Zewnątrzkomórkowe pułapki neutrofilowe (NETs) stanowią istotny mechanizm odporności wrodzonej służący do zwalczania patogennych bakterii, grzybów i pasożytów. W niniejszym opracowaniu opisujemy metody izolacji granulocytów neutrofilowych z krwi ludzkiej oraz ich aktywacji w celu tworzenia NETs. Przedstawiamy techniki przygotowania próbek umożliwiające wizualizację NETs w mikroskopii świetlnej i elektronowej.
Artykuł metodologiczny
Zewnątrzkomórkowe pułapki neutrofilowe: Jak je generować i wizualizować
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Granulocyty neutrofilowe stanowią najliczniejszą grupę leukocytów we krwi obwodowej. Jako wyspecjalizowane fagocyty, pochłaniają one bakterie i zabijają je wewnątrzkomórkowo, gdy ich ziarnistości przeciwdrobnoustrojowe łączą się z fagosomem. Odkryliśmy, że neutrofile posiadają dodatkowy sposób zwalczania drobnoustrojów: po aktywacji uwalniają one białka ziarnistości oraz chromatynę, które razem tworzą pozakomórkowe włókna wiążące patogeny. Te nowe struktury, zwane pozakomórkowymi pułapkami neutrofilowymi (NETs), degradują czynniki wirulencji i zabijają bakterie1, grzyby2 oraz pasożyty3. Szkieletem strukturalnym NETs jest DNA, które ulega szybkiemu rozkładowi w obecności nukleaz DNaz. W związku z tym bakterie wykazujące ekspresję DNaz są bardziej wirulentne4. Wykorzystując mikroskopię korelacyjną łączącą TEM, SEM, immunofluorescencję oraz techniki obrazowania żywych komórek, wykazaliśmy, że po stymulacji jądra neutrofili tracą swój kształt, a euchromatyna i heterochromatyna ulegają homogenizacji. Następnie ulega rozpadowi otoczka jądrowa oraz błony ziarnistości, co umożliwia mieszanie się komponentów NET. Ostatecznie NETs są uwalniane w momencie pęknięcia błony komórkowej. Ten program śmierci komórkowej (NETosis) różni się od apoptozy i nekrozy i zależy od generowania reaktywnych form tlenu przez oksydazę NADPH5.
Zewnątrzkomórkowe pułapki neutrofili występują w dużych ilościach w miejscach ostrego stanu zapalnego. NETs wydają się być formą wrodzonej odpowiedzi immunologicznej, która wiąże mikroorganizmy, zapobiega ich rozprzestrzenianiu się i zapewnia wysokie miejscowe stężenie czynników przeciwdrobnoustrojowych w celu degradacji czynników wirulencji i zabijania patogenów, co pozwala neutrofilom na pełnienie ich funkcji przeciwdrobnoustrojowej nawet po zakończeniu ich cyklu życiowego. Istnieją jednak coraz liczniejsze dowody na to, że NETs są również zaangażowane w choroby obejmujące spektrum od zespołów autoimmunologicznych po niepłodność6.
Opisujemy metody izolacji granulocytów neutrofilnych z obwodowej krwi ludzkiej7 oraz ich stymulacji do tworzenia NETs. Przedstawiamy również protokoły wizualizacji NETs za pomocą mikroskopii świetlnej i elektronowej.
Protokół
1. Izolacja PMN z ludzkiej krwi
Należy użyć około 24 ml krwi ludzkiej z EDTA lub heparyną (10 U/ml) jako antykoagulantem.
- Do probówki typu Falcon o pojemności 15 ml dodać 6 ml Histopaque 1119, a następnie ostrożnie nanieść na wierzch od 5 do 7 ml krwi pełnej.
- Wirować przez 20 minut przy 800 x g bez hamowania.
- Odssać i odrzucić żółtawą i przezroczystą górną warstwę, a dolną czerwonawą fazę zawierającą granulocyty przenieść do nowych probówek typu Falcon.
- Przemyć komórki, dopełniając probówki typu Falcon buforem PBS, i wirować przez 10 minut przy 300 x g.
- W tym czasie przygotować 100% roztwór Percoll, mieszając 18 ml Percoll z 2 ml 10x PBS. Za pomocą 1x PBS przygotować roztwory o stężeniach 85%, 80%, 75%, 70% i 65% Percoll w objętości 4 ml każdy.
- Przygotować 2 probówki typu Falcon z gradientem Percoll, nakładając warstwami po 2 ml każdego stężenia w kolejności malejącej.
- Po wirowaniu usunąć nadsącz, połączyć osady i resuspender osadzone komórki w 4 ml PBS.
- Ostrożnie nanieść 2 ml resuspensji na każdy z gradientów.
- Wirować przez 20 minut przy 800 x g bez hamowania.
- Po wirowaniu usunąć górną warstwę oraz większość warstwy 65% z PBMC, a pozostałe białe interfazy aż do warstwy 85% zebrać do nowych probówek typu Falcon.
- Przemyć komórki, dopełniając probówki typu Falcon buforem PBS, i wirować przez 10 minut przy 300 x g.
