Bezpośrednia obserwacja enzymów replikujących DNA za pomocą testu rozciągania pojedynczej cząsteczki DNA

Podsumowanie

Opisujemy metodę obserwacji replikacji w czasie rzeczywistym pojedynczych cząsteczek DNA, w której pośredniczą białka systemu replikacji bakteriofagów.

Streszczenie

Opisano metodę obserwacji replikacji w czasie rzeczywistym pojedynczych cząsteczek DNA, w której pośredniczą białka systemu replikacji bakteriofagów. Linearyzowany λ DNA jest modyfikowany tak, aby zawierał biotynę na końcu jednej nici i ugrupowanie digoksygeniny na drugim końcu tej samej nici. Biotynylowany koniec jest przymocowany do funkcjonalizowanego szklanego szkiełka nakrywkowego, a digoksygenizowany koniec do małego koralika. Montaż tych pęt DNA-kulek na powierzchni komórki przepływowej umożliwia zastosowanie przepływu laminarnego w celu wywarcia siły oporu na kulkę. W rezultacie DNA jest rozciągane blisko i równolegle do powierzchni szkiełka nakrywkowego z siłą określoną przez natężenie przepływu (ryc. 1). Długość DNA mierzy się, monitorując położenie koralika. Różnice długości między jedno- i dwuniciowym DNA są wykorzystywane do uzyskania informacji w czasie rzeczywistym na temat aktywności białek replikacyjnych na widelcu. Pomiar położenia kulki pozwala na precyzyjne określenie szybkości i procesywności odwijania i polimeryzacji DNA (ryc. 2).

Protokół

1. Szablon replikacji DNA

DNA do reakcji to zlinearyzowane λ DNA zmodyfikowane przez wyżarzanie oligonukleotydów w celu utworzenia widełek replikacyjnych.  Dodatkowo, biotyna jest dołączona do końca jednej nici λ DNA, a część digoksygeniny jest dołączona do drugiego końca tej samej nici¹.

Materiały: Bakteriofag λ DNA, Oligonukleotydy: biotynylowane ramię widelca (A: 5'-biotyna-AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA CCGCCCAAAAAAAAAAAAAA-digoksygenina-3 '), ligaza DNA T4, kinaza polinukleotydowa T4, blok ciepła.

1. Fosforyluj końce 5' oligonukleotydów B i D za pomocą kinazy polinukleotydowej T4.
2. Wyżarzanie oligonukleotydów A, B i C do λ DNA w jednym kroku, dodając 10-krotny nadmiar oligonukleotydów A i B oraz 100-krotny nadmiar oligonukleotydu C w buforze ligazy DNA T4.
3. Podgrzać mieszaninę do temperatury 65 °C w bloku grzewczym. Po podgrzaniu wyłącz blok grzewczy i pozwól na powolne chłodzenie, aby prawidłowo wyżarzyć oligonukleotydy.
4. Dodaj ligazę DNA T4 do mieszaniny i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 2 godziny.  Ligaza DNA T4 katalizuje prawidłowe łączenie oligonukleotydów A i B oraz λ DNA.
5. Na koniec wyżarzaj oligonukleotyd D do matrycy replikacji DNA, dodając 100-krotny nadmiar oligonukleotydu D w stosunku do l DNA w buforze ligazy DNA T4.
6. Inkubować mieszaninę w temperaturze 45 °C przez 30 minut w bloku grzewczym i powoli schładzać do temperatury pokojowej, wyłączając blok grzewczy.
7. Ostateczna matryca do replikacji DNA jest teraz gotowa do użycia.  Przechowujemy matrycę w stężeniu 1,4 nM w temperaturze 4 °C przez kilka tygodni.

2. Koraliki

Koraliki są funkcjonalizowane fragmentem Fab o specyficznym dla digoksygeniny. Można je następnie dołączyć do matrycy replikacji DNA².

Materiały: kulki aktywowane tozylem, fragment Fab α-digoksygeniny, bufor A: 0,1 M H3BO3 pH 9,5, bufor B: 0,1 M PBS pH 7,4, 0,1% w/v BSA, bufor C: 0,2 M Tris-HCl pH 8,5 (25 °C), 0,1% w/v BSA, Separator magnetyczny, Rotator.

