Indukcja toksyn i ekstrakcja białek z kultur Fusarium spp. do badań proteomicznych

Podsumowanie

Ekstrakcja białek do analiz proteomicznych u gatunków grzybów wymaga wysokiego poziomu standaryzacji, aby została przeprowadzona zgodnie z wytycznymi dotyczącymi minimalnych informacji o eksperymencie proteomicznym (MIAPE). Przedstawiamy protokół wideo, który obejmuje procedurę minimalizacji błędów doświadczalnych podczas indukcji toksyn i ekstrakcji białek z Fusarium spp.

Streszczenie

Fusaria to grzyby nitkowate zdolne do produkcji różnych toksyn. Mikotoksyny Fusarium, takie jak deoksyniwalenol, niwalenol, T2, zearalenon, kwas fusarowy, moniliformina itd., wywierają niekorzystny wpływ na zdrowie ludzi i zwierząt, a niektóre z nich są uznawane za czynniki patogenności. Badania proteomiczne okazały się skuteczne w rozszyfrowywaniu mechanizmów produkcji toksyn (Taylor et al., 2008), a także w identyfikacji potencjalnych czynników patogennych (Paper et al., 2007, Houterman et al., 2007) u Fusaria. Dlatego podstawowe staje się opracowanie wiarygodnych metod porównywania badań proteomicznych, aby można było polegać na rzeczywistych różnicach w ekspresji białek stwierdzonych pomiędzy eksperymentami, szczepami i laboratoriami. Opisywana procedura powinna przyczynić się do zwiększenia stopnia standaryzacji procedur proteomicznych na dwa sposoby. Nagrany protokół służy do zwiększenia poziomu szczegółów, które mogą zostać precyzyjnie opisane. Ponadto dostępność ustandaryzowanych procedur przetwarzania powtórzeń biologicznych powinna zagwarantować większą odporność danych, uwzględniając również czynnik ludzki w ramach powtarzalności technicznej procedury ekstrakcji.

Opisany protokół wymaga 16 dni na jego ukończenie: czternastu dni na hodowle oraz dwóch dni na ekstrakcję białek (rycina 1).

Krótko mówiąc, szczepy Fusarium hoduje się na podłożach stałych przez 4 dni; następnie są one ręcznie fragmentowane i przenoszone do zmodyfikowanego podłoża indukującego produkcję toksyn (Jiao et al., 2008) na 10 dni. Grzybnię zbiera się poprzez filtrację przez warstwę Miracloth. Rozcieranie przeprowadza się w komorze chłodniczej. Różni operatorzy przeprowadzili powtórzenia ekstrakcji (n=3), aby uwzględnić błędy wynikające z wariacji technicznych (rycina 2). Ekstrakcję oparto na buforze SDS/DTT zgodnie z opisem w Taylor et al. (2008) z niewielkimi modyfikacjami. Ekstrakcja białek całkowitych wymagała procesu wytrącania białek przy użyciu buforu Aceton/TCA/DTT przez noc oraz przemywania Acetonem/DTT (rycina 3a, 3b). Białka zostały ostatecznie ponownie rozpuszczone w buforze do znakowania białek i poddane kwantyfikacji. Wyniki ekstrakcji zwizualizowano na żelu 1D (rycina 4, SDS-PAGE) przed przejściem do żeli 2D (IEF/SDS-PAGE). Tę samą procedurę można zastosować do analiz proteomicznych na innych podłożach wzrostowych i u innych grzybów nitkowatych (Miles et al., 2007).

Protokół

Protokół wymaga 16 dni do jego ukończenia. Harmonogram przedstawiono szczegółowo na rysunku 1.

Szczegóły przygotowania buforu

• Przygotowanie buforu do lizy (3mL na próbkę).
• Przygotowanie buforu do płukania (50mL na próbkę). Bufor ten należy uprzednio schłodzić i przechowywać w zamrażarce w temperaturze -20°C do momentu analizy, a w trakcie całej procedury utrzymywać na lodzie.
• Przygotowanie buforu do precypitacji (20mL na próbkę). Bufor ten należy uprzednio schłodzić i przechowywać w zamrażarce w temperaturze -20°C do momentu użycia, a w trakcie całej procedury utrzymywać na lodzie.
• Prace powinny być prowadzone preferencyjnie w komorze chłodniczej w temperaturze 4°C.

Gatunki grzybów

Trzy szczepy wykorzystane do analiz proteomicznych sklasyfikowano jako Fusarium graminearum na podstawie ich cech morfologicznych oraz analizy czynnika elongacji translacji alfa-1 (O'Donnell et al., 198)

Szczepy te pochodziły z kolekcji CRP-Gabriel Lippmann i były przechowywane w temperaturze - 80°C w 15% glicerolu.

