Pomiar utlenowania krwi mózgowej oparty na zależnym od tlenu wygaszaniu fosforescencji

Podsumowanie

Przedstawiamy procedurę eksperymentalną pomiaru ciśnienia parcjalnego tlenu (pO2) w naczyniach krwionośnych mózgu, opartą na zależnym od tlenu wygaszaniu fosforescencji. Opisano procedury przygotowania zwierząt oraz obrazowania zarówno dla obrazowania pO2 w szerokim polu widzenia z wykorzystaniem detektora CCD u szczurów, jak i obrazowania pO2 opartego na dwufotonowym wzbudzeniu u myszy.

Streszczenie

Monitorowanie charakterystyki czasowo-przestrzennej utlenowania krwi i tkanek mózgu jest kluczowe dla lepszego zrozumienia zależności neuro-metaboliczno-naczyniowych. Opracowanie nowych metod pomiaru pO2, umożliwiających jednoczesne monitorowanie pO2 w szerszych polach widzenia przy wyższej rozdzielczości przestrzennej i/lub czasowej, pozwoli na głębszy wgląd w funkcjonowanie zdrowego mózgu, a także będzie miało istotny wpływ na diagnostykę i leczenie chorób naczyniowo-mózgowych, takich jak udar, choroba Alzheimera oraz urazy głowy.

Metody obrazowania optycznego wykazują ogromny potencjał w zapewnianiu wysokiej rozdzielczości czasowo-przestrzennej oraz ilościowego obrazowania pO2 w oparciu o absorpcję hemoglobiny w zakresie widzialnym i bliskiej podczerwieni widma optycznego. Jednak wielospektralny pomiar utlenowania krwi w mózgu opiera się na migracji fotonów przez silnie rozpraszającą tkankę mózgową. Do dokładnej oceny utlenowania krwi zazwyczaj wymagana jest estymacja i modelowanie parametrów optycznych tkanki, które mogą ulegać dynamicznym zmianom w trakcie eksperymentu. Z drugiej strony, estymacja ciśnienia parcjalnego tlenu (pO2) oparta na zależnym od tlenu wygaszaniu fosforescencji nie powinna być w znacznym stopniu wpływana przez zmiany parametrów optycznych tkanki i zapewnia bezwzględny pomiar pO2. Systemy eksperymentalne wykorzystujące barwniki wrażliwe na tlen zostały zaprezentowane w badaniach in vivo perfundowanej tkanki, a także w monitorowaniu zawartości tlenu w hodowlach tkankowych, co wykazało, że wygaszanie fosforescencji jest skuteczną technologią zdolną do dokładnego obrazowania tlenu w fizjologicznym zakresie pO2.

W niniejszym materiale demonstrujemy, przy użyciu dwóch różnych modalności obrazowania, sposób pomiaru pO2 w naczyniach korowych oparty na obrazowaniu czasu życia fosforescencji. W pierwszej demonstracji przedstawiamy obrazowanie pO2 w szerokim polu widzenia na powierzchni kory szczura. Ta modalność obrazowania opiera się na stosunkowo prostym układzie eksperymentalnym wykorzystującym kamerę CCD i impulsowy zielony laser. Przedstawiono przykład monitorowania korowej depresji rozprzestrzeniającej się na podstawie czasu życia fosforescencji barwnika Oxyphor R3. W drugiej demonstracji prezentujemy wysokorozdzielcze dwufotonowe obrazowanie pO2 w mikro naczyniach korowych myszy. Układ eksperymentalny obejmuje zbudowany na zamówienie mikroskop dwufotonowy z laserem femtosekundowym, modulatorem elektrooptycznym i fotopowielaczem z licznikiem fotonów. Przedstawiamy przykład obrazowania heterogeniczności pO2 w mikro naczyniach korowych, w tym w kapilarach, przy użyciu nowego barwnika PtP-C343 o zwiększonym przekroju czynnym wzbudzenia dwufotonowego.

Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiązany artykuł Synteza i kalibracja fosforescencyjnych nanoprobników do obrazowania tlenu w systemach biologicznych.

