Pomiar utlenowania krwi mózgowej oparty na zależnym od tlenu wygaszaniu fosforescencji

Podsumowanie

Przedstawiamy procedurę eksperymentalną pomiaru ciśnienia parcjalnego tlenu (pO2) w naczyniach krwionośnych mózgu, opartą na zależnym od tlenu wygaszaniu fosforescencji. Opisano procedury przygotowania zwierząt oraz obrazowania zarówno dla obrazowania pO2 w szerokim polu widzenia z wykorzystaniem detektora CCD u szczurów, jak i obrazowania pO2 opartego na dwufotonowym wzbudzeniu u myszy.

Streszczenie

Monitorowanie charakterystyki czasowo-przestrzennej utlenowania krwi i tkanek mózgu jest kluczowe dla lepszego zrozumienia zależności neuro-metaboliczno-naczyniowych. Opracowanie nowych metod pomiaru pO2, umożliwiających jednoczesne monitorowanie pO2 w szerszych polach widzenia przy wyższej rozdzielczości przestrzennej i/lub czasowej, pozwoli na głębszy wgląd w funkcjonowanie zdrowego mózgu, a także będzie miało istotny wpływ na diagnostykę i leczenie chorób naczyniowo-mózgowych, takich jak udar, choroba Alzheimera oraz urazy głowy.

Metody obrazowania optycznego wykazują ogromny potencjał w zapewnianiu wysokiej rozdzielczości czasowo-przestrzennej oraz ilościowego obrazowania pO2 w oparciu o absorpcję hemoglobiny w zakresie widzialnym i bliskiej podczerwieni widma optycznego. Jednak wielospektralny pomiar utlenowania krwi w mózgu opiera się na migracji fotonów przez silnie rozpraszającą tkankę mózgową. Do dokładnej oceny utlenowania krwi zazwyczaj wymagana jest estymacja i modelowanie parametrów optycznych tkanki, które mogą ulegać dynamicznym zmianom w trakcie eksperymentu. Z drugiej strony, estymacja ciśnienia parcjalnego tlenu (pO2) oparta na zależnym od tlenu wygaszaniu fosforescencji nie powinna być w znacznym stopniu wpływana przez zmiany parametrów optycznych tkanki i zapewnia bezwzględny pomiar pO2. Systemy eksperymentalne wykorzystujące barwniki wrażliwe na tlen zostały zaprezentowane w badaniach in vivo perfundowanej tkanki, a także w monitorowaniu zawartości tlenu w hodowlach tkankowych, co wykazało, że wygaszanie fosforescencji jest skuteczną technologią zdolną do dokładnego obrazowania tlenu w fizjologicznym zakresie pO2.

W niniejszym materiale demonstrujemy, przy użyciu dwóch różnych modalności obrazowania, sposób pomiaru pO2 w naczyniach korowych oparty na obrazowaniu czasu życia fosforescencji. W pierwszej demonstracji przedstawiamy obrazowanie pO2 w szerokim polu widzenia na powierzchni kory szczura. Ta modalność obrazowania opiera się na stosunkowo prostym układzie eksperymentalnym wykorzystującym kamerę CCD i impulsowy zielony laser. Przedstawiono przykład monitorowania korowej depresji rozprzestrzeniającej się na podstawie czasu życia fosforescencji barwnika Oxyphor R3. W drugiej demonstracji prezentujemy wysokorozdzielcze dwufotonowe obrazowanie pO2 w mikro naczyniach korowych myszy. Układ eksperymentalny obejmuje zbudowany na zamówienie mikroskop dwufotonowy z laserem femtosekundowym, modulatorem elektrooptycznym i fotopowielaczem z licznikiem fotonów. Przedstawiamy przykład obrazowania heterogeniczności pO2 w mikro naczyniach korowych, w tym w kapilarach, przy użyciu nowego barwnika PtP-C343 o zwiększonym przekroju czynnym wzbudzenia dwufotonowego.

Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiązany artykuł Synteza i kalibracja fosforescencyjnych nanoprobników do obrazowania tlenu w systemach biologicznych.

Protokół

1. Obrazowanie szerokopolowe pO2 w naczyniach krwionośnych kory mózgu szczura

1. Szczury (250 g -350 g) są wstępnie znieczulane izofluranem, a tętnica i żyła udowa są kanulowane w celu monitorowania tętna, ciśnienia tętniczego i gazometrii krwi, a także do infuzji dożylnej. Temperaturę ciała utrzymuje się na poziomie 37 ± 0,1 °C. Wykonuje się tracheotomię, a szczury są wentylowane mieszanką powietrza i tlenu.
2. Próbki krwi do pomiaru gazów krwi pobiera się co 30-45 min, a wentylację i znieczulenie dostosowuje się tak, aby utrzymać gazy krwi w normalnym zakresie fizjologicznym.
3. Do obrazowania przygotowuje się zamknięte okno czaszkowe na ko....

Dyskusja

Przedstawiliśmy dwa zastosowania pomiaru pO2 w mikrokrążeniu korowym oparta na zależnym od tlenu wygaszaniu fosforescencji. Podczas gdy pierwsza metoda, oparta na obrazowaniu CCD, zapewnia monitorowanie pO2 w szerokim polu widzenia, pomiar ciśnienia parcjalnego tlenu w mikrokrążeniu korowym z wykorzystaniem mikroskopii dwufotonowej zapewnia rozdzielczość kapilarną i umożliwia obrazowanie w głębszych warstwach. Obie metody zapewniają pomiary o wysokiej szybkości i wysokim stosunku sygnału do szumu. Ponadto pomiar pO2 opar.......

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Glikopirolanu	Odczynnik	American Regent Inc.	NDC 0517-4605-25	Stosowany do kontrolowania wydzieliny gardłowej, tchawiczej i oskrzelowej.
Chlorowodorek lidokainy	Odczynnik	Hospira Inc.	NDC 0409-4277-01	Stosowany jako miejscowe znieczulenie podczas operacji.
Izofluran	Odczynnik	Baxter Internationl Inc.	NDC 10019-360-40	Stosowany jako ogólny anestetyk wziewny podczas operacji oraz jako znieczulenie ogólne podczas eksperymentów z myszami.
Alfa-chloraloza	Odczynnik	Sigma-Aldrich	C0128	Stosowana jako znieczulenie ogólne podczas eksperymentów ze szczurami.
Dekstran – izotiocyjanian fluoresceiny	Odczynnik	Sigma-Aldrich	FD2000S	Podawany w celu uzyskania stężenia ~ 500 nM we krwi.