komory przepływowej.
4. Wykonaj kanał środkowy o szerokości 3 mm oraz prostokąty obejmujące oba otwory. Stosujemy komory przepływowe z dwoma kanałami wlotowymi i dwoma wylotowymi w kształcie litery Y.
5. Wytnij wzdłuż narysowanego obrysu, wykonując proste i czyste cięcia, aby upewnić się, że żaden klej nie wystaje do wnętrza kanału.
6. Dokładnie oczyść kwarc za pomocą acetonu lub etanolu, aby usunąć resztki kleju z poprzedniej konstrukcji komory przepływowej.
7. Znajdź optymalne wyrównanie obrysu kanału, zdejmij jedną stronę warstwy ochronnej kleju i ostrożnie przyłóż taśmę do płytki kwarcowej. Należy dbać o prawidłowe wyrównanie taśmy, ponieważ otwory wlotowe i wylotowe muszą pozostać niezablokowane.
8. Odetnij odcinki rurek dla wlotu i wylotu komory przepływowej. Pomocne jest odcięcie końcówki rurki pod kątem około 30°, aby rurka nie przylegała płasko do dna komory. Umieść rurki na jakimś podłożu (np. statywie na probówki), aby zawiesić je dla łatwego przyłączenia do komory przepływowej w kolejnych krokach.
9. Dokładnie wypłucz szkiełko podstawowe pokryte streptawidyną wodą i wysusz sprężonym powietrzem. Pamiętaj, że funkcjonalizowana jest tylko jedna strona. Zdejmij drugą stronę warstwy ochronnej taśmy i połóż płytkę kwarcową na szkiełku podstawowym.
10. Lekko dociśnij szkiełko podstawowe, aby wypchnąć wszelkie powietrze uwięzione w kleju. Pomoże to uniknąć przedostania się pęcherzyków powietrza do kanału przepływowego.
11. Uszczelnij boki komory żywicą epoksydową. Wsuń odcięte rurki w otwory w kwarcu i utrwal je w miejscu żywicą epoksydową. Żywica musi schnąć przez kilka minut.
12. Po wyschnięciu rozpocznij blokowanie powierzchni, przepuszczając część odgazowanego buforu blokującego przez jedną z rurek. Igła 21G idealnie pasuje do rurki o średnicy 0.76 mm. Przepłucz kilka razy, aby usunąć pęcherzyki powietrza, i pozostaw komorę do inkubacji na co najmniej pół godziny.

5. Eksperyment replikacji pojedynczych cząsteczek

Po przygotowaniu matrycy DNA i funkcjonalizowanych kulek oraz po przygotowaniu komory przepływowej można przeprowadzić eksperyment jednocząsteczkowy.

Materiały: przygotowana komora przepływowa, bufor blokujący (5X: 20 mM Tris-HCl pH 7.5, 2 mM EDTA, 50 mM NaCl, 1 mg/mL BSA, 0,025% Tween-20), bufor roboczy (1X: 20 mM Tris-HCl pH 7.5, 2 mM EDTA, 50 mM NaCl), bufory do replikacji T7 z lub bez 10mM MgCl₂ (1X: 40 mM Tris-HCl pH 7.5, 50 mM K-glutaminian, 2 mM EDTA, 10 μg/ml BSA, 10 mM DTT, 60 μM dNTPs), białka replikacyjne, odwrócony mikroskop optyczny z obiektywem 10X, kamera CCD, stały magnes ziem rzadkich, pompa strzykawkowa, sprężyna pneumatyczna, iluminator światłowodowy, komputer z oprogramowaniem do akwizycji obrazu.