1. Zawiesić roztwór podstawowy kulek i przenieść małą porcję do probówki eppendorfa. Umieścić probówkę w szczelinie separatora magnetycznego i inkubować, aż roztwór się oczyści, a następnie usunąć supernatant przez pipetowanie.
2. Dodaj bufor A, który aktywuje grupy tosylowe do sprzężenia przeciwciał. Delikatnie wymieszać pipetując i usunąć bufor za pomocą separatora magnetycznego.
3. Dodać fragment Fab i ponownie zawiesić kulki w buforze A, dokładnie wymieszać i inkubować przez 16-24 godziny w temperaturze 37 °C za pomocą rotatora. Po inkubacji oddzielić kulki za pomocą separatora magnetycznego i usunąć bufor.
4. Przemyć kulki, dodając bufor B i inkubować w temperaturze 4 °C przez 5 minut. Usunąć bufor za pomocą separatora magnetycznego.  Powtórzyć mycie dwukrotnie.
5. Dodać bufor C i inkubować w temperaturze 37 °C przez 4 godziny w celu zablokowania wolnych grup tosylowych. Oddziel koraliki za pomocą separatora magnetycznego i usuń bufor.
6. Przemyć dwukrotnie w buforze B i podwielokrotności do użycia. Koraliki można przechowywać w temperaturze 4 °C przez 1 rok lub dłużej bez znacznej utraty jakości (nasz roztwór podstawowy zawiera 1-2x10⁹ kulek/ml).

3. Funkcjonalne szkiełka nakrywkowe

Aby umożliwić dołączenie DNA do szkiełka nakrywkowego, szkło jest najpierw funkcjonalizowane za pomocą aminozlanu, który następnie jest sprzężony z biotynylowanymi cząsteczkami PEG. Powłoka ta pomaga zmniejszyć niespecyficzne oddziaływania DNA i białek replikacyjnych z powierzchnią^3,4.

Materiały: Szkiełka nakrywkowe, Słoiki do barwienia, 3-aminopropylotrietoksysilan, Ester metoksy-PEG5k-NHS, Biotyna-PEG5k-NHSester, Aceton, 1M KOH, Etanol, Piekarnik, Sonikator do kąpieli

1. Dokładnie wyczyść szklane szkiełka nakrywkowe, umieszczając je w słoikach do barwienia i napełniając słoiki etanolem. Sonikować przez 30 minut, wypłukać słoiki i napełnić 1 M KOH. Powtórz oba prania.
2. W pierwszej reakcji funkcjonalizacji należy usunąć wszelkie ślady wody. Napełnij słoiki acetonem i sonikuj przez 10 minut. Opróżnij i ponownie napełnij acetonem.
3. Przygotować 2 % v/v roztwór odczynnika silanowego w acetonie. Dodaj do słoików do barwienia i mieszaj przez 2 minuty. Ta reakcja sprzęga grupę alkoksylową aminosilanu ze szkłem, pozostawiając reaktywną aminę na następny etap sprzęgania.  Ugasić reakcję dużym nadmiarem wody.
4. Osusz szkiełka nakrywkowe, piecząc je w temperaturze 110°C w piekarniku przez 30 minut.
5. Przygotować mieszaninę PEG metoksy:biotyna w proporcji 50:1 w 100 mM NaHCO₃ pH 8,2. Celuj w około 0,2% w/v biotynylowanego PEG.
6. Odpipetować 100 μl mieszanki PEG na suche, silanizowane szkiełko nakrywkowe i umieścić na nim kolejne szkiełko nakrywkowe. Dołączenie szklanej przekładki szkiełka nakrywkowego pozwoli na oddzielenie szkiełek nakrywkowych.
7. Inkubować szkiełka nakrywkowe w roztworze PEG przez 3 godziny, a następnie oddzielić każdą parę szkiełek nakrywkowych i obficie przemyć wodą. Uważaj, aby szkiełka nakrywkowe były funkcjonalne stroną do góry, ponieważ tylko jedna strona zostanie pokryta PEG.
8. Wysuszyć szkiełka nakrywkowe powietrzem i przechowywać w próżni w eksykatorze. Powierzchnie pozostają stabilne przez co najmniej miesiąc, dzięki czemu można wykonać dziesiątki szkiełek nakrywkowych w partii i wykorzystać w razie potrzeby.

4. Przygotowanie komory przepływowej

Eksperyment jest przeprowadzany przy użyciu prostej komory przepływowej zbudowanej z funkcjonalnego szkiełka nakrywkowego, dwustronnej taśmy, zjeżdżalni kwarcowej i rurki. Dla każdego doświadczenia z pojedynczą cząsteczką przygotowuje się jedną komorę przepływową^2,4.