Przygotowanie grzybni

Grzyby hodowano na podłożu V8 przez 4 dni w temperaturze 25°C, z cyklem 12-godzinnych okresów światła i ciemności. Kultury pofragmentowano za pomocą sterylnego ostrza, a następnie fragmenty tych kultur wykorzystano do zaszczepienia kolb Erlenmeyera o pojemności 250 ml zawierających 10 mL pożywki indukującej produkcję toksyn. Grzybnię zebrać po 10 dniach, oddzielając ją od pożywki poprzez przefiltrowanie kultury za pomocą sterylnego filtra. Grzybnię przemyto 3 razy sterylną wodą w celu usunięcia pozostałości pożywki oraz innych związków. Następnie komórki bezzwłocznie zamrożono poprzez dodanie ciekłego azotu i przechowywano próbki w temperaturze -80°C.

Ogólny opis ekstrakcji białek

Próbki białek wyekstrahowano metodą opisaną na rysunkach 3A i 3B. Próbki Fusarium utarto w ciekłym azocie, a proszek zebrano do teflonowych probówek o pojemności 10 ml. Następnie próbki inkubowano przez 30 minut z buforem do lizy, gotowano przez 10 minut i odwirowano dwukrotnie w temperaturze pokojowej (120g przez 15 minut). Nadlodówki zebrano i inkubowano przez noc w temperaturze -20 °C z buforem do wytrącania. Po wirowaniu przy 4°C i 30g przez 45 minut osady wytrąconych białek przemyto 3 razy zimnym acetonem zawierającym DTT. Na koniec osady wysuszono na powietrzu, a białka rozpuszczono ponownie w buforze do znakowania, dostosowując pH do 8. Pobrano podpróbkę o objętości 30 ml do ilościowego oznaczenia całkowitego białka, a pozostałą nadlodówkę przechowywano w temperaturze -20 °C do czasu przeprowadzenia elektroforezy białek.

Rysunek 1. Harmonogram procedury.

Rysunek 2. Schemat przetwarzania próbek przez wielu operatorów.

Rysunek 3a.

Rycina 3b. Proszę kliknij tutaj aby zobaczyć powiększoną wersję rysunku 3a, lub Proszę podać tekst źródłowy do tłumaczenia. w celu uzyskania powiększonej wersji rysunku 3b.

Rysunki 3a-b. Schematy blokowe procedury ekstrakcji białek (A: pierwszy dzień; B: drugi dzień).

Rysunek 4. Obraz 1D ekstraktów białkowych. Białka były prowadzone aż do pełnej migracji barwnika niebieskiego do końca żelu, który następnie zbarwiono barwnikiem Lava Purple. kliknij tutaj aby zobaczyć powiększoną wersję rysunku 4.

Dyskusja

Niedawne zainteresowanie podejściami proteomicznymi w dziedzinie biologii grzybów doprowadziło do zwiększenia liczby publikacji wykorzystujących tę technikę (zgodnie z przeglądem w Kim et al., 2007). Metody ekstrakcji białek opierają się na kombinacji procedur ekstrakcyjnych; są one często słabo opisane w sekcjach metodologicznych i wymagają doświadczenia w zakresie potencjalnych metod rozwiązywania problemów.

Podobnie jak w przypadku innych podejść typu „omika”, ustanowienie standardów przetwarzania próbek i danych jest niezbędne w celu wygenerowania wiarygodnych informacji naukowych. Ponadto próbki oraz procedury manipulacji powinny być odpowiednio opisane, aby umożliwić wspólną interpretację wyników pomiędzy różnymi eksperymentami „omicznymi”. Byłoby to kluczowe dla pełnego wykorzystania potencjału cross-data mining w genomice, proteomice, metabolomice itd. (Morrison et al., 2006). Opracowano minimalny zestaw informacji na temat eksperymentu proteomicznego (MIAPE) i powołano grupy robocze w celu omówienia wszystkich aspektów eksperymentu (elektroforeza w żelu, spektrometria mas, oddziaływania molekularne, modyfikacje białek, informatyka proteomiczna, przygotowanie próbek). Obecnie nie dostępne są żadne zdefiniowane informacje na temat procedur przygotowania próbek. Biorąc pod uwagę znaczenie procedur ekstrakcji białek w określaniu końcowej jakości badań proteomicznych, w celu wdrożenia procedur mogących zwiększyć standaryzację w ramach wytycznych MIAPE (Taylor et al., 2007), zaproponowaliśmy zastosowanie protokołu wideo szczegółowo opisującego przygotowanie próbek. Opis eksperymentów w formie wideo może w znacznym stopniu przyczynić się do zwiększenia ilości informacji o przygotowaniu próbek, co może przełożyć się na lepszą powtarzalność eksperymentów „omicznych” (Pasquali, 2007).