- Usunąć nadsącz i resuspender osadzone komórki (zazwyczaj >95% to PMN) w 2 ml PBS.
- Policzyć komórki przy użyciu komory licznikowej.
2. Aktywacja PMN
- Przygotować 24-dołkową płytkę do hodowli komórek, umieszczając w każdym dołku sterylną, okrągłą szklaną lamellkę o średnicy 13 mm (# 1,5)
- Wysiać 2 x 105 komórek w 500μl pożywki RPMI (zawierającej 2 % ludzką albuminę surowiczą) na dołek i inkubować przez 1h w inkubatorze CO2 w temperaturze 37°C.
- W tym czasie przygotować 600 nM roztwór PMA w RPMI i dodać do komórek 100μl na dołek. Inkubować od 15 min do 4 h w inkubatorze CO2 w temperaturze 37°C.
- Utrwalić komórki w 4% (stężenie końcowe) paraformaldehydzie rozpuszczonym w PBS.
PMA służy jako kontrola pozytywna i jest do tej pory najsilniejszym czynnikiem indukującym powstawanie NET. Alternatywnie, do indukcji NET można zastosować inne bodźce lub kokultywację z patogenami.
Odpowiedni stan formowania NET można sprawdzać w trakcie przebiegu procesu czasowego, jeśli przygotowano dodatkowe próbki równoległe. Po dodaniu do niefiksowanych komórek nieprzenikalnego barwnika DNA, takiego jak Sytox Green (Invitrogen), wykryte zostanie wyłącznie DNA zewnątrzkomórkowe. Ponieważ formowanie nowych NET jest w pewnym stopniu upośledzone w obecności Sytoxu, dla każdego punktu czasowego należy wykorzystać jedną próbkę równoległą.
3. Detekcja NET za pomocą immunoznakowania
NETy są bardzo kruche nawet po utrwaleniu i należy nimi manipulować z dużą ostrożnością, w przeciwnym razie większość z nich zostanie utracona podczas przygotowania.
- Ostrożnie usuń szkiełka nakrywkowe z przytwierdzonymi komórkami z 24-dołkowej płytki hodowlanej, podnosząc je krawędzią za pomocą zakrzywionej igły i chwytając precyzyjną pęsetą. Połóż szkiełko nakrywkowe stroną odwróconą do góry na kropli PBS. Można to wykonać na arkuszu Parafilmu pokrywającym statyw do probówek. W ten sposób płucz 3 razy przez 5 min.
- Inkubuj szkiełka nakrywkowe w ten sam sposób w kropli 0,5% Triton X-100 przez 1 min w RT w celu permeabilizacji komórek. Płucz 3 razy w PBS przez 1 min.
- Przygotuj komorę wilgotną z Parafilmu i wilgotnej chusteczki. Połóż szkiełka nakrywkowe stroną odwróconą do góry na kropli buforu blokującego (5% surowicy osła) i inkubuj przez 30 min w 37°C.
- Rozcieńcz przeciwciała pierwszorzędowe, np. ms anti Histon oraz rb anti Neutrophil Elastase, w buforze blokującym.
- Przenieś szkiełka nakrywkowe w komorze wilgotnej bezpośrednio z buforu blokującego na kroplę przeciwciała pierwszorzędowego i inkubuj przez 1 h w 37°C.
- Płucz 3 razy przez 5 min w PBS.
- Rozcieńcz przeciwciała drugorzędowe, np. dk anti ms Cy2 oraz dk anti rb Cy3, w buforze blokującym.
- Przenieś szkiełka nakrywkowe w komorze wilgotnej na kroplę przeciwciała drugorzędowego i inkubuj przez 1 h w 37°C.
- Płucz 3 razy przez 5 min w PBS. W zależności od dostępnych opcji mikroskopii fluorescencyjnej, barw DNA przez 5 min za pomocą Hoechst 33342 (1 μg/ml), który wymaga wzbudzenia UV, lub Draq5 do wzbudzenia daleką czerwienią, a następnie płucz dwukrotnie wodą destylowaną.
- Nanieś kroplę 20 μl Mowiolu na szkiełko przedmiotowe i zamocuj szkiełka nakrywkowe z komórkami stroną odwróconą do góry. Komórki muszą znajdować się pomiędzy szkiełkiem nakrywkowym a przedmiotowym. Kropla Mowiolu utworzy cienką warstwę o jednorodnej grubości po ułożeniu szkiełka nakrywkowego na kropli. Zazwyczaj nie ma potrzeby dociskania próbki. W przypadku korzystania z obiektywów nieimmersyjnych preparat jest gotowy do badania. Do analizy mikroskopowej z użyciem obiektywów immersyjnych pozostaw preparat do wyschnięcia na około 1 godzinę, aż Mowiol stwardnieje na krawędzi próbki.
4. Przygotowanie NETs do skaningowej mikroskopii elektronowej (SEM)
- Następnie utrwal komórki na szkiełkach podstawowych w płytce 24-dołkowej przy użyciu 2,5 % glutaraldehydu.