Protokół

1. Obrazowanie szerokopolowe pO2 w naczyniach krwionośnych kory mózgu szczura

1. Szczury (250 g -350 g) są wstępnie znieczulane izofluranem, a tętnica i żyła udowa są kanulowane w celu monitorowania tętna, ciśnienia tętniczego i gazometrii krwi, a także do infuzji dożylnej. Temperaturę ciała utrzymuje się na poziomie 37 ± 0,1 °C. Wykonuje się tracheotomię, a szczury są wentylowane mieszanką powietrza i tlenu.
2. Próbki krwi do pomiaru gazów krwi pobiera się co 30-45 min, a wentylację i znieczulenie dostosowuje się tak, aby utrzymać gazy krwi w normalnym zakresie fizjologicznym.
3. Do obrazowania przygotowuje się zamknięte okno czaszkowe na kości ciemieniowej o rozmiarze 4 mm x 4 mm. Kość i oponę twardą usuwa się, a okno czaszkowe wypełnia 1,5% agarozy i uszczelnia szkiełkiem podstawnym do mikroskopu. Dodatkowy otwór trepanacyjny o powierzchni 1 mm² na kości czołowej służy do indukcji CSD poprzez wewnątrzkorową mikroiniekcję KCl (~10 μl, 1 M). Należy zachować szczególną ostrożność, aby uniknąć uszkodzenia naczyń korowych. Nadmierne ciepło, nacisk mechaniczny lub krótki okres hipoksji mogą naruszyć barierę krew-mózg i spowodować wyciek barwnika z naczyń do przestrzeni śródmiąższowej.
4. Wokół okna czaszkowego umieszcza się maskę z materiału nieprzezroczystego optycznie. Celem maski jest pochłanianie sygnału fosforescencji pochodzącego z barwnika, który wyciekł do tkanki z krawędzi opony twardej. Barwnik w przestrzeni śródmiąższowej jest źródłem bardzo jasnej fosforescencji, która może zakłócić pomiar. Zwiększona jasność barwnika w przestrzeni śródmiąższowej jest wynikiem gromadzenia się barwnika w środowisku o niskim ciśnieniu tlenu i niskiej szybkości wygaszania. Uszkodzenie naczyń w eksperymencie jest zatem łatwo rozpoznawalne po pojawieniu się jasnych plam fosforescencyjnych, w takim przypadku dane eksperymentalne są odrzucane.
5. Po zakończeniu operacji przerywa się podawanie izofluranu i zmienia znieczulenie na alfachloraloza (bolus dożylny 50 mg/kg, a następnie infuzja 40 mg/(kg h)).
6. Zwierzę zostaje przeniesione na wózku wraz z respiratorem, monitorem ciśnienia krwi i temperatury. Oddychając powietrzem pokojowym, zwierzę jest szybko przenoszone do układu obrazowania i ponownie podłączane do przepływomierza z odpowiednią mieszanką powietrza i tlenu.
7. Rama stereotaktyczna utrzymująca zwierzę jest umieszczana pod obiektywem. Okno czaszkowe jest centrowane w polu widzenia pod obiektywem i ustawiane równolegle do płaszczyzny ogniskowej.
8. Włącza się laser impulsowy i ustawia minimalną energię impulsu. Wiązka optyczna jest kierowana w stronę miernika energii impulsu, a dostarczana do próbki energia impulsu jest dostosowywana tak, aby nie przekraczała 10 mJ/cm². Wiązka jest centrowana na oknie czaszkowym pod kątem padania ok. 60 stopni, a następnie laser jest wyłączany.
9. Pomiary gazów krwi oraz korekty wentylacji i znieczulenia są wykonywane aż do momentu, gdy wszystkie parametry fizjologiczne zwierzęcia znajdą się w normalnym zakresie fizjologicznym.
10. Przy założeniu, że objętość krwi wynosi około 7% masy ciała, odpowiednią ilość sondy fosforescencyjnej Oxyphor R3 rozpuszcza się w 1 mL soli fizjologicznej, aby uzyskać stężenie sondy we krwi wynoszące 4 x 10^-5 M. Roztwór sondy wstrzykuje się do żyły udowej.
11. Przygotowuje się 1 M roztwór chlorku potasu i wstrzykuje ~1 ul za pomocą strzykawki przez otwór trepanacyjny na kości czołowej w celu indukcji CSD.
12. Laser jest włączany, a obrazowanie rozpoczyna się natychmiast po wstrzyknięciu roztworu KCl. Obrazowanie fosforescencji jest przeprowadzane przez ok. 10 min.
13. Wykonuje się kolejny pomiar gazów krwi, aby potwierdzić, że parametry fizjologiczne zwierzęcia nadal znajdują się w normie.
14. Czasy życia fosforescencji dla wszystkich pikseli uzyskuje się poprzez dopasowanie pojedynczego wykładniczego zaniku przy użyciu nieliniowej metody najmniejszych kwadratów z wagowaniem statystycznym w programie Matlab. Czasy życia fosforescencji są przeliczane na wartości pO2 przy użyciu empirycznej zależności typu Sterna-Volmera (patrz niżej).