Materiały: Dwustronna taśma, żyletka, zjeżdżalnia kwarcowa z otworami na rurki, szybkoschnąca żywica epoksydowa, funkcjonalizowane szkiełko nakrywkowe, roztwór streptawidyny (25 μL 1 mg/ml w PBS), rurka, bufor blokujący (5X: 20 mM Tris pH 7,5, 2 mM EDTA, 50 mM NaCl, 0,2 mg/ml BSA, 0,005% Tween-20), bufor roboczy (1X: 20 mM Tris-HCl pH 7,5, 2 mM EDTA, 50 mM NaCl).

1. Rozpocząć od wymieszania i umieszczenia 5 ml buforu blokującego i 20 ml buforu roboczego w eksykatorze w celu usunięcia pęcherzyków powietrza do późniejszych etapów.
2. Weź szkiełko nakrywkowe funkcjonalizowane PEG i rozprowadź 125 roztworu streptawidyny rozcieńczonego PBS na powierzchni. Pozostaw to do inkubacji przez 20 minut w temperaturze pokojowej, przygotowując inne części komory, pozwalając streptawidynie związać powierzchniowe biotyny.
3. Wytnij kawałek taśmy dwustronnej, aby dopasować go do rozmiaru zjeżdżalni kwarcowej. Zaznacz położenie otworów na rurki na taśmie tak, aby na taśmie można było narysować kontur komory przepływowej.
4. Wykonaj kanał środkowy o szerokości 3 mm i prostokąty zawierające oba otwory. Stosujemy studzienki przepływowe z dwoma kanałami wlotowymi i dwoma wylotowymi w kształcie litery Y.
5. Ciąć wzdłuż narysowanego konturu, wykonując proste, czyste cięcia, aby upewnić się, że żaden klej nie wystaje do kanału.
6. Dokładnie wyczyść kwarc za pomocą acetonu lub etanolu, aby usunąć klej z poprzedniej konstrukcji komory przepływowej.
7. Znajdź najlepsze wyrównanie konturu kanału, usuń jedną stronę podkładu samoprzylepnego i ostrożnie umieść taśmę na szkiełku kwarcowym. Uważaj, aby prawidłowo wyrównać taśmę, ponieważ otwory wlotowe i wylotowe muszą pozostać niezablokowane.
8. Odetnij odcinki rurek do wlotu i wylotu komory przepływowej. Pomaga przeciąć koniec rurki pod kątem około 30°, dzięki czemu rurka nie będzie płasko dociskać się do dna komory. Umieść rurki na jakimś wsporniku (np. stojaku na probówki), aby je zawiesić w celu łatwego zamocowania do komory przepływowej w kolejnych krokach.
9. Szkiełko nakrywkowe pokryte streptawidyną należy dokładnie spłukać wodą i osuszyć sprężonym powietrzem. Pamiętaj, że tylko jedna strona jest funkcjonalizowana. Usuń drugą stronę podkładu taśmy i umieść szkiełko kwarcowe na szkiełku nakrywkowym.
10. Lekko dociśnij szkiełko nakrywkowe, aby wypchnąć powietrze uwięzione w kleju. Pomoże to uniknąć przedostania się pęcherzyków powietrza do kanału przepływowego.
11. Uszczelnij boki komory żywicą epoksydową. Włóż wyciętą rurkę do otworów kwarcu i uszczelnij ją żywicą epoksydową. To musi wyschnąć przez kilka minut.
12. Po wyschnięciu zacznij blokować powierzchnię, przeciągając część odgazowanego bufora blokującego przez jedną z rurek. Igła o rozmiarze 21 idealnie pasuje do rurki 0,76 mm. Przepłucz kilka razy, aby usunąć pęcherzyki powietrza i pozwól komorze inkubować przez co najmniej pół godziny.

5. Eksperyment z replikacją pojedynczych cząsteczek

Gdy szablon DNA i funkcjonalizowane koraliki zostaną przygotowane, a komora przepływowa będzie gotowa, można przeprowadzić eksperyment z pojedynczą cząsteczką.

