Opisujemy metodę obserwacji replikacji pojedynczych cząsteczek DNA w czasie rzeczywistym, pośredniczonej przez białka systemu replikacyjnego bakteriofaga.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Bezpośrednia obserwacja enzymów replikujących DNA z wykorzystaniem testu rozciągania pojedynczej cząsteczki DNA
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Opisujemy metodę obserwacji w czasie rzeczywistym replikacji pojedynczych cząsteczek DNA pośredniczonej przez białka systemu replikacyjnego bakteriofaga. Linearyzowane DNA $\lambda$ zostaje zmodyfikowane w taki sposób, aby na końcu jednej nici znajdowała się biotyna, a na drugim końcu tej samej nici grupa digoksygeniny. Koniec biotylowany zostaje przyłączony do funkcjonalizowanej szkiełka przedmiotowego, a koniec digoksygenylowany do małego koralika. Montaż tych powiązań DNA-koralik na powierzchni komory przepływowej pozwala na zastosowanie przepływu laminarnego w celu wywarcia siły oporu na koralik. W rezultacie DNA zostaje rozciągnięte blisko i równolegle do powierzchni szkiełka pod wpływem siły określonej przez szybkość przepływu (Rycina 1). Długość DNA jest mierzona poprzez monitorowanie pozycji koralika. Różnice w długości między jednoniciowym a dwuniciowym DNA są wykorzystywane do uzyskania informacji w czasie rzeczywistym na temat aktywności białek replikacyjnych w widelcu replikacyjnym. Pomiar pozycji koralika pozwala na precyzyjne określenie szybkości i procesywności rozplatania oraz polimeryzacji DNA (Rycina 2).
Protokół
1. Matryca replikacji DNA
DNA do reakcji to linearyzowany λ DNA zmodyfikowany poprzez przyłączanie oligonukleotydów w celu utworzenia widelca replikacyjnego. Dodatkowo, do końca jednej nici λ DNA przyłączona jest biotyna, a do drugiego końca tej samej nici przyłączona jest grupa digoksygeniny1.
Materiały: DNA bakteriofaga λ, oligonukleotydy: biotynilowane ramię widełki (A: 5'-biotin-AAAAAAAAAAAAAAAAGTACTGTACGATCTAGCATCAATCACAGGGTCAGGTTCGTTATTGTCCAACTTGCTGTCC-3'), ramię widełki komplementarne do λ (B: 5'-GGGCGACCTGGACAGCAAGTTG GACAATCTCGTTCTATCACTAATTCACTAATGCAGGGAGGATTTCAGATGGCA-3'), ....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Ważne jest, aby upewnić się, że siła oporu wywierana na koraliki przez przepływ laminarny nie wpływa na aktywność enzymatyczną białek replikacyjnych. Na przykład siła 3 pN, odpowiadająca szybkości przepływu 0,012 ml/min, nie wpływa na replikację nici wiodącej DNA. Wpływa ona jednak na aktywności enzymatyczne zachodzące podczas skoordynowanej syntezy DNA, dlatego musi zostać zredukowana do 1,5 pN. Siłę oporu można łatwo kontrolować poprzez zmianę szybkości przepływu lub szerokości kanału przepływowego5.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Podziękowania
Opracowanie testu rozciągania DNA odbyło się przy wsparciu Paula Blaineya, Jong-Bonga Lee i Samira Hamdana. Praca ta jest finansowana z grantów National Institutes of Health przyznanych Charlesowi Richardsonowi (GM54397) oraz Antoine van Oijenowi (GM077248).
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| DNA bakteriofaga λ | New England Biolabs | N3011L | |
| Oligonukleotydy DNA | Integrated DNA Technologies | ||
| Ligaza DNA T4 | New England Biolabs | M0202L | |
| Polinukleotydowa kinaza T4 | New England Biolabs | M0201L | |
| Fab α-digoksygeniny | Roche Group | 11214667001 | |
| Kulek aktywowane tosylanem | Invitrogen | 142-03 | |
| Separator magnetyczny | Invitrogen | Dynal MPC | |
| 3-aminopropylotrietoksysilan | Sigma-Aldrich | A3648 | Można stosować inne aminosilany lub mieszać je z silanami niereaktywnymi względem grup aminowych w celu uzyskania rzadszych powierzchni |
| PEG z propionianem sukcynimidylowym | Nektar | Podobne PEG-i można nabyć w firmach Nanocs, CreativePEGWorks itp. | |
| Biotyna-PEG-NHS | Nektar | Podobne PEG-i można nabyć w firmach Nanocs, CreativePEGWorks itp. | |
| Taśma dwustronna | Grace Bio-Lab Inc. | SA-S-1L | grubość 100 μm |
| Szkiełko kwarcowe | Technical Glass | 20 mm (S)x 50 mm (D)x 1mm (W) | Rozmiar dopasowany do szkiełek nakrywkowych. Wiercić otwory wiertłami z końcówką diamentową (DiamondBurs.net) |
| Przewody polietylenowe | BD Biosciences | 427416 | ID 0,76 mm, OD 1,22 Można zastąpić przewodami o innych rozmiarach. |
| Streptawidyna | Sigma-Aldrich | S4762 | Przygotować roztwór 1 mg/mL, alikwoty 25 μL w PBS pH 7,3 |
| Mieszanina roztworów trifosforanów deoksyrybonukleotydowych | New England Biolabs | N0447 | |
| Odwrócony mikroskop optyczny z obiektywem 10X | Olympus Corporation | Olympus IX-51 | |
| Stały magnes ziemi rzadkich | National Imports | www.rare-earth-magnets.com | |
| Kamera CCD | QImaging | Rolera-XR Fast 139 | |
| Pompa strzykawkowa | Harvard Apparatus | 11 Plus | Uruchamiać w trybie dopełniania, aby ułatwić wymianę roztworów |
| Iluminator światłowodowy | Thorlabs Inc. | OSL1 |
Bibliografia
- Lee, J. B. DNA primase acts as a molecular brake in DNA replication. Nature. 439, 621-624 (2006).
- Tanner, N. A., van Oijen, A. M. Single-molecule observation of prokaryotic DNA replication. Methods Mol Biol. 521, 397-410 (2009).
- Sofia, S. J., Premnath, V. V., Merril....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