2. Wysokorozdzielcze obrazowanie pO2 metodą dwufotonową w mikronaczyniach kory mózgowej myszy

1. Myszy znieczula się izofluranem, a tętnicę udową kaniuluje się w celu monitorowania tętna, ciśnienia krwi i gazów krwi, a także do podania barwnika. Temperaturę ciała utrzymuje się na poziomie 37 ± 0.1 °C, a zwierzęta oddychają samoistnie mieszaniną powietrza i tlenu.
2. Okno czaszkowe przygotowuje się zgodnie z techniką opracowaną pierwotnie przez Davida Kleinfelda i Winfrieda Denka. Należy zachować szczególną ostrożność, aby uniknąć uszkodzenia naczyń krwionośnych, co zapobiegnie ewentualnemu wyciekowi barwnika do przestrzeni śródmiąższowej.
3. W trakcie całej procedury przygotowania pobiera się kilka próbek krwi do pomiaru gazów krwi, a wentylację i znieczulenie dostosowuje się tak, aby utrzymać gazy krwi w normalnym zakresie fizjologicznym.
4. Zwierzę przenosi się do układu obrazowania. Zmodyfikowaną ramę stereotaktyczną utrzymującą zwierzę umieszcza się pod obiektywem. Okno czaszkowe centruje się w polu widzenia pod obiektywem Olympus 4X i ustawia równolegle do płaszczyzny ogniskowej.
5. Za pomocą kamery cyfrowej przez okulary wykonuje się zdjęcie okna czaszkowego, a następnie obiektyw 4X zastępuje się obiektywem Olympus 20X (NA = 0.95).
6. Pomiary gazów krwi oraz korekty wentylacji i znieczulenia wykonuje się do momentu, aż wszystkie parametry fizjologiczne zwierzęcia znajdą się w normalnym zakresie fizjologicznym.
7. Zakładając, że objętość krwi wynosi około 7% masy ciała, odpowiednią ilość sondy fosforescencyjnej PtP-C343 rozpuszcza się w 0.2 mL soli fizjologicznej, aby uzyskać stężenie sondy we krwi na poziomie ~15 μM. Roztwór sondy wstrzykuje się przez tętnicę udową.
8. Eksperyment rozpoczyna się od ustawienia pożądanych odstępów czasowych dla wzbudzenia barwnika i zbierania emisji dla każdego piksela.
9. Wykonuje się skan przeglądowy, który jest powolnym dwuwymiarowym skanowaniem rastrowym zaniku intensywności fosforescencji, obrazującym strukturę naczyń krwionośnych na danej głębokości. Obiektyw przesuwa się prostopadle do okna czaszkowego (oś Z) i wykonuje powolne dwuwymiarowe skany przeglądowe intensywności fosforescencji, używając minimalnej mocy lasera przy 840 nm, aby zlokalizować mikro-naczynia w płaszczyźnie obrazowania.
10. Na każdej głębokości obrazowania, na podstawie skanu przeglądowego fosforescencji na tej głębokości, wybiera się zestaw punktów w obrębie naczyń krwionośnych, a rejestrację zaników fosforescencji w każdym punkcie powtarza się dla zdefiniowanej liczby uśrednień.
11. Ustawia się pożądaną liczbę uśrednień, odstęp pomiarowy oraz czas trwania eksperymentu i rozpoczyna pomiar. Pomiary pO₂ są pozyskiwane w wybranych lokalizacjach w określonym odstępie pomiarowym przez cały czas trwania eksperymentu.
12. Podczas pomiarów oprogramowanie przekierowuje laser wzbudzający do wybranych lokalizacji poprzez zmianę pozycji zwierciadeł skanujących galwanometru. Sterowanie skanerami galwanometrycznymi, modulatorem elektrooptycznym i całym pozostałym sprzętem odbywa się za pomocą specjalistycznego oprogramowania w LabView.
13. Czasy życia fosforescencji dla wszystkich wybranych punktów uzyskuje się poprzez dopasowanie pojedynczego zaniku wykładniczego przy użyciu nieliniowej metody najmniejszych kwadratów w programie Matlab. Czasy życia fosforescencji przelicza się na wartości pO2, korzystając z empirycznej zależności typu Sterna-Volmera (vide infra).
14. Po zebraniu danych z różnych głębokości kory, do naczyń krwionośnych wstrzykuje się barwnik fluorescencyjny sprzężony z dekstraną w celu obrazowania struktury mikronaczyniowej.
15. Pozyskuje się stos obrazów strukturalnych naczyń krwionośnych, wykonując dwufotonowe obrazowanie fluorescencji FITC przy użyciu kanału zielonego w detektorze czterokanałowym.
16. Eksperymenty na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi i przepisami ustanowionymi przez Podkomitet ds. Opieki nad Zwierzętami Doświadczalnymi Massachusetts General Hospital.