W rzeczywistości powtarzalność międzylaboratoryjna jest fundamentalnym wymogiem w celu zagwarantowania ważności wyników proteomicznych (http://www.fixingproteomics.org). Na powtarzalność międzylaboratoryjną wpływają dwa czynniki: różnice w instrumentacji oraz różni operatorzy manipulujący próbkami.

W opisanym protokole proponujemy przeprowadzenie replikatów biologicznych z udziałem wielu operatorów (Ryc. 2 i wideo) w celu zwiększenia niezawodności danych (tj. uwzględnienia technicznej zmienności wyników).

Opisana procedura ekstrakcji białek opiera się na zastosowaniu SDS i ogrzewaniu. Wykazano wcześniej, że metoda ta gwarantuje wysoką czystość i ilość uzyskiwanych białek (Bridge 1996). SDS w połączeniu z gotowaniem rozpuszcza ściany komórkowe, białka hydrofobowe oraz zapobiega tworzeniu się oligomerów, które mogą utrudniać wytrącanie białek. Gotowanie umożliwia również inaktywację proteaz. Podobny efekt wywołują EDTA, PMSF oraz kompletny mini inhibitor proteaz. DTT usuwa mostki dwusiarczkowe wewnątrz i pomiędzy białkami, co ułatwia ich solubilizację.

W celu usunięcia SDS przed IEF białka są wytrącane za pomocą acetonu/TCA/DTT. Co więcej, wytrącanie acetonem/TCA/DTT pozwala na usunięcie niektórych zanieczyszczeń, takich jak lipidy, kwasy nukleinowe, sole lub/i związki fenolowe, jeśli są one obecne. Podobnie jak SDS, cząsteczki te utrudniają prawidłową migrację podczas IEF. Po tym wytrącaniu konieczne jest przemycie wytrąconych białek acetonem/DTT w celu usunięcia TCA, ponieważ może on zakłócać przebieg IEF.

Prawidłowe przygotowanie próbki jest kluczem do uzyskania dobrych wyników. W tym celu niezbędne jest unikanie kontaminacji białek z otoczenia poprzez pracę w rękawiczkach bezpudrowych oraz przestrzeganie zasad dobrej praktyki laboratoryjnej. Z technicznego punktu widzenia, w ramach opisanego protokołu, najbardziej krytycznymi etapami pozwalającymi na uzyskanie odpowiedniej ilości i czystości białek są dwie fazy. Pierwszą jest faza rozcierania, w której kluczowe dla uwolnienia białek jest całkowite zniszczenie komórki; drugą zaś oczyszczanie białek całkowitych, obejmujące usunięcie większości lipidów, DNA i innych zanieczyszczeń, które mogłyby zakłócać migrację białek.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Pożywki i roztwory PDA: 39 g agaru ziemniaczano-dekstrozowego (Difco); 1 L wody destylowanej. agar V8: 200 ml V8 (campbell’USA), 2 g CaCO3 (Sigma), 16 g agaru (DIFCO), 800 ml wody destylowanej Pośrodki indukujące produkcję toksyn: 1 g K2HPO4, 0,5 g KCl, 0,5 g MgSO4 7H2O, 10 mg FeEDTA, 2 g kwasu L-glutaminowego, 10 g sacharozy w 1 l wody destylowanej. Bufor lizy:
	100 ml	Stężenie końcowe
Tris-HCl pH 8	5 ml	50 mM	1 M
SDS	2 g lub 10 ml	2%	20%
DTT	500 ml	10 mM	2 M
EDTA	20 ml	0,1 mM	0,5 M
PMSF	200 ml
Kompletny mini inhibitor proteaz	1 tabletka
Woda	Qsp

Bufor do wytrącania:

100 ml Stężenie końcowe TCA 20 ml 20% DTT 0,1 ml 0.1% Aceton Qsp

Bufor płuczący:

100 ml Stężenie końcowe DTT 0,1 ml 0.1% Aceton 100 ml

Bufor do znakowania (przechowywać w -18°C w małych alikwotach):

1 ml Stężenie końcowe Mocznik 140 mg 7M Tiochniklista 50 mg 2 M CHAPS 40 mg 4% Tris 30 μL 30 mM Woda 1 mL