Technika ta umożliwia zastosowanie wysokorozdzielczej spektroskopii protonowej MR z rotacją pod kątem magicznym (HRMAS 1H-MRS) do charakterystyki molekularnej żywych Drosophila melanogaster przy użyciu konwencjonalnego spektrometru o indukcji 14,1 tesla wyposażonego w sondę HRMAS.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Spektroskopia rezonansu magnetycznego żywych much Drosophila melanogaster z wykorzystaniem wiru pod magicznym kątem
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Spektroskopia rezonansu magnetycznego protonów z wysoką rozdzielczością i magicznym kątem wirowania (HRMAS) (1(H-MRS) jest nową nieinwazyjną techniką, która poprawia szerokość linii widmowych i umożliwia uzyskanie widm o wysokiej rozdzielczości z ekstraktów, nienaruszonych komórek, kultur komórkowych, a co najważniejsze, z nienaruszonej tkanki, w celu badania zależności między metabolitami a procesami komórkowymi.In vivoHRMAS1Badania z wykorzystaniem H-MRS nie zostały jeszcze zgłoszone w przypadku żywej muszki owocówkiDrosophila melanogaster. Drosophila,jako prostszy organizm genetyczny, pozwala na badanie wielu funkcji biologicznych i różnych ewolucyjnie zachowanych szlaków sygnalizacyjnych na poziomie całego organizmu, stanowiąc przydatny model do badań nad genetyką i fizjologią. W tym celu opracowaliśmy i wdrożyliśmyin vivoHRMAS1Metoda H-MRS do badania żywych tkanekDrosophila przy 14,1 T. W niniejszej pracy przedstawiamy HRMAS1Protokół H-MRS do charakterystyki molekularnejDrosophilaza pomocą konwencjonalnego spektrometru MR wyposażonego w sondę HRMAS. Ta technika jest nowatorską,in vivo,nieniszczącyDrosophilapodejście do pomiaru metabolitów, które umożliwia identyfikację biomarkerów chorób, a tym samym może przyczynić się do opracowania nowych metod terapeutycznych.
Protokół
Część 1: Przygotowanie Drosophila do pomiarów HRMAS
- Stosując standardowe procedury laboratoryjne dla muszek 1, zbieraj nowo wyklute osobniki przez 3 dni i przenieś je do probówek z新鮮ną pożywką. Inkubuj zebrane muszki przez 5 dni, aby w momencie rozpoczęcia eksperymentu miały od 5 do 8 dni. Do eksperymentów wykorzystuje się tylko jedną płeć (zazwyczaj samce).
- Użyj zdrowych, nienaruszonych muszek typu dzikiego w celu porównania ich z osobnikami poddanymi działaniu czynników zewnętrznych, np. utraumizowanymi lub zmodyfikowanymi genetycznie 1.
- Na 24 godziny przed eksperymentem umieść pojedyncze muszki w probówkach o pojemności 2 ml zawierających fragment (~0,2 ml) pożywki. W zakrętce probówek należy wykonać otwór za pomocą rozgrzanej nad ogniem igły insulinowej.
- Zważ probówki bezpośrednio przed i po umieszczeniu w nich muszki za pomocą wagi precyzyjnej, a wagę każdej muszki wyznacz poprzez odjęcie pierwszej wartości od drugiej. Pojedynczy samiec waży zazwyczaj 0,7-1 mg.
Część 2: Przygotowanie rotora HRMAS.
- Umieść pojedynczą probówkę na lodzie na mniej niż minutę, aby znieczulić znajdującą się w niej muchę.
- Połóż muchę na warstwie folii aluminiowej umieszczonej na lodzie i delikatnie wsuń ją do półkolistego wgłębienia wkładki rotora NMR za pomocą miękkiego pędzla, aby zapewnić całkowite wprowadzenie muchy, unikając jednocześnie jej zranienia.
- Umieść wkładkę w rotorowej probówce z tlenku cyrkonu (ZrO2) (średnica 4 mm, 50 μl), aby zlokalizować muchy pomiędzy wkładką rotora a dnem rotora (patrz rycina 1).