Materiały: Przygotowana komora przepływowa, Bufor blokujący (5X: 20 mM Tris-HCl pH 7,5, 2 mM EDTA, 50 mM NaCl, 1 mg/mL BSA, 0,025% Tween-20), Bufor roboczy (1X: 20 mM Tris-HCl pH 7,5, 2 mM EDTA, 50 mM NaCl), replikacyjne T7 z lub bez 10mM MgCl₂ (1X: 40 mM Tris-HCl pH 7,5, 50 mM K-glutaminian, 2 mM EDTA, 100 μg/ml BSA, 10 mM DTT, 600 μM dNTPs), białka replikacyjne, odwrócony mikroskop optyczny z obiektywem 10X, kamera CCD, trwały magnes ziem rzadkich, pompa strzykawkowa, sprężyna powietrzna, oświetlacz światłowodowy, komputer z oprogramowaniem do akwizycji obrazu.

1. Po zablokowaniu komory przepływowej jest ona gotowa do rozpoczęcia eksperymentu.
2. Weź komórkę przepływową i umieść ją na stoliku mikroskopu. Przytrzymaj komorę na miejscu za pomocą stage zaciski i upewnij się, że kanał przepływu jest ustawiony w jednej linii z kamerą CCD.
3. Podłącz rurki wylotowe komory przepływowej do sprężyny powietrznej za pomocą rurki łączącej o większej średnicy lub igły. Sprężyna pneumatyczna służy do stabilizacji wszelkich nierówności przepływu. Plastikowa tubka o pojemności 50 ml jest wypełniona 45 ml wody. Wieko tuby jest uszczelnione żywicą epoksydową. W pokrywie przebijane są trzy otwory, a do rurki wkładane są trzy kawałki rurki. Za pomocą żywicy epoksydowej rurki są następnie uszczelniane do pokrywy, zapobiegając przedostawaniu się lub ucieczce powietrza. Sprężyna powietrzna jest podłączona do pompy strzykawkowej oraz do rurek wylotowych komory przepływowej.
4. Umieścić rurki wlotowe komory przepływowej w buforze blokującym i pociągnąć strzykawkę do tyłu, aby usunąć powietrze z rurki. Delikatne przesunięcie rurki wylotowej pomoże usunąć wszelkie pęcherzyki powietrza uwięzione w komorze przepływowej.
5. Po usunięciu wszystkich pęcherzyków powietrza zablokuj igłą jedną z rurek wlotowych, a jedną z rurek wylotowych, zginając ją o 1800 stopni i zabezpieczając rurkę taśmą klejącą.
6. Rozcieńczyć podstawową matrycę DNA do 10 pM w 1 ml odgazowanego buforu blokującego. Przepływ do komory z umiarkowanym natężeniem przepływu, aby umożliwić dobre pokrycie powierzchni DNA (dobrze sprawdza się 0,01-0,05 ml / min przez 20 minut). Można to zmieniać w zależności od tego, ile cząsteczek DNA znajduje się na powierzchni dla każdej partii szkiełek nakrywkowych lub ile jest pożądanych w eksperymencie.
7. Rozcieńczyć roztwór kulek podstawowych do 2-4x10⁶ kulek/ml w 1 ml odgazowanego buforu blokującego. Przepływać do komory w ilości 0,01-0,05 ml/min przez 15 minut.
8. Po dodaniu kulek wyłącz przepływ i pozwól komorze osiągnąć równowagę. Następnie zamknij obie rurki wylotowe. Wszelkie zmiany w probówkach bez zamkniętej komory spowodują wahania ciśnienia, które będą wywierać dużą siłę na kulki i ścinać uwięzione cząsteczki DNA.
9. Zablokuj rurkę wlotową, która była używana do ładowania koralików za pomocą igły i rozpocznij mycie komory przepływowej za pomocą drugiego wlotu z odgazowanym roztworem bufora blokującego 1X w buforze roboczym. Prać intensywnie z szybkością 0,01-0,05 ml/min. Ręcznie zamieszaj stolik, stukając, aby usunąć wszelkie koraliki niespecyficznie przyklejone do powierzchni (Stukanie).
10. Gdy wolne kulki zostaną wystarczająco usunięte, wyłącz przepływ i pozwól komorze osiągnąć równowagę. Zamknij otwartą rurkę wylotową i przełącz zbiornik wlotowy na roztwór białka, powoli otwierając wylot, aby uniknąć gwałtownych zmian ciśnienia
11. Możesz sprawdzić, czy koraliki są przywiązane do DNA, zmieniając kierunek przepływu (DNA).
12. Teraz można przeprowadzić reakcję enzymatyczną. Do eksperymentów syntezy nici wiodącej należy wykonać 20nM roztwór helikazy gp4 i 20nM roztwór polimerazy gp5 (oczyszczony jako kompleks z jego czynnikiem procesowości tioredoksyną) w odgazowanym buforze replikacyjnym T7, który nie zawiera MgCl₂.
13. Wlej roztwór białka do komory z umiarkowaną szybkością przepływu, aby umożliwić skuteczne wiązanie z DNA.  Używamy 0,037 ml/min przez 8 minut, a następnie 0,012 ml/min przez 7 minut.
14. Przemyć komorę odgazowanym buforem replikacyjnym T7 bez MgCl₂ w celu usunięcia wolnych białek. Szybkość 0,037 ml/min przez 3-10 minut działa dobrze.
15. Po umyciu przelej bufor replikacyjny T7 z MgCl₂ i rozpocznij akwizycję danych. Stosować natężenie przepływu 0,012 ml/min odpowiadające sile oporu 3 pN działającej na pęta DNA w warunkach opisanych w niniejszym protokole.
16. Przed obrazowaniem umieść magnes trwały ziem rzadkich nad komórką przepływową, aby zapobiec niespecyficznym interakcjom między kulkami a powierzchnią.
17. Pole widzenia z obiektywem 10X i kamerą CCD. Ustaw ostrość za pomocą koralika na uwięzi.
18. Umieść oświetlacz światłowodowy pod kątem padania między 10 stopni i równolegle do stolika mikroskopu w pobliżu mikroskopu. Oświetlenie ciemnego pola służy do zwiększenia kontrastu w obrazowaniu ściegów.
19. Zbieraj dane przez 20 30 minut z niską częstotliwością odświeżania (zwykle 2-4 Hz).