1. Po zablokowaniu komory przepływowej układ jest gotowy do rozpoczęcia eksperymentu.
2. Należy wziąć komorę przepływową i umieścić ją na stole mikroskopu. Komorę należy unieruchomić za pomocą uchwytów stołu, upewniając się, że kanał przepływowy jest ustawiony w osi kamery CCD.
3. Należy połączyć rurki wylotowe komory przepływowej z amortyzatorem powietrznym (airspring), używając rurek łączących o większej średnicy lub igły. Amortyzator powietrzny służy do stabilizacji wszelkich nieregularności przepływu. Plastikową probówkę o pojemności 50 ml napełnia się 45 ml wody. Wieczko probówki uszczelnia się żywicą epoksydową. W wieczku wykonuje się trzy otwory, przez które wprowadza się trzy fragmenty rurek. Następnie rurki uszczelnia się do wieczkowej żywicą epoksydową, aby zapobiec przedostawaniu się powietrza do środka lub na zewnątrz. Amortyzator powietrzny łączy się z pompą strzykawkową oraz z rurkami wylotowymi komory przepływowej.
4. Należy umieścić rurki wlotowe komory przepływowej w buforze blokującym i odciągnąć tłok strzykawki, aby usunąć powietrze z rurki. Delikatne strzepnięcie rurki wylotowej pomoże usunąć pęcherzyki powietrza uwięzione w komorze przepływowej.
5. Po usunięciu wszystkich pęcherzyków powietrza należy zablokować jedną z rurek wlotowych za pomocą igły, a jedną z rurek wylotowych, zginając ją o 180° i zabezpieczając taśmą klejącą.
6. Roztwór zapasowy matrycy DNA należy rozcieńczyć do stężenia 10 pM w 1 ml odgazowanego buforu blokującego. Roztwór należy wprowadzić do komory z umiarkowaną prędkością przepływu, aby zapewnić dobre pokrycie powierzchni przez DNA (dobrze sprawdza się 0,01-0,05 ml/min przez 20 minut). Parametr ten można modyfikować w zależności od liczby cząsteczek DNA na powierzchni dla każdej partii szkiełek przedmiotowych lub od pożądanej liczby cząsteczek do eksperymentu.
7. Roztwór zapasowy kulek należy rozcieńczyć do stężenia 2-4x10⁶ kulek/ml w 1 ml odgazowanego buforu blokującego. Roztwór należy wprowadzić do komory z prędkością 0,01-0,05 ml/min przez 15 minut.
8. Po dodaniu kulek należy wyłączyć przepływ i pozwolić komorze osiągnąć stan równowagi. Następnie należy zamknąć obie rurki wylotowe. Jakiekolwiek zmiany w rurkach przy otwartej komorze spowodują fluktuacje ciśnienia, które wywrą silną siłę na kulki i zerwą przytwierdzone cząsteczki DNA.
9. Należy zablokować igłą rurkę wlotową używaną do wprowadzania kulek i rozpocząć płukanie komory przepływowej poprzez drugi wlot, używając odgazowanego 1X roztworu buforu blokującego w buforze roboczym. Należy płukać intensywnie przy prędkości 0,01-0,05 ml/min. Stół należy delikatnie potrząsać poprzez opukiwanie, aby usunąć kulki nieswoiście przywierające do powierzchni (Opukiwanie).
10. Po odpowiednim usunięciu wolnych kulek należy wyłączyć przepływ i pozwolić komorze osiągnąć stan równowagi. Należy zamknąć otwartą rurkę wylotową i przełączyć zbiornik wlotowy na roztwór białka, powoli otwierając wylot, aby uniknąć gwałtownych zmian ciśnienia.
11. Można sprawdzić, czy kulki są przytwierdzone do DNA, zmieniając kierunek przepływu (DNA).
12. Można teraz przeprowadzić reakcję enzymatyczną. Dla eksperymentów syntezy nici wiodącej należy przygotować roztwór helikazy gp4 o stężeniu 20 nM oraz roztwór polimerazy gp5 o stężeniu 20 nM (oczyszczonej jako kompleks z jej czynnikiem procesywności – tioredoksyną) w odgazowanym buforze replikacyjnym T7, który nie zawiera MgCl₂.
13. Roztwór białka należy wprowadzić do komory z umiarkowaną prędkością przepływu, aby umożliwić efektywne wiązanie z DNA. Stosujemy prędkość 0,037 ml/min przez 8 minut, a następnie 0,012 ml/min przez 7 minut.
14. Komorę należy przepłukać odgazowanym buforem replikacyjnym T7 bez MgCl₂, aby usunąć wolne białka. Prędkość 0,037 ml/min przez 3-10 minut jest odpowiednia.
15. Po płukaniu należy wprowadzić bufor replikacyjny T7 z MgCl₂ i rozpocząć akwizycję danych. Należy zastosować prędkość przepływu 0,012 ml/min, co odpowiada sile oporu 3 pN działającej na przytwierdzone nici DNA w warunkach opisanych w tym protokole.
16. Przed obrazowaniem nad komorą przepływową należy umieścić trwały magnes ziemi rzadkiej, aby zapobiec nieswoistym oddziaływaniom między kulkami a powierzchnią.
17. Pole widzenia należy oglądać przy użyciu obiektywu 10X i kamery CCD. Ostrość ustawia się na przytwierdzonej kulce.
18. Iluminator światłowodowy należy ustawić pod kątem padania od 10 stopni do ustawienia równoległego do stołu mikroskopu w pobliżu urządzenia. Do oświetlenia w ciemnym polu stosuje się w celu zwiększenia kontrastu obrazowania kulek.
19. Dane należy gromadzić przez 20-30 min przy niskiej częstotliwości klatek (zazwyczaj 2-4 Hz).