- Zamknij wkładkę za pomocą śruby i zabezpiecz ją parafilmem (patrz rycina 1), aby zapobiec kontaktowi muchy z roztworem wzorca TSP (TSP: kwas trimetylosililopropionowy-2,2,3,3-d4, Mw = 172, δ = 0.00 ppm, 50 mM w wodzie deuterowanej D2O, który służy jako odniesienie zarówno dla przesunięcia chemicznego rezonansu, jak i dla ilościowego oznaczenia).
- Dodaj 8 μl roztworu wzorca TSP na górę wkładki rotora (patrz rycina 1).
- Zabezpiecz i dokręć cały zestaw w rotorach za pomocą górnej zakrętki (patrz rycina 1).
Część 3: Pozyskiwanie danych HRMAS
- Wprowadź rotor do sondy HRMAS i ustaw go pod kątem magicznym 54,7° (patrz rycina 1).
- Ustaw temperaturę na 4°C za pomocą jednostki BTO-2000 w połączeniu z pneumatyczną jednostką MAS. Muchy są utrzymywane w temperaturze 4°C podczas przebywania w spektrometrze w celu utrzymania anestezji.
- Ustaw szybkość wirowania dla HRMAS 1H MRS na 2 kHz MAS.
- Stabilizuj częstotliwość rotacji MAS na poziomie 2,0 ± 0,001 kHz za pomocą kontrolera prędkości MAS (Częstotliwość rotacji).
- W ramach przygotowania magnesu: przeprowadź strojenie i dopasowanie cewki dla uzyskania optymalnej wydajności oraz shimowanie magnesu w celu uzyskania optymalnej jakości widm.
- Nabyj jednowymiarowe widma 1H, stosując zsynchronizowaną z rotorem sekwencję impulsów echa spinowego Carr-Purcell-Meiboom-Gill (CPMG) 2, [90°-(τ-180°- τ)n-akwizycja], która działa jako filtr T2 w celu usunięcia poszerzenia widmowego z jednowymiarowych widm 1H NMR pojedynczych much w celu pozyskania danych jednowymiarowych dla wszystkich próbek. Zsynchronizuj opóźnienie międzyimpulsowe (τ = 500μs) z częstotliwością rotacji MAS (2 kHz). Ustaw liczbę uśrednień na 256 z 32 768 (32k) punktami danych. Czas akwizycji: 9 min.
- Nabyj dwuwymiarowe (2D) widma 1H-1H HRMAS NMR pojedynczych much dla wszystkich próbek, stosując sekwencję TOBSY z impulsami adiabatycznymi 3. Parametry akwizycji to: 2k punktów danych w wymiarze bezpośrednim (szerokość widmowa 11 ppm), 1 s presaturacji wody podczas opóźnienia relaksacyjnego, 8 skanów na przyrost, 128 przyrostów, całkowity czas repetycji 2 s, czas mieszania 45 ms oraz całkowity czas akwizycji 29 min.
Część 4: Przetwarzanie i analiza danych
- Przeanalizuj widma MR próbek przy użyciu oprogramowania MestReC (Mestrelab Research, www.mestrec.com)
- Zastosuj funkcję apodyzacji poszerzającą linie o 0,5 Hz do wszystkich sygnałów FID 1H HRMAS przed przeprowadzeniem transformaty Fouriera.
- Odnieś widma MR do TSP przy δ = 0,0 ppm (standard zewnętrzny).
- Wykonaj manualną korekcję fazy widm i zastosuj estymator linii bazowej Whittakera, aby odjąć szerokie komponenty linii bazowej przed obliczeniem pól powierzchni pików.
- Oszacuj pola powierzchni pików za pomocą oprogramowania MestReC. Przeskaluj wysokości pików względem TSP dla każdego pozyskanego widma (wysokość piku TSP = 1). Użyj testów t (dwustronnych, p<0,05), aby porównać stosunki wewnątrzgrupowy i międzygrupowe.
- Parametry przetwarzania 2D TOBSY to: funkcja okna QSINE = 2 w obu wymiarach, FT z 2k punktami w wymiarze bezpośrednim i dopełnienie zerami do 1k w drugim wymiarze, korekcja fazy w obu wymiarach oraz korekcja linii bazowej w drugim wymiarze.