6. Reprezentatywne wyniki

W udanym eksperymencie powinieneś być w stanie obserwować więcej niż 100 koralików jednocześnie (Synteza nici wiodącej). Eksperyment powinien przynieść liczne ślady wskazujące na syntezę wiodącej nici DNA.

Analiza danych:

Aby zmierzyć szybkość i przebieg procesu odwijania i polimeryzacji DNA, należy określić dokładne pozycje koralików. Możesz to osiągnąć, dopasowując te pozycje do 2-wymiarowych funkcji Gaussa. Trajektorie można następnie wyodrębnić, śledząc pozycję ściegu w każdej klatce za pomocą oprogramowania śledzącego (np. DiaTrack). Teraz jesteś gotowy do wizualizacji trajektorii poprzez wykreślenie pozycji ściegu w funkcji czasu za pomocą dowolnego oprogramowania graficznego (np. Origin). Aby uzyskać dane dotyczące szybkości, dopasuj wykresy do regresji liniowej i oblicz nachylenie. W przypadku procesywności należy określić całkowitą długość DNA od początku do końca zdarzenia skracania (ryc. 3). Obie te liczby będą musiały zostać przekonwertowane na pary podstawowe. Aby przekształcić ruch kulek w pary zasad, najpierw musisz zmierzyć długość rozciągniętej cząsteczki λ DNA przy szybkości przepływu reakcji. Ponieważ długość λ DNA jest znana (48 502 pz), można skalibrować liczbę par zasad/piksel przy sile eksperymentalnej. Aby zwiększyć dokładność, odejmij od śladów zainteresowania podstawowy ślad uwięzi koralików, która nie jest zmieniona enzymatycznie. Połącz wszystkie pojedyncze pomiary i wykreśl rozkłady szybkości i procesowości. Dopasuj dane odpowiednio za pomocą funkcji Gaussa i funkcji jednowykładniczej (Rysunek 3).

Rysunek 1. Konfiguracja eksperymentalna pojedynczej cząsteczki. (a) Duplex λ DNA (48,5 kb) jest przyłączony do powierzchni komórki przepływowej poprzez koniec 5' jednej nici za pomocą interakcji biotyna-streptawidyna, a koniec 3' tej samej nici jest przyłączony do kulki za pomocą interakcji digoksygeniny z antydigoksygeniną. Na końcu naprzeciwko ściegu tworzy się zagruntowany widelec replikacyjny, aby umożliwić ładowanie polimerazy. (b) Zespoły perełkowe DNA są rozciągane za pomocą laminarnego przepływu bufora i obrazowane za pomocą mikroskopii optycznej o szerokim polu. Śledząc położenie kulek w czasie, przy zachowaniu stałej siły rozciągającej, można monitorować długości konstruktów DNA. (c) Profil rozciągnięcia ssDNA (wypełniony krąg) i dsDNA (otwarty krąg) pod wpływem małych sił. Linia przerywana przedstawia długość krystalograficzną DNA w pełni ds-λ, wynoszącą 16,3 μm. Duża różnica w długości między ssDNA i dsDNA przy siłach około 3 pN pozwala na bezpośrednią obserwację konwersji między ss- i dsDNA poprzez monitorowanie zmian długości DNA. Jednoczesna wizualizacja dużej liczby kulek sprzężonych z DNA pozwala na badanie wielu pojedynczych replikosomów w jednym eksperymencie.