- Wyjmij szkiełka z komórkami z 24-dołkowej płytki hodowlanej i połóż je stroną z materiałem do dołu na kropli wody. W ten sposób przemywaj próbki 3 razy po 5 min.
- Przenieś szkiełka z powrotem do 24-dołkowej płytki hodowlanej zawierającej 0,5% OsO4 i inkubuj przez 30 min.
- Wyjmij szkiełka z komórkami z 24-dołkowej płytki hodowlanej i połóż je stroną z materiałem do dołu na kropli wody. W ten sposób przemywaj próbki 3 razy po 5 min.
- Przenieś szkiełka z powrotem do 24-dołkowej płytki hodowlanej zawierającej 1% kwasu taninowego i inkubuj przez 30 min.
- Powtórz kroki od 4.2 do 4.4.
- Odwodnij próbki zgodnie z poniższym schematem (każdy etap po 5 min):
- 30 % etanolu
- 50 % etanolu
- 70 % etanolu
- 80 % etanolu
- 90 % etanolu
- 100% etanolu
- 100% etanolu
- 100% etanolu
- Przenieś szkiełka do suszarki w punkcie krytycznym i wysusz próbki.
- Pokryj powierzchnię preparatu 5nm warstwą platyny/węgla za pomocą naparowarki cienkowarstwowej.
5. Reprezentatywne wyniki:
Metoda izolacji zazwyczaj pozwala na uzyskanie niepobudzonych, żywych neutrofili o czystości przekraczającej 95%. Przy utrwaleniu w różnych punktach czasowych po stymulacji, protokół immunobarwienia ukazuje sekwencję zmian morfologicznych podczas NETozy: spłaszczanie komórek, utratę lobul jądra oraz utratę integralności ziarnistości i jądra, co prowadzi do zwiększającego się nakładania się barwienia jądrowego (tzn. histonów) i ziarnistościowego (tzn. elastazy neutrofilowej). Niniejszy protokół może służyć jako punkt wyjścia do analizy specyficznych oddziaływań patogenów z neutrofilami. Oddziaływania te można przeanalizować bardziej szczegółowo, stosując protokół przygotowania próbek do skaningowej mikroskopii elektronowej.
Fluorescencja NET
Próbka stymulowanych neutrofili zabarwionych na składniki NET (niebieski = DNA, czerwony = histony, zielony = elastaza neutrofilowa). Obrazy przedstawiają, poza lokalizacją NET, lokalizację jądrową DNA i histonów oraz ziarnisty wzór dla elastazy neutrofilowej.
Stymulacja SEM za pomocą PMA
Mikrografia z elektronowego mikroskopu skaningowego przedstawiająca neutrofile niestymulowane i stymulowane PMA. Po stymulacji neutrofile spłaszczają się i wytwarzają NETy.
SEM NETs i Shigella
Obraz SEM o wyższej rozdzielczości przedstawiający bakterie Shigella uwięzione w NETs.
Dyskusja
Przedstawiony protokół umożliwi izolację niepobudzonych neutrofili przy zachowaniu wysokiej czystości, indukcję tworzenia NET oraz analizę zmian morfologicznych podczas procesu NETozy. Przy zachowaniu ostrożności w obchodzeniu się z próbkami, tj. unikaniu agresywnych warunków płukania, które prowadzą do utraty większości słabo związanych NET, możliwe jest porównanie ilości tworzenia NET w różnych warunkach stymulacji (czas trwania, rodzaj bodźca). W tym kontekście dostarczone protokoły mogą służyć jako punkt wyjścia do opracowania metod analizy bardziej złożonych scenariuszy: interakcji neutrofili z patogenami, sekwencji bodźców oraz współdziałania z innymi komórkami odpornościowymi.
Bibliografia
- Brinkmann, V. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303, 1532-1535 Forthcoming.
- Urban, C. F., Reichard, U., Brinkmann, V., Zychlinsky, A. Neutrophil extracellular traps capture and kill Candida albicans yeast and hyphal forms. Cell Microbiol. 8, 668-676 (2006).
- M, E. Leishmania amazonensis promastigotes induce and are killed by neutrophil extracellular traps. PNAS. 106, 6748-6753 (2009).
- Buchanan, J. T., Simpson, A. J., Aziz, R. K., Liu, G. Y., Kristian, S. A., Kotb, M., Feramisco, J., Nizet, V. DNase expression allows the pathogen group A Streptococcus to escape killing in neutrophil extracellular traps. Curr Biol. 14, 396-400 (2006).
- Fuchs, T. A. Novel cell death program leads to neutrophil extracellular traps. J Cell Biol. 176, 231-241 (2007).
- Brinkmann, V., Zychlinsky, A. Beneficial suicide: why neutrophils die to make NETs. Nat Rev Microbiol. 5, 577-582 (2007).
- Aga, E., Katschinski, D. M., van Zandbergen, G., Laufs, H., Hansen, B., Muller, K., Solbach, W., Laskay, T. Inhibition of the spontaneous apoptosis of neutrophil granulocytes by the intracellular parasite Leishmania major. J Immunol. , 169-898 (2002).
Przedruki i uprawnienia