- Wygeneruj widma 2D przy użyciu programu Sparky (T. D. Goddard i D. G. Kneller, SPARKY 3, USCF, http://www.cgl.ucsf.edu/home/sparky/)
Część 5: Reprezentatywne widma z żywych much Drosophila melanogaster
Opisane powyżej procedury pozwalają na gromadzenie powtarzalnych widm z żywych much Drosophila melanogaster. Ryciny 2 i 3 przedstawiają reprezentatywne widma MR uzyskane od much typu dzikiego (wt) Oregon-R. Rycina 2 prezentuje widma 1D 1H HRMAS CPMG. Główne składniki lipidowe [CH3 (0.89 ppm), (CH2)n (1.33 ppm), CH2C-CO (1.58ppm), CH2C=C (2.02 ppm), CH2C=O (2.24 ppm), CH=CH (5.33 ppm)], glicerol (1,3-CH 4.10 ppm i 4.30 ppm; 2-CH2 5.24 ppm) oraz małe metabolity: β-alanina (β-Ala, 2.57 ppm), octan (Ac, 1.97 ppm), fosfocholina (PC, 3.22 ppm) i fosfoetanolamina (PE, 3.23ppm) zostały wykryte i przypisane zgodnie z wcześniejszymi doniesieniami 4, 5. Sygnały przy 2.02 ppm przypisano protonom metylenowym fragmentu CH2-CH=CH jednonienasyconych kwasów tłuszczowych (np. palmitoleinowego). Kwasy nienasycone zidentyfikowano na podstawie sygnału przy 5.33 ppm generowanego przez protony fragmentu -CH=CH-. Małe metabolity, których nie udało się przypisać lub które nie były widoczne na widmie 1D, wykryto za pomocą 2D 1H-1H TOBSY HRMAS (patrz rycina 3).
Rycina 1. Układ doświadczalny dla in vivo HRMAS 1H MRS do badania żywych Muszka owocówka przy 14,1 T. Zewnętrzny wzorzec kwasu trimetylosililo-propionowego-2,2,3,3-d4 w wodzie deuterowanej (TSP/D2O)2O). W kwadracie: pozycja rotora pod kątem magicznym w sondzie HRMAS.
Rysunek 2. Widma 1D HRMAS 1H CPMG in vivo żywej muchy Drosophila melanogaster wt. Składniki lipidowe: CH3 (0.89 ppm), (CH2)n (1.33 ppm), CH2C-CO (1.58ppm), octan (Ac), CH2C=C (2.02 ppm), CH2C=O (2.24 ppm), β-alanina (β-Ala), fosfocholina (PC) i fosfoetanolamina (PE), glicerol (1,3-CH 4.10, 4.30 ppm; 2-CH2 5.22 ppm), CH=CH (5.33 ppm).
Rysunek 3. Widmo In vivo 2D 1H-1H TOBSY HRMAS żywej muchy Drosophila melanogaster wt przy 14,1 T. Zidentyfikowano małe metabolity i komponenty lipidowe. Metabolity: alanina (Ala), β-alanina (β-Ala), arginina (Arg), glutamina (Gln), glutaminian (Glu), fosfocholina (PC), fosfoetanolamina (PE), tauryna (Tau), α-glukoza (α-Glc) i glicerol. Komponenty lipidowe: CH3 (0,89 ppm), (CH2)n (1,33 ppm), CH2C-CO (1,58 ppm), CH2C=C (2,02 ppm), CH2C=O (2,24 ppm), CH=CH (5,33 ppm).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Z wyjątkiem niedawnego doniesienia o możliwości przeprowadzenia obrazowania MRI in vivo u muszek owocowych 6, badania MRS in vivo u Drosophila nie zostały jeszcze opisane. W niniejszym protokole opisujemy wdrożenie nowej metody in vivo HRMAS 1H-MRS do wykrywania biologicznie istotnych cząsteczek. W szczególności wykryliśmy lipidy i małe metabolity u żywych muszek Drosophila przy polu 14,1 T w czasie około 45 min, co zapewnia odpowiedni czas akwizycji, prz...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Doświadczenia na zwierzętach przeprowadzono zgodnie z wytycznymi i regulacjami ustalonymi przez Institutional Animal Research Review Board Committee Massachusetts General Hospital.