6. Reprezentatywne wyniki

W przypadku udanego eksperymentu powinni Państwo być w stanie zaobserwować jednocześnie ponad 10 kuleczek (Synteza nici wiodącej). Eksperyment powinien przynieść liczne ślady obrazujące syntezę DNA nici wiodącej.

Analiza danych:

Aby zmierzyć szybkości i procesywności rozplatania oraz polimeryzacji DNA, należy wyznaczyć dokładne pozycje kulek. Można to osiągnąć, dopasowując te pozycje za pomocą dwuwymiarowych funkcji Gaussa. Następnie można wyekstrahować trajektorie, śledząc pozycję kulek w każdej klatce za pomocą oprogramowania do śledzenia (np. DiaTrack). Teraz można zwizualizować trajektorie, wykreślając pozycję kulek jako funkcję czasu przy użyciu dowolnego oprogramowania graficznego (np. Origin). Aby uzyskać dane o szybkości, dopasuj wykresy za pomocą regresji liniowej i oblicz nachylenie. W celu wyznaczenia procesywności określ całkowitą długość DNA od początku do końca zdarzenia skrócenia (Rysunek 3). Obie te wartości będą wymagały przeliczenia na pary zasad. Aby przeliczyć ruch kulek na pary zasad, należy najpierw zmierzyć długość rozciągniętej cząsteczki λ DNA przy zastosowanym przepływie reakcyjnym. Ponieważ długość λ DNA jest znana (48 502 bp), można skalibrować liczbę par zasad/piksel przy sile eksperymentalnej. Dla zwiększenia dokładności od śladów obiektów badawczych należy odjąć ślad bazowy kulek przywiązanych, które nie zostały poddane modyfikacji enzymatycznej. Połącz wszystkie pojedyncze pomiary i wykreśl rozkłady szybkości oraz procesywności. Dopasuj dane odpowiednio za pomocą funkcji Gaussa i funkcji pojedynczej wykładniczej (Rysunek 3).

Rycina 1. Układ eksperymentalny do analizy pojedynczych cząsteczek. (a) Dwuniciowe λ DNA (48,5 kb) jest przytwierdzone do powierzchni komory przepływowej za pomocą końca 5' jednej nici poprzez oddziaływanie biotyna-streptawidyna, a koniec 3' tej samej nici jest przytwierdzony do kuleczki za pomocą oddziaływania digoksygenina-przeciwciało anty-digoksygenina. Na końcu przeciwległym do kuleczki tworzony jest zainicjowany widelec replikacyjny, aby umożliwić załadowanie polimerazy. (b) Zespoły kuleczka-DNA są rozciągane za pomocą laminarnego przepływu buforu i obrazowane przy użyciu szerokopolowej mikroskopii optycznej. Poprzez śledzenie pozycji kuleczek w czasie, przy zachowaniu stałej siły rozciągania, można monitorować długości konstruktów DNA. (c) Profil wydłużenia ssDNA (zamalowane koło) i dsDNA (otwarte koło) przy niskich siłach. Linia przerywana wskazuje długość krystalograficzną w pełni dwuniciowego λ DNA. 16.3 μmZnaczna różnica w długości między ssDNA a dsDNA przy siłach rzędu 3 pN umożliwia bezpośrednią obserwację konwersji między ss- a dsDNA poprzez monitorowanie zmian długości DNA. Równoczesna wizualizacja dużej liczby kulek sprzężonych z DNA pozwala na badanie wielu pojedynczych replisomów w jednym eksperymencie.