3. Reprezentatywne wyniki:

Rycina 1. Panel (a) po lewej stronie przedstawia obraz szerokiego pola widzenia ciśnienia tlenu przed nadejściem fali CSD. Panel (b) po prawej stronie przedstawia ewolucję czasową średniego ciśnienia tlenu podczas propagacji CSD w obrębie obszaru zainteresowania zaznaczonego na panelu (a).

Rycina 2 (film avi): Ten film przedstawia ewolucję czasową ciśnienia tlenu w całym oknie czaszkowym podczas propagacji fali CSD. Pasek skali wskazuje ciśnienie tlenu w milimetrach słupa rtęci.

Rysunek 3. Projekcja 3D obrazowanego stosu naczyń krwionośnych. Odcienie szarości reprezentują wolumetryczną maskę naczyń, stworzoną na podstawie obrazu strukturalnego. Zmierzone wartości pO₂ są zakodowane kolorami. Pasek skali wynosi 200 micrometers. Przedrukowano za zgodą Nature Publishing Group.⁷

Dyskusja

Przedstawiliśmy dwa zastosowania pomiaru pO2 w mikrokrążeniu korowym oparta na zależnym od tlenu wygaszaniu fosforescencji. Podczas gdy pierwsza metoda, oparta na obrazowaniu CCD, zapewnia monitorowanie pO2 w szerokim polu widzenia, pomiar ciśnienia parcjalnego tlenu w mikrokrążeniu korowym z wykorzystaniem mikroskopii dwufotonowej zapewnia rozdzielczość kapilarną i umożliwia obrazowanie w głębszych warstwach. Obie metody zapewniają pomiary o wysokiej szybkości i wysokim stosunku sygnału do szumu. Ponadto pomiar pO2 opar...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Glikopirolanu	Odczynnik	American Regent Inc.	NDC 0517-4605-25	Stosowany do kontrolowania wydzieliny gardłowej, tchawiczej i oskrzelowej.
Chlorowodorek lidokainy	Odczynnik	Hospira Inc.	NDC 0409-4277-01	Stosowany jako miejscowe znieczulenie podczas operacji.
Izofluran	Odczynnik	Baxter Internationl Inc.	NDC 10019-360-40	Stosowany jako ogólny anestetyk wziewny podczas operacji oraz jako znieczulenie ogólne podczas eksperymentów z myszami.
Alfa-chloraloza	Odczynnik	Sigma-Aldrich	C0128	Stosowana jako znieczulenie ogólne podczas eksperymentów ze szczurami.
Dekstran – izotiocyjanian fluoresceiny	Odczynnik	Sigma-Aldrich	FD2000S	Podawany w celu uzyskania stężenia ~ 500 nM we krwi.