Podziękowania
Niniejsza praca była częściowo finansowana z grantu National Institutes of Health (NIH) AI063433 przyznanego Laurence G. Rahme, grantu National Institute Institutes of Health (NIH) Center Grant (P50GM021700) przyznanego Ronald G. Tompkins (A. Aria Tzika, dyrektor rdzenia NMR) oraz grantu badawczego Shriner's Hospital for Children (#8893) przyznanego A. Aria Tzika. Dziękujemy dr. Dionyssiosowi Mintzopoulosowi za pomoc w początkowych fazach opracowywania tego protokołu oraz dr. Ovidiu C. Andronesiemu za pomoc w zakresie sekwencji impulsów TOBSY.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze | |
|---|---|---|---|---|
| Tlenek deuteru | Odczynnik | Sigma-Aldrich | 7789-20-0 | |
| 3-(trimetylosilyl)propionian-2,2,3,3-d4 kwas | Odczynniki | Sigma-Aldrich | 24493-21-8 | |
| agar, sacharoza, drożdże, mąka kukurydziana | Pożywka | Genesee Scientific | http://www.flystuff.com/ | |
| Muchy szczepów Oregon RS lub Canton-S | Linie dorosłych much | Bloomington Stock Center | http://flystocks.bio.indiana.edu/ | |
| Pędzel | Sprzęt | (rozmiar 0) | ||
| probówki 2 ml | Sprzęt | Fisher Scientific | K749521-1590 | |
| Inkubatory dla much | Wyposażenie | wysoka wilgotność względna (60–75%), regulowana temperatura oraz 12-godzinny cykl światła i ciemności (12 h:12 h). | ||
| Spektrometr NMR Bruker Bio-Spin Avance (600,13 MHz) z sondą 4 mm do potrójnego rezonansu (1H, 13C, 2H) sonda HRMAS | Sprzęt | Bruker Corporation | ||
| urządzenie BTO-2000 w połączeniu z pneumatyczną jednostką MAS | Sprzęt | Bruker Corporation | ||
| rotor z tlenku cyrkonu 4 mm (pojemność 50 µl) | Sprzęt | Bruker Corporation | B3829 (sklep Bruker) | |
| MestReC (Mestrelab Research) | Oprogramowanie | Analiza jednowymiarowych widm NMR http://mestrelab.com/ | ||
| SPARKY 3, USCF | Oprogramowanie | Analiza widm 2D NMR http://www.cgl.ucsf.edu/home/sparky/ |
Bibliografia
- Apidianakis, Y., Rahme, L. G. Drosophila melanogaster as a model host for studying Pseudomonas aeruginosa infection. Nat Protoc. 4, 1285-1294 (2009).
- Meiboom, S., Gill, D. Modified spin-echo method for measuring nuclear relaxation time. Rev Sci Instrum. 29, 688-691 (1958).
- Andronesi, O. C., Mintzopoulos, D., Struppe, J., Black, P. M., Tzika, A. A. Solid-state NMR adiabatic TOBSY sequences provide enhanced sensitivity for multidimensional high-resolution magic-angle-spinning 1H MR spectroscopy. J Magn Reson. 193, 251-258 (2008).
- Astrakas, L. G. Proton NMR spectroscopy shows lipids accumulate in skeletal muscle in response to burn trauma-induced apoptosis. Faseb J. 19, 1431-1440 (2005).
- Fan, T. W. M. Metabolite profiling by one- and two dimensional NMR analysis of complex mixtures. Prog Nuc Magn Reson Spec. 28, 161-219 (1996).
- Null, B., Liu, C. W., Hedehus, M., Conolly, S., Davis, R. W. High-resolution, in vivo magnetic resonance imaging of Drosophila at 18.8 Tesla. PLoS One. 3, e2817-e2817 (2008).
- Zektzer, A. S. Improved signal to noise in high-resolution magic angle spinning total correlation spectroscopy studies of prostate tissues using rotor-synchronized adiabatic pulses. Magn Reson Med. 53, 41-48 (2005).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