Rysunek 2. Białka replikacyjne bakteriofaga T7: polimeraza DNA (kompleks gp5 i tioredoksyny) oraz helikaza DNA (gp4) syntetyzują wiodącą nić DNA w obecności deoksyrybonukleotydów i magnezu. Proces ten wiąże się ze skróceniem opóźnionej nici DNA na skutek zwijania. Konwersja dsDNA w ssDNA zmienia położenie kuleczki. Pomiar położenia kuleczki pozwala na precyzyjne oznaczenie szybkości i procesywności replikacji DNA.

Rysunek 3. Przykład typowych danych z eksperymentu syntezy nici wiodącej na poziomie pojedynczej cząsteczki. Procesywność replikacji DNA jest równa całkowitej długości DNA od początku do końca zdarzenia skrócenia. Szybkość replikacji DNA wyznacza się poprzez dopasowanie wykresu za pomocą regresji liniowej i obliczenie nachylenia. Wstawka przedstawia rozkłady szybkości i procesywności, które uzyskano poprzez połączenie danych z wielu pomiarów. Dane dopasowano odpowiednio za pomocą funkcji Gaussa oraz funkcji pojedynczej wykładniczej.

Dyskusja

Ważne jest, aby upewnić się, że siła oporu wywierana na koraliki przez przepływ laminarny nie wpływa na aktywność enzymatyczną białek replikacyjnych. Na przykład siła 3 pN, odpowiadająca szybkości przepływu 0,012 ml/min, nie wpływa na replikację nici wiodącej DNA. Wpływa ona jednak na aktywności enzymatyczne zachodzące podczas skoordynowanej syntezy DNA, dlatego musi zostać zredukowana do 1,5 pN. Siłę oporu można łatwo kontrolować poprzez zmianę szybkości przepływu lub szerokości kanału przepływowego⁵.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
DNA bakteriofaga λ	New England Biolabs	N3011L
Oligonukleotydy DNA	Integrated DNA Technologies
Ligaza DNA T4	New England Biolabs	M0202L
Polinukleotydowa kinaza T4	New England Biolabs	M0201L
Fab α-digoksygeniny	Roche Group	11214667001
Kulek aktywowane tosylanem	Invitrogen	142-03
Separator magnetyczny	Invitrogen	Dynal MPC
3-aminopropylotrietoksysilan	Sigma-Aldrich	A3648	Można stosować inne aminosilany lub mieszać je z silanami niereaktywnymi względem grup aminowych w celu uzyskania rzadszych powierzchni
PEG z propionianem sukcynimidylowym	Nektar		Podobne PEG-i można nabyć w firmach Nanocs, CreativePEGWorks itp.
Biotyna-PEG-NHS	Nektar		Podobne PEG-i można nabyć w firmach Nanocs, CreativePEGWorks itp.
Taśma dwustronna	Grace Bio-Lab Inc.	SA-S-1L	grubość 100 μm
Szkiełko kwarcowe	Technical Glass	20 mm (S)x 50 mm (D)x 1mm (W)	Rozmiar dopasowany do szkiełek nakrywkowych. Wiercić otwory wiertłami z końcówką diamentową (DiamondBurs.net)
Przewody polietylenowe	BD Biosciences	427416	ID 0,76 mm, OD 1,22 Można zastąpić przewodami o innych rozmiarach.
Streptawidyna	Sigma-Aldrich	S4762	Przygotować roztwór 1 mg/mL, alikwoty 25 μL w PBS pH 7,3
Mieszanina roztworów trifosforanów deoksyrybonukleotydowych	New England Biolabs	N0447
Odwrócony mikroskop optyczny z obiektywem 10X	Olympus Corporation	Olympus IX-51
Stały magnes ziemi rzadkich	National Imports	www.rare-earth-magnets.com
Kamera CCD	QImaging	Rolera-XR Fast 139
Pompa strzykawkowa	Harvard Apparatus	11 Plus	Uruchamiać w trybie dopełniania, aby ułatwić wymianę roztworów
Iluminator światłowodowy	Thorlabs Inc.	OSL1