Rysunek 2. Białka replikacyjne bakteriofagów T7: polimeraza DNA (kompleks gp5 i tioredoksyny) i helikaza DNA (gp4) syntetyzują wiodącą nić DNA w obecności dezoksyrybonukleotydów i magnezu. Procesowi temu towarzyszy skrócenie opóźnionej nici DNA w wyniku zwijania. Konwersja dsDNA do ssDNA zmienia położenie kulki. Pozycja pomiarowa kulki pozwala na precyzyjne określenie szybkości i procesywności replikacji DNA.

Rysunek 3. Przykład typowych danych z eksperymentu syntezy pojedynczej cząsteczki nici wiodącej. Procesywność replikacji DNA jest równa całkowitej długości DNA od początku do końca zdarzenia skracającego. Szybkość replikacji DNA uzyskuje się poprzez dopasowanie wykresu do regresji liniowej i obliczenie nachylenia. Wstawka pokazuje rozkłady szybkości i procesywności, które uzyskano przez połączenie danych z wielu pomiarów. Dane dopasowano odpowiednio za pomocą funkcji Gaussa i funkcji jednowykładniczej.

Dyskusja

Ważne jest, aby upewnić się, że siła oporu wywierana na kulki przez przepływ laminarny nie wpływa na aktywność enzymatyczną białek replikacyjnych. Na przykład siła 3 pN, która odpowiada natężeniu przepływu 0,012 ml/min, nie wpływa na replikację wiodącej nici DNA. Wpływa jednak na aktywność enzymatyczną, która zachodzi podczas skoordynowanej syntezy DNA, i dlatego musi zostać zredukowana do 1,5 pN. Siłę oporu można łatwo kontrolować, zmieniając natężenie przepływu lub szerokość kanału przepływu⁵.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Bakteriofag λ DNA	New England Biolabs	N3011L
Oligonukleotydy DNA	Zintegrowane technologie
Ligaza DNA T4	New England Biolabs	M0202L
T4 Kinaza polinukleotydowa	New England Biolabs	M0201L
&alfa;-digoksygenina Fab	Roche Group	11214667001
Koraliki	aktywowane tosylemInvitrogen	142-03
Separator magnetyczny	Invitrogen	Dynal MPC
3-aminopropylo-trietoksysilan	Sigma-Aldrich	A3648	Inne aminozalany mogą być stosowane lub mieszane z niereaktywnymi aminami silanami na rzadszych powierzchniach
Propionian sukcynimidylu PEG	Nektar		Podobne PEG-i można kupić w Nanocs, CreativePEGWorks itp.
Biotin-PEG-NHS	Nektar		Podobne PEG-i można kupić w Nanocs, CreativePEGWorks itp.
Taśma dwustronna	Grace Bio-Lab Inc.	SA-S-1L	100 μ m
grubość Zjeżdżalnia kwarcowa	Szkło techniczne	20 mm (szer.) x 50 mm (dł.) x 1 mm (wys.)	Rozmiar pasujący do szkiełek nakrywkowych. Wiercenie otworów za pomocą wierteł z końcówką diamentową (DiamondBurs.net)
Rurki polietylenowe	BD Biosciences	427416	0,76 mm ID, 1,22 OD Można zastąpić rurki o innym rozmiarze.
Streptawidyna	Sigma-Aldrich	S4762	Przygotować 1 mg/ml roztwór, 25 μ Porcje L w PBS pH 7,3
Mieszanina roztworu trifosforanu dezoksyrybonukleotydu	New England Biolabs	N0447
Odwrócony mikroskop optyczny z 10-krotnym obiektywem	Olympus Corporation	Olympus IX-51
Trwały magnes ziem rzadkich	Import krajowy	www.rare-earth-magnets.com
Kamera CCD	QImaging	Rolera-XR Fast 139
Pompa strzykawkowa	Harvard Apparatus	11 Plus	Działa w trybie napełniania, aby ułatwić zmianę roztworu
Fiber Illuminator	Thorlabs Inc.	OSL1